Name: הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה להפנמת מולקולות ביולוגיות פלורסנטיות לתוך מיקרואורגניזמים חיים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת DNA וחלבונים בתאים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסטפן אופוף על הדיונים. 
R.C. נתמך על ידי Linacre College, אוניברסיטת אוקספורד. A.P. נתמך על ידי שירות החילופין האקדמי הגרמני (DAAD), הקרן האקדמית הלאומית הגרמנית ו-EPSRC. M.S. נתמך על ידי Wellcome Trust. A.N.K. נתמך על ידי מענק BBSRC הבריטי (BB/H01795X/1), ומענק התחלתי של מועצת המחקר האירופית (261227).

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li>
<li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+coming+of+age%3A+from+concepts+to+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHT-ChIP-seq%3A+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124(2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li>
<li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+syringe%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li>
<li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001(2010).</li>
<li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li>
<li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li>
<li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131(2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יכולים להיות מגוונים פרמטרים רבים במהלך electroporation התא ורכישת נתונים בהתאם למערכת הביולוגית של עניין ואופייה המדויק של הניסוי (ברמת תא או ניתוח מולקולה בודדת). לדוגמא, כאשר electroporating DNA של חיידקים, 0.25-5 pmol של שברי dsDNA כותרת מוביל ליעילות הפנמה נמוכה, המאפשר זיהוי מולקולה בודדת ישיר (כלומר., ללא צורך בphotobleaching לפני כן). מעל 5 pmol dsDNA, תאים נוטים להיות עמוסים במיוחד, משטר מתאים יותר לניתוח תא בודד. כל DNAs שהכותרת צריך להיות גם בעבר על מנת להסיר כל שמץ של צבע חופשי מטוהר ג&#39;ל (לא הגיב fluorophore) מפתרון מניות DNA. חוץ מזה, בעיות פוטנציאליות עם השפלה DNA, במיוחד עבור ניסויי smFRET, ניתן לטפל באמצעות DNAs עם חומצות טבעיות גרעין, או מוטיבים המגנים על termini exonuclease הנגיש כגון לולאות סיכת ראש. adjustabl נוסףפרמטר דואר בelectroporation הוא עוצמת השדה מיושמת במהלך electroporation. עוצמת שדה נמוכה (~ ק ו 1 / סנטימטר) יוביל ליעילות טעינה נמוכה מתאימה ללימודי מולקולה בודדת. עוצמת שדה גבוהה יותר (עד 1.8 קילו וולט / סנטימטר) תגביר את יעילות הטעינה; עם זאת, יש מתאם הפוך בין עוצמת שדה וכדאיויות תא לאחר electroporation (ראה איור 4). להתייחסות, עוצמת שדה רגילה המשמשת לחיידקים והשמרים electroporation היא ~ 1.5 kV / סנטימטר. קבוע הזמן, המייצג את האורך של הריקבון הזה, הוא פרמטר נוח למעקב, שכן טיפות קבועות הזמן בהקדם כל תופעה קשתית מתרחשת בקובט. תחת הגדרות רגילות, קבוע הזמן צריך להיות גדולה מ 4 ms; ערכים נמוכים עלולים להוביל ליעילות טעינה נמוכה או תאים שניזוקו אף שאינם טעונים. רוב electroporators מציע תארים אחרים של חופש (כמו &quot;חיתוך דופק&quot; או &quot;דופק צורה&quot;) אשר יכול להיות שונה כדי לכוון שניטעינת תא כדאיות. אנחנו מוחלים בשיטה זו לשני החיידקים ושמרים, אולם הליכים דומים צריכים גם לאפשר להפנמה של מולקולות ביולוגיות שכותרתו לתוך תאי יונקים באמצעות הגדרות מתאימות electroporator מאז הקרום שלהם הוא למעשה פחות מורכב (bilayer שומנים יחיד) ומאז electroporation כבר נעשה שימוש בתאים כאלה 21. כאשר הפנמת חלבונים שכותרתו, כל הצבע החופשי צריך להיות מוסר מelectroporation לפני פתרון מניות חלבון שכותרתו. מולקולות צבע חינם, בשל הגודל הקטן שלהם, יכולות להיות מופנמות באופן מועדף על החלבונים של עניין, וקשה להבחין בניתוח נתונים (למרות דיפוזיה מהירה יותר הצפויה שלהם). כמדריך, למדגם בחלבון הנקרא באופן אורגני להיות מתאים לelectroporation, כמות שנותר לצבוע חופשיים צריכה להיות מתחת ל -2% (שזוהה באמצעות סריקת ניאון של SDS-PAGE) 22. תהליך זה הוא חשוב במיוחד,כחלק ממולקולות עלולות להידבק לקרומים החיצוניים של חיידקים או פטריות electroporated. מבחינה זו, מדגם הביקורת השלילי צריך להציג עוצמת הקרינה לכל תא באופן ברור נמוכה מתאי electroporated, באופן אידיאלי נמוכה כמו רמת autofluorescence של תאים ריקים (תאים שלא היה מודגרות עם כל מולקולות ביולוגיות שכותרתו fluorescently ולא electroporated, איור 2). כמו בdsDNA, יעילות ההפנמה של חלבונים שכותרתו צמודה לסכום של מולקולות ביולוגיות הוסיפו לתאים לפני electroporation. עם זאת, פרמטרים אחרים, כגון גודל ותשלום, לשחק תפקיד בהפנמה. חלבונים קטנים להפגין יעילות הפנמה גבוהה, ואילו חלבונים גדולים יותר (עד 98 KDA) יכול להיות מופנם בהצלחה אבל עם יעילות נמוכה יותר (איור 5) 26. נקודת isolelectric של החלבון, אינטראקציות אפשריות עם קרום התא ופרמטרים physicochemical אחרים גםטעינת תא השפעה במהלך electroporation. כתוצאה מכך, משתמשים צריכים לייעל את הניסויים למערכת משלהם, בידיעה כי ריכוז ראשוני גבוה של חלבון שכותרת (&gt; 50 מיקרומטר) ייתן את הסיכוי הטוב ביותר לטעינה מוצלחת. Electroporation מציע גם כלי חדש להפריע ולנתח פונקציה סלולרית על ידי החדרת חלבונים ומולקולות ביולוגיות אחרות לתאים (שכותרתו או ללא תווית או). ניסויי RNA פולימראז T7 (איור 5 ג) הווה דוגמא כזו של ניסוי שבו אנחנו יכולים להציג את biomolecule שיכול לשנות ביטוי גני in vivo באמצעות electroporation. בעת ביצוע ניסויי הקרינה מולקולה בודדת, תאורת TIR בדרך כלל העדיפה על פני מצבי תאורה אחרים כפי שהוא מציע יחס אות לרעש הטוב ביותר על ידי fluorophores רק מרגשת בתוך קטע דק מעל פני השטח coverslip (~ 100 ננומטר). עם זאת מולקולות ביולוגי הדמיה שכותרתו לשדר בתוך מיקרואורגניזמים חיים עשויות מחדשמקהלת תאורה עמוקה יותר (עד 0.8 מיקרומטר לE. coli). תאורה עמוקה מושגת במצב חילו, תוך שמירה על יחס אות לרעש גבוה. מצד השני, הדמיה שדה רחבה היא חשובה במיוחד לניתוח photobleaching צעד חכם, שבו המשתמש הוא לאמוד את מספר המולקולות הופנמו על ידי photobleaching תא טעון כל עם כוח גבוה לייזר וחלוקת עוצמת הקרינה סלולארי הראשונית מעוצמת האחידה מיוצרת על ידי מולקולה בודדת (שלב photobleaching בודד, איור 3). ההדמיה Widefield נדרשה גם למעקב מולקולה ארוך טווח על מנת למקם את המולקולות לשדר עניין גם אם המסלולים שלהם לכסות את כל נפח התא. בפרוטוקול זה, אנו מציגים כיצד electroporation, טכניקה סטנדרטית לביולוגים וביוכימאים לאספקת חומצות גרעין בתאים, מהווה שיטה פשוטה להעברת מולקולות ביולוגי ניאון בסוגי תאים שונים. ההוא רומן, טכניקת תפוקה גבוהה מציעה כלי ייחודי להתבונן מולקולות שכותרתו בסביבה הטבעית שלהם. במולקולות ביולוגיות בנוסף שכותרתו עם fluorophores מכסה מגוון רחב של אורכי גל, electroporation יכול לספק מולקולות שונה עם קבוצות כימיות רבות, כגון נוקלאוטידים וחומצות אמינו לא טבעיים, chelators מתכת, crosslinkers, וקבוצות כולאות. אם המערכת הביולוגית של עניין היא לא חיונית להתפתחות התאים, הגן המקודד לחלבון המטרה יכול להיות גם שנמחק (או דפק למטה), על מנת להבטיח כי החלבונים נצפו לאחר הפנמה כל (או רוב) של בריכת החלבון תאית מייצגים . בעיקרו של דבר, electroporation יכול &quot;השתלה&quot; הגמישות של במבחנה bioconjugates לתאים חיים, ולכן תועלת מאמצים בביולוגיה סינתטית, ביולוגיה של מערכות, ובגילוי מולקולה בודדת vivo.

רוב מחקרי הקרינה בתוך תאי חיים תלויים בשילובי חלבון עם חלבוני ניאון (fps), כגון GFP 1. תגי ניאון אלה מאפשרים לימודים של עותק מספר, דפוס דיפוזיה או לוקליזציה של חלבונים מעורבים בתהליכים כגון ביטוי גנים או תחבורת קרום 2-7. FPS מציע סגוליות תיוג גבוה, יישום קל, והם זמינים במלאי גדול של גרסאות עם photophysical השונים ותכונות כימיות 1. עם זאת, fluorophores האורגני יישאר בחירת ראש לניסויים במבחנה בשל photostability הגדולה יותר (עד 100 פי יציב יותר מFPS) 8,9 גודל קטן, (עד 100 פי נפח קטן יותר FPS) וקלות תיוג intramolecular (בעיקר באמצעות השימוש בשאריות ציסטאין). כל הגורמים הללו הם חשובים במיוחד לקרינת מולקולה בודדת וסריג לומד 10. COMBIN שיטות הפנמה כמהing היתרונות של תיוג אורגני ובאיתור vivo הוכנס בעשור האחרון; עם זאת, שיטות כאלה או להעסיק תגי פוליפפטידים גדולים יחסית (תגים למשל, TMP, HALO, או 20 kDa SNAP) 11-14, דורשות השימוש בחומצות אמינו לא טבעיות 15, או מוגבלות לתאים גדולים, חד-קרום האיקריוטים (למשל. , לגרד טעינה, טעינת מזרק, microinjection) 16-19. פרוטוקול זה מתאר שיטת הפנמת רומן, פשוט ותפוקה גבוהה כי זוגות היתרונות של fluorophores האורגנית עם תצפית in vivo. כדי ששיטה זו, אנו מותאמים הליך electroporation הנפוץ להפוך תאים עם DNA פלסמיד 20,21 כדי לטעון מיקרואורגניזמים, כגון E. coli או S. cerevisiae עם מולקולות ביולוגיות שכותרתו אורגנית. הפרוטוקול כולל 4 צעדים פשוטים: דגירה של תאים עם מולקולות ביולוגיות שכותרתו,electroporation, התאוששות תא, ושטיפת תא כדי להסיר מולקולות ביולוגיות-הפנים שאינם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה electroporation, כמו גם את תהליכי ההדמיה תא וניתוח נתונים ללמוד הקרינה מבוססת תאים ומולקולה בודדת וסריג אותות. Electroporation מסתמכת על פריקת שדה חשמלי במתח גבוה על פני השעיה תא כוח יונית נמוכה כדי ליצור נקבוביות קרום חולף דרכו מולקולות ביולוגיות יכולות להיכנס לתאים (איור 1) 20,21. בדיוק כמו עם הפיכתו של חיידקים או פטריות עם פלסמיד דנ"א, תאים צריכים להיות מוכנים לפני electroporation כדי להבטיח electrocompetency. הליך זה, בהיקף של כמה צעדי שטיפה במים, מגדיל את החדירות הממברנה ומוריד את החוזק היוני של פתרון התא, כדי למנוע קשתי בקובט electroporation. בפרוטוקול זה, יכולים להיות מוכן תאים כמפורט להלן (ראה פרוטוקול: 1.1) או שנרכשו מספק מסחרי s. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול ההפנמה משמאל לימין:. להוסיף כמה מיקרוליטר של מולקולות ביולוגיות שכותרת לaliquot של תאי electrocompetent (קטעי דנ"א כפול שכותרתו וחיידקים בדוגמא זו); דגירה 1 עד 10 דקות על קרח ומעביר לקובט electroporation טרום צונן; electroporate ולאחר מכן להוסיף 0.5-1 מיליליטר בינוני עשיר לתאים מייד לאחר; לדגור על 37 ° C (או בטמפרטורה הנדרשת על ידי האורגניזם, למשל, 29 ° C עבור שמרים) כדי לאפשר לתאים להתאושש; לבצע 5 צעדי כביסה כדי להסיר כל שאינן מופנמת-מולקולות עודפות שכותרתו; resuspend את הכדור האחרון ב100-200 μl של חיץ PBS ופיפטה 10 μl על כרית agarose; לכסות את משטח עם coverslip ניקה ותמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במצב רחב שדה או במצב חילו). התחת = "jove_content"&gt; תאי Electrocompetent מודגרת עם המולקולות הביולוגיות שכותרתו רק לפני electroporation, אשר יכול להתבצע באמצעות תקן electroporators נמצא ברוב המעבדות ביוכימיה. מייד לאחר electroporation, תאים מודגרת במדיום עשיר המאפשר ההתאוששות שלהם לפני הכביסה (איור 1). העודף של אי-הפנימו מולקולות ביולוגיות שכותרתו יוסר ראשון על ידי שטיפה במאגר המכיל ריכוז גבוה למדי של מלח וקצת חומר ניקוי (ראה פרוטוקול: 3.3). הנוכחות של מלח משבשת אינטראקציות אלקטרוסטטיות שאינם ספציפיות שהוקמו על ידי אי-הפנימו מולקולות ביולוגיות שכותרתו שאחרת עשוי להידבק בקרום החיצוני. בדומה לכך, הנוכחות של חומר ניקוי בכביסת החיץ משבשת אינטראקציות הידרופוביות שאינם ספציפיות. בעוד הפנמת DNA היא פשוטה (איור 2), אמצעי זהירות יש לנקוט כאשר הפנמת חלבונים שכותרתו באמצעות electroporation. ראשית, מניית המדגם של חלבון הנקרא באופן אורגני עשוי עדיין מכיל אחוז קטן של צבע חופשי. מולקולות צבע חינם הן הרבה יותר קטנות מאשר חלבונים ולפיכך יתכן כי הפנימו מועדף. כדי להבטיח כי רובם המכריע של נצפו מולקולות ניאון הפנימו מתאים לחלבון של עניין, מדגם החלבון הראשוני צריך להכיל פחות מ ~ 2% צבע חופשי (איור 5) 22. העודף של אי-הפנימו חלבונים שכותרתו יכול גם להיצמד לקרום התא החיצוני לאחר electroporation; תופעה זו היא חלבון ספציפי וצריכה להיבדק לכל חלבון חדש. אנו מציעים מספר אפשרויות המאפשרות את הסרתם של חלבונים-הפנים שאינם ממדגם התא הטעון (ראה פרוטוקול: 3.3.3). לבסוף, תאי resuspended בנפח קטן של חיץ פוספט וpipetted על כרית agarose, המאפשרים ההדמיה שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. קיבוע על רפידות agarose הוא simplדואר ודרך יעילה של תאי הדמיה על coverslip מבלי לפגוע שלמותם. הכרית צריכה להכיל מדיום תרבות נמוכה הקרינה. הדמיה תא יכולה להתבצע במיקרוסקופ או בwidefield, סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) או באמצעות הילו (מאוד משופע וגיליון אופטי רבודה). בתצורה חילו, קרן הלייזר חודרת עמוקה יותר לתוך הדגימה מאשר בTIRF, עדיין לא להאיר את המדגם כולו כלwidefield, המאפשר יחס אות לרעש גדול יותר 23. בהתאם לרזולוצית כוח הלייזר וזמן שימוש, ניתן לספור מולקולות ביולוגיות הפנימו (באמצעות ניתוח photobleaching-שלבים, איור 3), מקומיות, או במעקב 24-28. הפנמה של מבנים שכותרתו כפליים עם זוג סריג של fluorophores מאפשרת כימות של סריג הן בתא בודד או רמות מולקולה בודדת (איור 6). יכולים להיות מגוונים פרמטרים שוניםבהתאם לפלט הרצוי והמערכת הביולוגית למדה. ראשית, כמות החומר הפנים לכל תא יכולה להיות מכוונת על ידי שינוי הריכוז של מולקולות ביולוגיות שכותרתו נוספה לelectroporation התאים הקודם (איור 2). עוצמת שדה Electroporation תשפיע גם הן את יעילות הטעינה וכדאיויות תא; כצפוי, בזמן שמגביר את יעילות טעינה עם עוצמת שדה גובר, את הכדאיות של תאי electroporated יורדת (איור 4 א). ניתן לכמת את שני פרמטרים על ידי הקלטת אחוז טעון וחלוקת תאים לאחר electroporation. assay כדאיות זה בשילוב עם ההדמיה הקרינה גם מאמת את התצפית של מולקולות ביולוגיות הפנימו בתאים חיים ומאפשר תצפית רציפה במשך כמה דורות (איור 4). לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר ההפנמה של מולקולות דנ"א וחלבון fluorescently שכותרתו לE. coli או S. cerevisiae 26. מולקולות בודדות שכותרתו עם fluorophores האורגני יכולות להיות במעקב עם הרזולוציה spatiotemporal גבוהה ללוחות זמנים בסדר גודל יותר מFPS. לבסוף, שיטה זו תואמת widefield, TIRF וזיהוי confocal, כמו גם תוכניות עירור פעם, כגון ALEX (לסירוגין עירור לייזר 28,29).

<table><tbody><tr><td>תאי ElectroMax DH5-alpha Comptent</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>או כל חיידק או שמרים מסחריים או מעבדתיים אחרים.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>מדיה עשירה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>נמוכה מכשיר אלקטרופורציה MicroPulser&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>או כל אלקטרופורטור קלאסי לטרנספורמציה של מיקרואורגניזמים</td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית מוסמכת agarose</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>אגרוז פלואורסצנטי נמוך עבור כרית אגרוז</td></tr><tr><td>כיסויי מיקרוסקופ מס' 1.5 עובי</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>להסיר חלקיקי רקע על ידי חימום שקופיות בתנור בטמפרטורה של 500 מעלות; C למשך שעה</td></tr><tr><td>אחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מולקולה אחת</td><td>נבנה</td><td></td> ביתי <td>מתואר בתוכנת</td></tr><tr><td>לוקליזציה</td> של REFs <td>חבילת תוכנה מקוונת MATLAB ו-C++ הכתובה בהתאמה אישית וזמינה הניתנת להתאמה לניתוח לוקליזציה.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מעקב</td><td>זמינה באופן מקוון</td><td></td><td>להטמעת MATLAB על ידי בלייר ודופרסן.</td></tr></tbody></table>

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך electroporation

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

היכולת לחקור ביומולקולות in vivo היא חיונית להבנת תפקודן בהקשר ביולוגי. גישה רבת עוצמה אחת כוללת מיזוג מולקולות המעניינות לחלבונים פלואורסצנטיים כגון GFP כדי לחקור את הביטוי, הלוקליזציה והתפקוד שלהם. עם זאת, GFP ונגזרותיו גדולים משמעותית ופחות ניתנים לצילום מאשר פלואורופורים אורגניים המשמשים בדרך כלל לניסויים במבחנה, וזה יכול להגביל את היקף המחקר. 
לאחרונה הצגנו שיטה פשוטה, רב-תכליתית ובעלת תפוקה גבוהה המבוססת על אלקטרופורציה, המאפשרת הפנמה של ביומולקולות המסומנות בפלואורופורים אורגניים למיקרואורגניזמים חיים. כאן אנו מתארים כיצד להשתמש באלקטרופורציה כדי להפנים מקטעי DNA או חלבונים מסומנים לתוך Escherichia coli ו-Saccharomyces cerevisiæ, כיצד לכמת את מספר המולקולות המופנמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכיצד לכמת את הכדאיות של תאים אלקטרופורטים. ניתן לרכוש נתונים ברמת התא הבודד או המולקולה הבודדת באמצעות פלואורסצנטיות או FRET. מוצגת גם האפשרות להפנים מולקולות שאינן מסומנות המעוררות תגובה פיזיולוגית נצפית in vivo. לבסוף, נדונות אסטרטגיות של אופטימיזציה של הפרוטוקול למערכות ביולוגיות ספציפיות.

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

מטרת הליך זה היא להפנים ולדמיין ביומולקולות כגון DNA או חלבונים המסומנים בפלואור אורגני בתוך מיקרואורגניזמים חיים בשיטה המבוססת על אלקטרופורציה. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של תאים אלקטרו-מוכשרים עם ביו-מולקולות עם תווית פלואורסצנטית לפני העברתם לבדיקת אלקטרופורציה. על ידי הפעלת מתח גבוה על פני הווט, תצורות נקבוביות חולפות הן על דופן התא והן על קרום התא יאפשרו דיפוזיה ביו-מולקולרית לתוך התאים.לאחר מכן, התאים מודגרים במדיום עשיר כדי לאפשר להם להתאושש לפני הסרת עודפי הביו-מולקולות הלא מופנמות. לבסוף, התאים מועברים למשטח עלייה מינימלי של חומרים מזינים פלואורסצנטיים נמוכים, ולאחר מכן מונחת על גבי תלוש כיסוי זכוכית ליצירת כריך אגרו מזכוכית. בסופו של דבר, מיקרוסקופ המהות הזה משמש לניתוח המיקום, דפוס הדיפוזיה והתכונות הדינמיות של הביו-מולקולות המסומנות בתוך התאים החיים.הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו את המגבלות בהדמיית תאים חיים. בשל התקלות המהירות של חלבונים פוטו-פלואורסצנטיים כמו GFP, הסקנו שעל ידי העמסת תאים חיים בביו-מולקולות המסומנות בכוח פלואורו אורגני, נשתיל במיקרואורגניזמים חיים. היתרונות העיקריים של כוח זה הם בהירות, יציבות צילום וגודל קטן.לאחר מכן אנו מקווים לעקוב אחר הלוקליזציה והדיפוזיה של דנ"א או חלבונים בסביבתם הטבעית בטווחי זמן ארוכים בהרבה, שיתאימו לתהליכים ביולוגיים חשובים רבים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרו-הזרקה, הוא שניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים קטנים מקוטר מחט מיקרו-הזרקה טיפוסית. יתרון נוסף של אלקטרופורציה הוא שניתן לטעון מספר רב של תאים בו זמנית בביומולקולות פלואורסצנטיות ולדמיין במקביל את אלה שהופכים את האלקטרופורציה לטכניקת תפוקת עיניים במיוחד.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנהגות הדיפוזיה והדינמיקה של ביומולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי in vivo, ניתן ליישם אותה גם בהקשרים אחרים כגון על ביומולקולות אלקטרודות שאינן מסומנות, אך היא יכולה, למשל, לעורר תגובה פיזיולוגית כאשר היא מופנמת על ידי התא כדי לבנות רפידות aros עבור חיידקים או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שמרים התחל בהכנת כשני x מדיה פלואורסצנטית נמוכה, לאחר מכן ממיסים תמיסה של 2% AROS במים מזוקקים עם מיקרוגל מעבדה באופן מיידי. הוסף נפח תואם אחד של ורד ה- HA החם למדיה ופיפטה בעדינות את התערובת למעלה ולמטה. הימנעות מהיווצרות בועות, פיפטה מיד כ-200 מיקרוליטר מהתערובת שנוצרה על החלקת כיסוי מיקרוסקופ בגודל סטנדרטי.השאירו את הכיסוי על הספסל למשך דקה בטמפרטורת החדר עד שהג'ל מתמצק או אחסון זמני הניחו כיסוי נקי שני על הכרית הטרייה והפעילו בעדינות לחץ מלמעלה כדי לפלאס בוורד הביצה, החל ממלאי של ביומולקולות פלואורסצנטיות שהוכנו במאגר בעל חוזק יוני נמוך. העבירו עד חמישה מיקרוליטר של הביו-מולקולות לתוך 20 מיקרוליטר של חיידקים מוכשרים, או 50 מיקרוליטר של תאי שמרים מוכשרים. כמות הביו-מולקולות הפלואורסצנטיות המודגרות עם התאים נמצאת בקורלציה ישירה עם כמות הביו-מולקולות המופנמות בכל תא.לאחר האלקטרופורציה, דגרו את התערובת על קרח עד 10 דקות. במקביל, בחר בדיקת אלקטרופורציה של מרווח אלקטרודות מתאים וצנן על קרח. העבירו את תערובת התאים לתוך הווט המצוננת מראש.הקש בעדינות על הווטר כמה פעמים כדי להסיר בועות מהתמיסה. הסר כל לחות מהווט בעזרת מגבת נייר והנח את הווט לתוך האלקטרו-אטור. החל דופק מתח גבוה על התאים מיד לאחר תהליך זה.ודא שקבוע הזמן המוצג על האלקטרו-אטור הוא בין ארבע לשש אלפיות השנייה. קבועי זמן נמוכים יותר נובעים לעתים קרובות מנוכחות עודף מלח או בועות בתוך ה-qve, וזה עלול להפחית או לעכב לחלוטין את ספיגת הביו-מולקולות לתאים. פולסים במתח גבוה יותר משפרים את עומס התאים, אך יכולים גם להשפיע על כדאיות התא מיד לאחר אלקטרופורציה.הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה עשירה והעביר את התאים לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. תנו לקרום התא להתאושש על ידי דגירה של חיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או שמרים בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 10 דקות. לאחר שילוב ביומולקולות והתאוששות הצמיחה, סובב את התאים למשך דקה אחת בצנטריפוגה מקוררת מראש של ארבע מעלות צלזיוס והשליך את חומר השכיבה ריס.השעו את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ וחזרו על תהליכי השעיית הסיבוב וההסרה והחיצוץ. שלוש פעמים נוספות. שלבי שטיפה אלה יסירו את כל העקבות של ביומולקולות לא מופנמות מהשעיית התא.במקרה של הפנמת חלבון מסומן ושלב טיהור נוסף מתבצע על ידי פיפטינג של תרחיף התא לתוך צינור של 1.5 מיליליטר המצויד במסנן ממברנה של 0.22 מיקרון מעל. הפרד את התאים מהמאגר על ידי צנטריפוגה תוך הקפדה על שאריות מספיק נוזלים מעל המסנן כדי למנוע התייבשות של התאים ולהשליך את הזרימה דרך שבר. מתחת למסנן, הוסף 500 מיקרוליטר PBS טרי מעל התאים וחזור על השילוב של סיבוב למטה ואחריו מהדורת PBS טרייה.עוד פעמיים. בצע סיבוב אחרון ב-3,300 G למשך דקה אחת. כדי להסיר את שטיפת ה- PBS הקודמת, השעו מחדש את התאים עם 150 מיקרוליטר PBS.לבסוף, הסר את החלקת הכיסוי העליונה מכרית הארוס שנעשתה בעבר. טען את התאים על הרפידה על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של מתלה התא טיפה. לאחר הנחת תלוש כיסוי נקי חדש על גבי כרית הקמה, תאי הסנדוויץ' מוכנים כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.בקרות שליליות כגון בקרות לא מדורגות, שהודגרו עם ביומולקולות מסומנות או תאים ריקים, שלא דורגו אלקטרו ולא הודגרו, צריכות להיות מוכנות גם במקביל לכל דגימות טעונות, ניתן לדמות תאים טעונים בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים. בעוד שמצב הדמיה בשדה רחב מאפשר הדמיה וניתוח ברמת התא, דשא או תאורה נמוכה גבוהה או אופטימלי לתצפית ומעקב אחר מולקולה בודדת. כדי למנוע הלבנה עודפת של הביו-מולקולות, אנא ודא שכל תאורת הלייזר על הבמה כבויה או חסומה עם מסנן אטום לפני טעינת הדגימה.יתר על כן, כבה את רווח מצלמת E-M-C-C-G כדי למנוע נזק לחשיפת יתר למצלמה. להגדרת מיקרוסקופ הפוך, הנח את כריך כרית אריס על שלב המיקרוסקופ כשהצד המכוסה בתא פונה כלפי מטה לכיוון המטרה התחתונה. לאחר מכן הפעל את אור הלוגן בצד העליון והביא את התאים למיקוד במצב מיקרוסקופ אור לבן מועבר לפני הפעלת הלייזר, צלם את התאים במצב העברת אור לבן.תמונה זו תשמש כמפת ייחוס מיקום שתתאם בין אזורים של פלואורסצנציה ביו-מולקולרית למיקומים בפועל של תאים באותו שדה ראייה. למדידת כדאיות, השתמש בתנור חימום אובייקטיבי המוגדר בטמפרטורה האופטימלית והקלט תמונות עוקבות של אותו שדה ראייה תחת תאורת אור לבן כל 30 דקות מבלי להזיז את ה-stage, כבה את התאורה העליונה והגן על הדגימה שלך מכל מקורות האור הסביבתיים האחרים במעבדה. לאחר מכן הפעל את מצלמת ה-CCD והתחל ברכישת נתונים.התחל להקליט את יון הפלואורסצנט רגע לפני הפעלת תאורת הלייזר. לאחר ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, התחל את ניתוח הנתונים על ידי פתיחת כל הצילומים עם תוכנת עיבוד תמונה כגון Image J כדי להתחיל לנרמל את כל פרמטרי התמונה הבסיסיים כגון בהירות או ניגודיות על פני כל התמונות על ידי לחיצה על כפתור ההגדרה ובחר את ההפצה לכל התמונות האחרות. אפשרות ראשונה יכולה לברר באופן איכותי אם טעינת התאים הצליחה מכיוון שתאים טעונים צריכים להיות בהירים משמעותית מהתאים הלא אלקטרופוטיים המשמשים כבקרה שלילית לתמונה נתונה.השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית והקיף אזורים שונים של פלואורסצנטיות במצולעים שצוירו ביד. השווה את עוצמת הקרינה בין כל המצולעים הרלוונטיים על ידי בחירת אפשרות המדידה מתפריט הניתוח. חזור על תהליך זה באופן ידני או באמצעות קובץ Script אוטומטי כדי לחלץ את העוצמה לפיקסל של כל התאים בכל דגימה ופקדים שליליים.כאשר תא מדורג אלקטרו נטען בביומולקולה פלואורסצנטית אחת או כמה, עוצמת הפליטה הממוצעת שלו תהיה גדולה מהעוצמה הממוצעת של דגימת בקרה שלילית. כדי להעריך את כדאיות התא, ספור ידנית את אחוז החלוקה השלמה על ידי תאים שאינם מתחלקים ופגומים. באותו שדה ראייה שעבורו נרשמו נתונים כל 30 דקות על פני כמה חלוקות, לא תמיד ניתן לספור את מספר הביו-מולקולות המופנמות לכל תא ישירות, במיוחד כאשר הביו-מולקולות מתפזרות במהירות או כאשר התאים נטענים ביותר מחמש ביומולקולות מסומנות.ניתוח פוטו-הלבנה מבוסס תאים מאפשר להעריך את מספר הביו-מולקולות המסומנות לתא בתנאים כאלה. באמצעות כפתור הבחירה ביד חופשית, עקוב אחר קווי המתאר של תא פלואורסצנטי נתון וחלץ ושרטט את הקרינה של התא הגולמי כפונקציה של זמן עקב השפעות פוטו-הלבנה. גרף העוצמה לעומת הזמן יהיה עקומה יורדת באופן אקספוננציאלי, התאים העמוסים בכבדות, אך עבור תאים המכילים פחות מ-10 ביומולקולות, יש להבחין בצעדים ברורים.חשב את האוטו-פלואורסצנציה הממוצעת לאחר פוטו-הלבנה על ידי חישוב ממוצע ערכי עוצמת הפלואורסצנט הגולמי ליד חלק קצה הזנב השטוח של הניסוי, שיכול להיות, למשל, מ-50 עד 100 מסגרות התמונה האחרונות בסדרת זמן-lapse. לאחר קביעת עוצמת הבסיס גם כן, חשב את עוצמת ההלבנה התלויה בזמן על ידי הפחתת האוטופלואורסצנציה הבסיסית מנתוני הקרינה הגולמיים, ולאחר מכן חסום את נתוני עוצמת ההלבנה המתקבלים וכמת את הגובה של כל שלב באופן ידני או באמצעות אלגוריתם. יש לחזור על תהליך זה עבור מספר תאים המציגים יותר מ-100 שלבים בסך הכל על מנת לקבל הערכה מדויקת של גובה הצעד הממוצע, ערך זה מתאים לעוצמת הפלואורו היחידה ארבע עקב הלבנה של פלואורו ארבע בודד.לבסוף, ניתן לחשב את מספר המולקולות המופנמות לתא על ידי חלוקת עוצמת התא המופחתת הבסיסית בזמן שווה לאפס בפלואורו היחידתי. ארבע עוצמות לפרוטוקול אלקטרופורציה זה. ניתן לשלוט בכמות ה-DNA או החלבון המסומנים בפלואורסצנט שניתן להפנים לחיידקים או שמרים על ידי התאמת כמות בדיקות ה-DNA הקיימות בתוך מאגר האלקטרופורציה.כאשר קצב ההפנמה הביו-מולקולרי גבוה, אורך חיי ההלבנה הפוטו-הלבנה של הביו-מולקולה המסומנת על ידי התוויית תחילה של עוצמת הפלואורסצנט כפונקציה של זמן ולאחר מכן חילוץ קבוע הזמן האקספוננציאלי שלה נותן מידע על יציבות הצילום של הצבעים in vivo. במקרה של שיעורי התאגדות נמוכים, קוונטיזציה של עוצמת הפלואורסצנט תספק אמצעי לקירוב המספר הכולל של ביומולקולות בתוך תא נתון. ניתן להשתמש באלקטרופורציה גם כדי לשלב חלבונים בחיידקים או בשמרים.במקרה של חלבון עם תווית פלואורסצנטית. מכיוון שניתן להפנים את הפלואורופורים החופשיים עצמם ביעילות רבה, חשוב להסיר את כל הפלואורופורים החופשיים והלא מחוברים קוולנטית ממלאי החלבון. לבסוף, ניתן גם להפנים את הסימון הכפול על ידי המולקולות שלנו באמצעות השיטה שלנו כדי לאפשר תצפית על מולקולה בודדת בתאים חיים במשך מספר שניות.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין ולנתח גם את דגימות הבקרה כגון תאים שאינם אלקטרו, אשר מודגרים עם ביומולקולה מסומנת או תאים ריקים, שאינם אלקטרופורטים או מודגרים עם מולקולה מסומנת. בקרות אלה מאפשרות לנו להעריך את רמת האוטופלואורסצנטיות של התאים ואת המחסור בשלבי השטיפה, וככאלה הם נחוצים כדי להעריך אם ניסוי האלקטרופורציה הצליח לאחר פיתוחיו. טכניקה זו פתחה אפיקים חדשים לחוקרים בתחום הביופיזיקה והביולוגיה השלישית לחקור את הדיפוזיה וההתנהגות הדינמית של ביומולקולת תווית במיקרואורגניזמים חיים.וזה בטווח זמן אחד עד שניים יותר מאשר עם חלבונים אוטו-פלואורסצנטיים כמו GFPs. זה העביר את הגמישות של תיוג d אורגני in vivo מה שהפך את ניסויי האיום של מולקולה בודדת להרבה יותר אפשריים לחקר הדינמיקה התוך-מולקולרית והבין-מולקולרית בתאים חיים.

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של...

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מקור: אייגריין, ל. , ואחרים. הפנמה ותצפית על מולקולות ביולוגיות פלואורסצנטיות במיקרואורגניזמים חיים באמצעות אלקטרופורציה.  J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים את העברת מולקולות ביולוגיות פלואורסצנטיות לתאים מיקרוביאליים בעלי יכולת אלקטרופוטית באמצעות אלקטרופורציה. התהליך מתחיל בהכנסת DNA או חלבונים מסומנים בפלואורופור לתוך תליית תא מקורר. לאחר מכן מופעל פולס במתח גבוה ליצירת נקבוביות ממברנה זמניות, המאפשרת כניסת ביומולקולה לציטופלזמה. לאחר ההתאוששות, התאים עוברים שטיפה וסינון להסרת מולקולות שאינן...

אספקה מבוססת אלקטרופורציה של ביומולקולות פלואורסצנטיות לתאי חיידק

סרטון זה מדגים את טכניקת האלקטרופורציה המציגה DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי למבשרי תאי גרגיר המוח הקטן הראשוניים של עכבר.

Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.

שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)

שינוי Biolistic הוא שיטה המשמשת ליצירת אינטגרציה יציבה של DNA לתוך הגנום של neoformans הפתוגן קריפטוקוקוס האופורטוניסטי באמצעות רקומבינציה ההומולוגית. נדגים שינוי biolistic של מבנה, שבו יש קינאז אצטט גן המקודד התמזג mCherry תג הניאון לneoformans ג.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

אלקטרופורציה היא שימוש בשדות חשמליים פועמים (PEFs) ליצירת נקבוביות חולפות בתרביות תאים כדי להכניס מטען מולקולרי. טכניקה זו הפכה לאחרונה לשימוש נרחב במחקר ובמסגרות קליניות. כאן, אנו מתארים טכניקות אלקטרופורציה באמצעות "מערכת ציטומטריית אלקטרופורציה" שפותחה לאחרונה לביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים.

פרוטוקול ציטומטריית אלקטרופורציה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים באמצעות תרבית תאים U2 OS

למדו שיטת אלקטרופורציה להפנמת מולקולות ביולוגיות פלורסנטיות לתוך מיקרואורגניזמים חיים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת DNA וחלבונים בתאים בזמן אמת.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

גלה סרטונים נוספים