Name: ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: חקור את הספציפיות של חלבוני ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) באמצעות מערכי פפטידים SPOT. שיטה זו מאפשרת זיהוי חומצות אמינו קריטיות במצעים ומספקת הבנה מקיפה של תפקודים ביולוגיים של PKMTs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG JE 252/7.

<ol><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li>
<li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep%3A+thinking+outside+the+histone+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li>
<li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li>
<li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhosphoSite%3A+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li>
<li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li>
<li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li>
<li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li>
<li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+arrays+on+cellulose+support%3A+SPOT+synthesis%2C+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li>
<li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li>
<li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li>
<li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li>
<li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+application+of+peptide+arrays%3A+quo+vadis+SPOT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+EuropeanJournal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li>
<li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).</li>
<li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li>
<li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7%2F9+protein+lysine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).</li>
<li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).</li>
<li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scansite+2.0%3A+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li>
<li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+%28CDR%29%3A+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li>
<li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+synthesis%3A+observations+and+optimizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Res%22%5BJournal%5D)">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li>
<li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li>
<li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li>
<li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

סינתזת SPOT כפי שמתואר כאן היא שיטה חזקה כדי למפות אתרי אינטראקציה בין חלבונים ולחקור את הכרת המצע של אנזימי פפטיד שינוי. עם זאת, סינתזת SPOT עדיין יש חסרונות מסוימים, משום שלמרות שפפטידים המתאחדים בשיטת SPOT מדווחים יש יותר מ- 90% טוהר 21 זה קשה כדי לאשר בכל מקרה. לכן, תוצאות צריכה להיות מיוצרות בשיטות אחרות לתחומים חלבון למשל באמצעות או עם פפטידים מטוהרים מסונתזים על ידי שיטות סטנדרטית. בנוסף, החסרון העיקרי האחר של מערכי SPOT הוא שרוב הזמן הם לא ניתן לעשות שימוש חוזר ...

בשני העשורים האחרונים, כמה דיווחים הוכיחו את החשיבות של שינויים לאחר translational (PTM) בפיתוח סלולארי וכמה מחלות כמו סרטן, אך לאחרונה מתילציה ליזין חלבון התפתחה אחר PTM חיוני. בעוד מתילציה ליזין תחילה היסטון נמצאה סימן הכרומטין חיוני, עבודה מאוחר יותר הראתה גם מתילציה ליזין של כמה חלבונים לא-היסטון 1-4. ההעברה רציפה של קבוצות מתיל מS-adenosyl-L-מתיונין לקבוצת ε-אמינו של שאריות ליזין היא זרז על ידי משפחה של אנזימים בשם החלבון Methyltransferases ליזין (PKMTs) המכילה יותר מ -60 חלבונים בגנום האנושי. PKMTs תחילה התגלה כאנזימי היסטון שינוי שmethylate שאריות ליזין ספציפיים אך דיווחים מאוחרים יותר הראו שהם יכולים גם methylate חלבונים לא-היסטון 5. עד עכשיו, כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים 6 </sעד&gt;, אך האנזימים אחראים לשינויים אלה לעתים קרובות לא מזוהים. אחת סיבות לכך היא שהספציפיות של רוב PKMTs לא נחקרו בהרחבה. לכן, שוב ושוב מתרחש שמצעי רומן של PKMTs מתגלים. חוסר ידע מפורט של סגוליות המצע של PKMTs מעכב הבנה של התפקוד הביולוגי שלהם והתפקיד. כדי לחקור את הספציפיות של PKMT בפירוט, שיעורי מתילציה של מצעי פפטיד רבים שונות בחומצות אמינו אחת או כמה יש למדוד ולהשוות, אשר באופן אידיאלי מתבצע באמצעות מערכי פפטיד. בהתבסס על הפרופילים ספציפיים וכתוצאה מכך, מצעי פוטנציאל של PKMTs ניתן לזהות שניתן ללמוד עוד. מערכי פפטיד נמצאים בשימוש נרחב בכלים לניתוח ביוכימי של נוגדנים, אנזימי שינוי פפטיד ומיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים (הנוגדנים אנטיגן, קולט ליגנד) 7-9. כמה מאות פפטידים הנדרשים לsucיישומי h. שיטות שונות זמינות עבור סינתזת פפטיד, ביניהם פפטיד סינתזה על שרף מאוד נפוץ, אבל יש לו מגבלות בתפוקה וזה יקר יחסית. בעיות אלה נפתרו עם כניסתה של שיטת סינתזת SPOT על ידי פרנק ועמיתים 10. שיטת סינתזת SPOT מאפשרת סינתזה של כמה מאה פפטידים במקביל ובממוצע זה הוא זול בהשוואה לסינתזת שרף. פפטידים המתאחד על קרום תאית יכולים לשמש באופן ישיר עבור יישומים או פפטידים שונים ניתן ביקעו מהקרום ומשמש כפפטידים חופשיים למבחני פתרון או להכין microarrays פפטיד 10-13. סינתזת SPOT הינה נגזרת של סינתזת פפטיד השלב המוצקה, אשר עושה שימוש בקרום תאית כתמיכה מוצקה ומעסיקה Fmoc-הכימיה סטנדרטית 10-13. לפיכך, הסינתזה של רשתות פפטיד מתחילה בסוף C-מסוף וממשיך לכיווןסוף N-terminal בניגוד לסינתזה הביולוגית בריבוזומים. קרומים תאית הם פונקציונליות לצירופה של חומצות אמינו הופעלו הראשונות (איור. 1). שיטת SPOT מבוססת על האספקה ​​רציפה של חומצות אמינו הופעלו בטיפה של ממס לכתמים מוגדרים על הקרום באמצעות מערכת pipetting אוטומטית. הטיפה של נוזל היא לוותר על הקרום הנקבובי שבו הוא יוצר כתם רטוב מעגלי, אשר מאוחר יותר פועל ככור פתוח לתגובות כימיות בסינתזת פפטיד. גודל הנקודה נקבע על ידי הנפח לוותר ויכולת הקליטה של ​​הקרום, בכפולות של כתמים כגון מסודרות כמו מערכים. הסולם של סינתזה בקורלציה עם גודל הנקודה ואת יכולת הטעינה של הקרום. המרחק בין הכתמים והצפיפות של מערכים מנוהל על ידי שינוי גדלי המקום. יש קרום תאית כמה יתרונות כמו שלב מוצק בסינתזת פפטיד, זה לא יקר, סובלני לchemicals משמש בסינתזת פפטיד, יציב בתמיסות מימיות וקל לטפל. בנוסף, האופי הידרופילי שלה הופך אותו מתאים למספר מערכות assay ביולוגיות. סינתזת SPOT יכולה להתבצע באופן ידני או אוטומטי (ל1000s של פפטידים) בהתאם למספר הנדרש של פפטידים. סינתיסייזר SPOT אוטומטי לחלוטין מIntavis (קלן, גרמניה) משמש ליישומים שלנו. היא מאפשרת סינתזה של פפטידים בכמויות שונות ואורך שונה. פפטידים ליניארי מסונתזים באופן קבוע עם אורך חומצת אמינו 15 עד 20, בפפטידים תוספת של עד 42 חומצות אמינו יכול גם להיות מוכן בסינתזה צעד חכם 14,15. עם זאת, הגדלת מספר חומצות אמינו מובילה לירידה בתשואות הצימוד הכוללות, אשר משפיעה על האיכות של פפטידים. בגלל הכמות הנמוכה של פפטידים למקום, המוצרים לעתים קרובות קשים כדי לטהר ולא ניתן להעריך בקלות את האיכות של פפטידים בודדים. לכן, התוצאות שהתקבלו מpept SPOTמערכי IDE חייבים להיות מאושרים גם עם פפטידים המתאחדים בשיטות סטנדרטי בקנה מידה גדולה יותר, אשר יכול להיות מטוהרת ונותחו על פי סטנדרטים בסינתזת פפטיד או על ידי סינתזת החלבונים המכילים את רצפי הפפטיד הרצויים. ובכל זאת, מצאנו את סינתזת SPOT להיות אמין מאוד ותוצאות בדרך כלל להיות לשחזור. סינתזת SPOT אינה מוגבלת לproteinogenic חומצות אמינו, חומצות אמינו כמה שונה זמינות מסחרי יכול לשמש גם לסינתזה, המאפשרת פפטידים להיות שונה לפני ואחרי המחשוף הסופי של קבוצת הגנת צד שרשרת ו, יתר על כן, הוא גם מאפשר שילוב של חומצות אמינו phosphorylated, מפוגלים או acetylated 11. ספריות פפטיד משותקות המסונתזת על ידי שיטת SPOT ניתן להשתמש ישירות עבור רבים מבחני ביולוגיים וביוכימיים. אנחנו עובדים מערכי פפטיד הכוללים 300-400 פפטידים לחקור את הספציפיות המצע של PKMTs. לmodifi האנזימטיתקטיון, מערכי פפטיד מודגרת עם PKMT המתאים ושכותרתו [methyl- 3 H] -AdoMet במאגר מתאים. מתילציה של המצע המתאים מנותחת על ידי בעקבות ההעברה האנזימטית של קבוצות מתיל שכותרת רדיואקטיבית מAdoMet למצע פפטיד באמצעות autoradiography (איור. 3). על ידי הליך זה, מערכי פפטיד לאפשר המחקר של מתילציה של מצעי פפטיד שונים באותו הזמן. יתרון חשוב של שיטה זו הוא שכל פפטידים מפוגלים בתחרות, כך שבשלב ליניארי של קינטיקה מתילציה, מתילציה היחסית של כל פפטיד היא פרופורציונלית לשיעור הקבוע קטליטי מחולק במתמיד דיסוציאציה (k חתול / K D) של האנזים למצע פפטיד בהתאמה. לפיכך, הסכום של רדיואקטיביות שולב כל נקודה מתואם ישירות עם הפעילות האנזימטית לקראת פפטיד המסוים. שימוש בתוצאותיו של ניסוי מתילציה מערך פפטיד, הפרופיל הספציפי של PKMT יכול להיות מוגדרת ומבוסס על מצעי הרומן הזה יכול להיות מבוסס. מערכי פפטיד לאפשר אימות היעילה המהירה ועלות של מתילציה של מצעי רומן ברמת פפטיד. לשם כך, מערכים מוכנים המכילים את מצעי הרומן חזו יחד עם פפטידים שונה המכילים עלא במקום ליס באתרי היעד, כמו גם פפטידים ביקורת חיוביים ושליליים. לבסוף, ניתן להכין מצעי רומן חלבונים יחד עם מוטציות, שבו היעד ליס משתנה לעלא ומתילציה ניתן לאשר ברמת החלבון. בהתאם לתוצאות, זה לאחר מכן על ידי מחקרים ביולוגיים טיפול תפקידים פוטנציאליים של מתילציה של מצעי החלבון תיארו זה עתה.

<table><tbody><tr><td>אתנול abs כיתה שיפוע HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>דליק</td></tr><tr><td>N, N-דימתילפורממיד סינתזת פפטיד</td><td>ביו-פתור</td><td>4193302</td><td>דליק, רעיל</td></tr><tr><td>פיפרידין ו-ge; 99% עבור סינתזת פפטידים</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>דליק, רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td>אוקסימה טהור (אתיל (הידרוקסימינו) ציאנואצטט)</td> <td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>N,N' -Diisopropylcarbodiimide purum &ge; 98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>דליק, רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td>אצטי אנהידריד</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>דליק, רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td> <td>Aldrich</td><td>233781</td><td>דליק,</td></tr><tr><td>דיכלורמתאן רעיל ו-ge; 99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>מסרטן</td></tr><tr><td>N-מתיל-2-פירולידון</td><td>רוט</td><td>4306.2</td><td></td></tr><tr><td>קרום תאית נגזר</td> רעיל <td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>רעיל, קורוזיבי</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום מימן פחמתי</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td></td></tr><tr><td>כדורי נתרן דודציל סולפט רעילים</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>סינתיסייזר MultiPep רעיל, דליק</td></tr><tr><td></td><td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>n.a.HyperfilmTM</td><td></td></tr> <tr><td>סרט בעל ביצועים גבוהים</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Phoretix</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין methyltransferases שימוש spot פפטיד מערכים

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

מתילציה ליזין היא שינוי לאחר תרגום מתעורר וזה זוהה על חלבונים כמה היסטון ולא-היסטון, שבו היא משחקת תפקידים מכריעים בפיתוח תאים ומחלות רבות. כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים, הנקבעים על ידי כמה עשרות methyltransferases יזין החלבון. הדבר מצביע על כך כל PKMT methylates חלבונים מרובים, אך עד עכשיו רק אחד או שתיים מצעים זוהו במשך כמה אנזימים אלה. הספציפיות מצע מבוססות מערך פפטיד להתקרב בעיה זו, יש לנו הצגתי ניתוחים של PKMTs. מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs כי מתילציה של כמה מצעים עם רצפים שונים, ניתן לבדוק על מערך אחד. אנו מסונתזים מערכי פפטיד על קרום תאית באמצעות סינתיסייזר Intavis SPOT וניתחנו את הספציפיות של PKMTs השונים. בהתבסס על התוצאות, לכמה מאנזימים אלה של רומן,ubstrates יכול להיות מזוהה. לדוגמא, לNSD1 על ידי העסקת מערכי פפטיד, שהראינו כי זה methylates K44 של H4 במקום H4K20 דיווח ובנוסף H1.5K168 הוא המצע המועדף ביותר על H3K36 הידוע קודם לכן. לפיכך, מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין ביוכימית PKMTs.

מערכי פפטיד שמשו בהצלחה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs ביוכימית, וכמה מצעי היסטון רומן ולא-היסטון של PKMT זוהו על ידי גישה זו 5,16-19. הגדרת ספקטרום המצע הנכון של PKMT (או כל אנזים) היא צעד חיוני לקראת הבנה של המנגנון המולקולרי שלו ותפקודים תאיים. כדוגמא ליישום שיטת מתילציה מערך SPOT פפטיד, אנו מתארים את תוצאות הניתוח הספציפי של NSD1 PKMT 19. קודם לעבודה שלנו, אנזים זה תואר לכמה מצעי methy...

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את הספציפיות של הסובסטרט של חלבון ליזין מתיל טרנספראזות או PK mts. זה מושג על ידי זיהוי מצע ראשוני והכנת מערכי פפטידים עם מספר גרסאות של מצע זה המכילים חילופי חומצות אמינו בודדות במיקומים שונים. כשלב שני, מערך הפפטידים מודגר עם ה-PKMT בנוכחות תורם קבוצת מתיל רדיואקטיבי, המאפשר זיהוי מתילציה של פפטיד על ידי העברת רדיואקטיביות לנקודת הפפטיד המתאימה.לאחר מכן, המערך נחשף לסרט רנטגן ומנותח כמותית על מנת לקבוע את פעילות המתילציה בכל אחד מהפפטידים. וכדי להגדיר את פרופיל הספציפיות של ה-PKMT, התוצאות מראות אילו חומצות אמינו בפפטיד הסובסטרט הן קריטיות למתילציה שלו על ידי ה-PKMT. היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות קיימות כמו מתילציה של פפטידים בודדים הוא שניתן לבדוק מספר פפטידים שונים בניסוי אחד בצורה חסכונית.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום מתילציה של חלבון ליים, כגון מפרט של מצעים חדשים שלא היו ידועים בעבר של PK mtss. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הספציפיות של PK mts. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חלבון קינאזות, שיטת חלבון אחרת, טרנספראזות, או להוסיף לטרנספראזות.הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר התוודעתי לאפשרות להכין מערכי פפטידים גדולים בהתאמה אישית בעלויות סבירות באמצעות סינתזת נקודות פפטיד כדי להתחיל בהליך זה, תכנן רצפי פפטידים לסינתזה באמצעות תוכנת multi pep spotter. הזן את רצפי הפפטידים כקוד אות בודדת כאשר כל אות מגדירה את חומצת האמינו הספציפית לאחר התנפחות מוקדמת זו, קרום הנקודה הפונקציונלי של אמינו peg בסוף, סוף דימתילפורממיד או DMF למשך 10 דקות. בסיום, הנח את הממברנה הרטובה על מסגרת הסינתיסייזר הנקודתית ללא בועות אוויר או קמטים.יבש את הממברנה לחלוטין למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת תוכנית הסינתזה. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם 100% אתנול כדי ליצור את קשר האמיד עם קבוצת האמינו החופשית על הממברנה. הפעל את קבוצת הקרבוקסי של חומצת האמינו הנכנסת על ידי הוספת DIC ואתיל הידרוקסי אמינו סינו אצטט לנגזרת חומצת האמינו.לאחר ההפעלה, אתר את הנפחים הרצויים של חומצות אמינו מופעלות על הממברנה המתפקדת של Amino peg באמצעות הרובוט הניתן לתכנות. חזור על השלב הקודם שלוש פעמים כדי להבטיח צימוד טוב יותר של חומצת האמינו המופעלת הראשונה. לאחר דגירה של הממברנה למשך 20 דקות, שטפו אותה עם DMF כדי להסיר חומצות אמינו לא מחוברות לאחר ייבוש וחסימת קבוצות האמינו החופשיות.שטפו את הממברנה עם DMF ארבע פעמים ולאחר מכן דגרו עם 20% פיפרין ב-DMF למשך 20 דקות כדי להסיר את קבוצת ההגנה FM. לאחר שטיפה וייבוש הממברנה, חזור על שלבי האיתור והסרת F MOC עד להשגת אורך הפפטיד הרצוי. לאחר ההגנה האחרונה של F MOC קבוצה D, שטפו את הממברנה עם DMF ו-100% אתנול.לאחר מכן טפל בממברנה עם 0.02% ברום פנול כחול ב-DMF למשך חמש דקות לפחות עד שהיא הופכת לכחולה לחלוטין. לאחר שטיפה וייבוש הממברנה, הוציאו אותה מהסינתיסייזר והניחו אותה בקופסה עמידה בפני כימיקלים. טפל בו עם 20 עד 25 מיליליטר של תערובת הגנה של שרשרת צד D, המורכבת מחומצה טריכלורואצטית של 95% כדי לבקע את קבוצות ההגנה על שרשרת הצד וריאגנטים לנבלות כדי להגן על שרשראות הצד של חומצות האמינו מפני שינוי.לאחר שווידאתם שתערובת ההגנה העמוקה מכסה את הממברנה, סגרו לחלוטין את הקופסה ודגרו עליה למשך שעה עד שעתיים תוך ניעור עדין לאחר הדגירה. שטפו את הממברנה שש פעמים עם 20 עד 25 מיליליטר של די כלורו מתאן למשך שתי דקות כל אחת. לאחר שטיפה פעמיים עם 100% אתנול, יש לייבש את הממברנה בייבוש למשך הלילה.לאחר מכן, דגרו מראש את קרום מערך הפפטידים בשקית ניילון אטומה המכילה את מאגר המתילציה המתאים ללא אנזים ואמט עם קבוצת מתיל עם תווית רדיואקטיבית למשך 10 דקות, השליכו את המאגר לפני הדגירה ודגרו את הממברנה בשמונה מיליליטר של מאגר מתילציה המכיל את ה-PKMT המתאים למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, השליכו את מאגר המתילציה למיכל פסולת רדיואקטיבית ושטפו את מערכי הפפטידים חמש פעמים עם 20 מיליליטר של מאגר המכיל 100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט, ו-1% STS למשך חמש דקות כדי להסיר את החלבון הקשור לאחר השלכת מאגר הכביסה האחרון במיכל הפסולת הרדיואקטיבית, דגרו את הממברנה למשך חמש דקות בתמיסת הגבר של 10 מיליליטר.לאחר מכן השליכו את תמיסת ההגברה במיכל הפסולת הרדיואקטיבית לממיסים אורגניים. אטמו את מערך הפפטידים בשקית ניילון והכניסו אותו לקלטת רדיוגרפיה אוטומטית. הנח את סרט הרדיוגרפיה האוטומטית על הפפטיד בחדר חשוך.לאחר מכן סגור את הקסטה בזהירות. לאחר חשיפת הסרט במינוס 80 מעלות צלזיוס, יש לפתח אותו כדי לנתח את התוצאות. לבסוף, צלם את התמונה כמה פעמים עם זמני חשיפה שונים כדי למנוע רוויה של מצעי פפטיד שעברו מתילציה חזקה.דוגמה לתגובת מתילציה של מערך פפטידים עם NSD מוצגת כאן. הציר האופקי מייצג את רצף הפפטיד ובכיוון האנכי. חומצת האמינו שהשתנתה מסומנת מתילציה עם nsd, אחד מראה שהיא פועלת באופן ספציפי על H 3 K 36 ומזהה שלוש עד ארבע שאריות חומצות אמינו משני צידי איחוד הליזין המטרה של שלושת ניסויי מערך הפפטידים של NSD אחד מוצג כאן.כ-85% מהפפטידים מראים סטיות תקן קטנות מפלוס או מינוס 20% ויותר מ-97% מהפפטידים מדגימים סטיות תקן קטנות מפלוס או מינוס 30%נתוני גורם ההבחנה המחושבים מראים כי NSD אחד מעדיף שאריות ארומטיות במיקום מינוס שתיים. באתרים מינוס אחד ופלוס שניים, הוא מעדיף שאריות אטיות הידרופוביות. ובאתר פלוס אחד, יש העדפה לארגינין, ליזין, גלוטמין או אספרגין.ניתן למצוא מצעי פפטידים חדשים פוטנציאליים על ידי חיפושים במאגרי נתונים של הפרוטאום האנושי. מתילציה חזקה של חלק מהפפטידים הללו עם כמה מאשרים את זהותם כמצעי פפטיד אחד חדשים של NSD. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במצע הראשוני המתאים ביותר בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מתילציה של החלבונים המקבילים במבחנה ובתאים על מנת לברר אם חלבונים מתקבלים כמצעים, גם לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מזילציה של חלבון ליזין, להגדיר את ספציפיות הסובסטרט של PK mts רבים ולזהות מספר מצעים חדשים. זה עזר להבין את התפקוד הביולוגי החשוב של PK mts.אל תשכח שניתן לטעון לעבודה עם רדיואקטיביות וממיסים אורגניים בסינתזה של פפטידים, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים בעת ביצוע הליך זה.

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

סרטון זה מדגים טכניקה המיישמת טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי כדי לאפיין את הספציפיות של נוגדנים המזהים שינויים לאחר תרגום (PTM) על פפטידי היסטון. שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים מצומדים פלואורופורים משותקים עם שילובי PTM ידועים מטופלת בנוגדנים ספציפיים ל-PTM מטרה. תהליך זה מסייע לזהות את הספציפיות של הנוגדן למטרה ואת התגובתיות הצולבת הפוטנציאלית שלו עם PTM שאינם מטרה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

מאמר זה מתאר שיטת הכנה לדוגמה המבוססת על אי-פעולת חום כדי לשמר פפטידים אנדוגני הימנעות השפלה לאחר המוות, ואחריו כמות יחסית באמצעות תיוג איזוטופי בתוספת LC-MS.

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

חקור את הספציפיות של חלבוני ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) באמצעות מערכי פפטידים SPOT. שיטה זו מאפשרת זיהוי חומצות אמינו קריטיות במצעים ומספקת הבנה מקיפה של תפקודים ביולוגיים של PKMTs.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

גלה סרטונים נוספים