ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את הספציפיות של הסובסטרט של חלבון ליזין מתיל טרנספראזות או PK mts. זה מושג על ידי זיהוי מצע ראשוני והכנת מערכי פפטידים עם מספר גרסאות של מצע זה המכילים חילופי חומצות אמינו בודדות במיקומים שונים. כשלב שני, מערך הפפטידים מודגר עם ה-PKMT בנוכחות תורם קבוצת מתיל רדיואקטיבי, המאפשר זיהוי מתילציה של פפטיד על ידי העברת רדיואקטיביות לנקודת הפפטיד המתאימה.

לאחר מכן, המערך נחשף לסרט רנטגן ומנותח כמותית על מנת לקבוע את פעילות המתילציה בכל אחד מהפפטידים. וכדי להגדיר את פרופיל הספציפיות של ה-PKMT, התוצאות מראות אילו חומצות אמינו בפפטיד הסובסטרט הן קריטיות למתילציה שלו על ידי ה-PKMT. היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות קיימות כמו מתילציה של פפטידים בודדים הוא שניתן לבדוק מספר פפטידים שונים בניסוי אחד בצורה חסכונית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום מתילציה של חלבון ליים, כגון מפרט של מצעים חדשים שלא היו ידועים בעבר של PK mtss. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הספציפיות של PK mts. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון חלבון קינאזות, שיטת חלבון אחרת, טרנספראזות, או להוסיף לטרנספראזות.

הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר התוודעתי לאפשרות להכין מערכי פפטידים גדולים בהתאמה אישית בעלויות סבירות באמצעות סינתזת נקודות פפטיד כדי להתחיל בהליך זה, תכנן רצפי פפטידים לסינתזה באמצעות תוכנת multi pep spotter. הזן את רצפי הפפטידים כקוד אות בודדת כאשר כל אות מגדירה את חומצת האמינו הספציפית לאחר התנפחות מוקדמת זו, קרום הנקודה הפונקציונלי של אמינו peg בסוף, סוף דימתילפורממיד או DMF למשך 10 דקות. בסיום, הנח את הממברנה הרטובה על מסגרת הסינתיסייזר הנקודתית ללא בועות אוויר או קמטים.

יבש את הממברנה לחלוטין למשך 10 דקות לפחות לפני תחילת תוכנית הסינתזה. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם 100% אתנול כדי ליצור את קשר האמיד עם קבוצת האמינו החופשית על הממברנה. הפעל את קבוצת הקרבוקסי של חומצת האמינו הנכנסת על ידי הוספת DIC ואתיל הידרוקסי אמינו סינו אצטט לנגזרת חומצת האמינו.

לאחר ההפעלה, אתר את הנפחים הרצויים של חומצות אמינו מופעלות על הממברנה המתפקדת של Amino peg באמצעות הרובוט הניתן לתכנות. חזור על השלב הקודם שלוש פעמים כדי להבטיח צימוד טוב יותר של חומצת האמינו המופעלת הראשונה. לאחר דגירה של הממברנה למשך 20 דקות, שטפו אותה עם DMF כדי להסיר חומצות אמינו לא מחוברות לאחר ייבוש וחסימת קבוצות האמינו החופשיות.

שטפו את הממברנה עם DMF ארבע פעמים ולאחר מכן דגרו עם 20% פיפרין ב-DMF למשך 20 דקות כדי להסיר את קבוצת ההגנה FM. לאחר שטיפה וייבוש הממברנה, חזור על שלבי האיתור והסרת F MOC עד להשגת אורך הפפטיד הרצוי. לאחר ההגנה האחרונה של F MOC קבוצה D, שטפו את הממברנה עם DMF ו-100% אתנול.

לאחר מכן טפל בממברנה עם 0.02% ברום פנול כחול ב-DMF למשך חמש דקות לפחות עד שהיא הופכת לכחולה לחלוטין. לאחר שטיפה וייבוש הממברנה, הוציאו אותה מהסינתיסייזר והניחו אותה בקופסה עמידה בפני כימיקלים. טפל בו עם 20 עד 25 מיליליטר של תערובת הגנה של שרשרת צד D, המורכבת מחומצה טריכלורואצטית של 95% כדי לבקע את קבוצות ההגנה על שרשרת הצד וריאגנטים לנבלות כדי להגן על שרשראות הצד של חומצות האמינו מפני שינוי.

לאחר שווידאתם שתערובת ההגנה העמוקה מכסה את הממברנה, סגרו לחלוטין את הקופסה ודגרו עליה למשך שעה עד שעתיים תוך ניעור עדין לאחר הדגירה. שטפו את הממברנה שש פעמים עם 20 עד 25 מיליליטר של די כלורו מתאן למשך שתי דקות כל אחת. לאחר שטיפה פעמיים עם 100% אתנול, יש לייבש את הממברנה בייבוש למשך הלילה.

לאחר מכן, דגרו מראש את קרום מערך הפפטידים בשקית ניילון אטומה המכילה את מאגר המתילציה המתאים ללא אנזים ואמט עם קבוצת מתיל עם תווית רדיואקטיבית למשך 10 דקות, השליכו את המאגר לפני הדגירה ודגרו את הממברנה בשמונה מיליליטר של מאגר מתילציה המכיל את ה-PKMT המתאים למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן, השליכו את מאגר המתילציה למיכל פסולת רדיואקטיבית ושטפו את מערכי הפפטידים חמש פעמים עם 20 מיליליטר של מאגר המכיל 100 מילי-מולרי אמוניום ביקרבונט, ו-1% STS למשך חמש דקות כדי להסיר את החלבון הקשור לאחר השלכת מאגר הכביסה האחרון במיכל הפסולת הרדיואקטיבית, דגרו את הממברנה למשך חמש דקות בתמיסת הגבר של 10 מיליליטר.

לאחר מכן השליכו את תמיסת ההגברה במיכל הפסולת הרדיואקטיבית לממיסים אורגניים. אטמו את מערך הפפטידים בשקית ניילון והכניסו אותו לקלטת רדיוגרפיה אוטומטית. הנח את סרט הרדיוגרפיה האוטומטית על הפפטיד בחדר חשוך.

לאחר מכן סגור את הקסטה בזהירות. לאחר חשיפת הסרט במינוס 80 מעלות צלזיוס, יש לפתח אותו כדי לנתח את התוצאות. לבסוף, צלם את התמונה כמה פעמים עם זמני חשיפה שונים כדי למנוע רוויה של מצעי פפטיד שעברו מתילציה חזקה.

דוגמה לתגובת מתילציה של מערך פפטידים עם NSD מוצגת כאן. הציר האופקי מייצג את רצף הפפטיד ובכיוון האנכי. חומצת האמינו שהשתנתה מסומנת מתילציה עם nsd, אחד מראה שהיא פועלת באופן ספציפי על H 3 K 36 ומזהה שלוש עד ארבע שאריות חומצות אמינו משני צידי איחוד הליזין המטרה של שלושת ניסויי מערך הפפטידים של NSD אחד מוצג כאן.

כ-85% מהפפטידים מראים סטיות תקן קטנות מפלוס או מינוס 20% ויותר מ-97% מהפפטידים מדגימים סטיות תקן קטנות מפלוס או מינוס 30%נתוני גורם ההבחנה המחושבים מראים כי NSD אחד מעדיף שאריות ארומטיות במיקום מינוס שתיים. באתרים מינוס אחד ופלוס שניים, הוא מעדיף שאריות אטיות הידרופוביות. ובאתר פלוס אחד, יש העדפה לארגינין, ליזין, גלוטמין או אספרגין.

ניתן למצוא מצעי פפטידים חדשים פוטנציאליים על ידי חיפושים במאגרי נתונים של הפרוטאום האנושי. מתילציה חזקה של חלק מהפפטידים הללו עם כמה מאשרים את זהותם כמצעי פפטיד אחד חדשים של NSD. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במצע הראשוני המתאים ביותר בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מתילציה של החלבונים המקבילים במבחנה ובתאים על מנת לברר אם חלבונים מתקבלים כמצעים, גם לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מזילציה של חלבון ליזין, להגדיר את ספציפיות הסובסטרט של PK mts רבים ולזהות מספר מצעים חדשים. זה עזר להבין את התפקוד הביולוגי החשוב של PK mts.

אל תשכח שניתן לטעון לעבודה עם רדיואקטיביות וממיסים אורגניים בסינתזה של פפטידים, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים בעת ביצוע הליך זה.