הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

מטרת הליך זה היא להפנים ולדמיין ביומולקולות כגון DNA או חלבונים המסומנים בפלואור אורגני בתוך מיקרואורגניזמים חיים בשיטה המבוססת על אלקטרופורציה. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של תאים אלקטרו-מוכשרים עם ביו-מולקולות עם תווית פלואורסצנטית לפני העברתם לבדיקת אלקטרופורציה. על ידי הפעלת מתח גבוה על פני הווט, תצורות נקבוביות חולפות הן על דופן התא והן על קרום התא יאפשרו דיפוזיה ביו-מולקולרית לתוך התאים.

לאחר מכן, התאים מודגרים במדיום עשיר כדי לאפשר להם להתאושש לפני הסרת עודפי הביו-מולקולות הלא מופנמות. לבסוף, התאים מועברים למשטח עלייה מינימלי של חומרים מזינים פלואורסצנטיים נמוכים, ולאחר מכן מונחת על גבי תלוש כיסוי זכוכית ליצירת כריך אגרו מזכוכית. בסופו של דבר, מיקרוסקופ המהות הזה משמש לניתוח המיקום, דפוס הדיפוזיה והתכונות הדינמיות של הביו-מולקולות המסומנות בתוך התאים החיים.

הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו את המגבלות בהדמיית תאים חיים. בשל התקלות המהירות של חלבונים פוטו-פלואורסצנטיים כמו GFP, הסקנו שעל ידי העמסת תאים חיים בביו-מולקולות המסומנות בכוח פלואורו אורגני, נשתיל במיקרואורגניזמים חיים. היתרונות העיקריים של כוח זה הם בהירות, יציבות צילום וגודל קטן.

לאחר מכן אנו מקווים לעקוב אחר הלוקליזציה והדיפוזיה של דנ"א או חלבונים בסביבתם הטבעית בטווחי זמן ארוכים בהרבה, שיתאימו לתהליכים ביולוגיים חשובים רבים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרו-הזרקה, הוא שניתן ליישם אותה גם על מיקרואורגניזמים קטנים מקוטר מחט מיקרו-הזרקה טיפוסית. יתרון נוסף של אלקטרופורציה הוא שניתן לטעון מספר רב של תאים בו זמנית בביומולקולות פלואורסצנטיות ולדמיין במקביל את אלה שהופכים את האלקטרופורציה לטכניקת תפוקת עיניים במיוחד.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנהגות הדיפוזיה והדינמיקה של ביומולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי in vivo, ניתן ליישם אותה גם בהקשרים אחרים כגון על ביומולקולות אלקטרודות שאינן מסומנות, אך היא יכולה, למשל, לעורר תגובה פיזיולוגית כאשר היא מופנמת על ידי התא כדי לבנות רפידות aros עבור חיידקים או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שמרים התחל בהכנת כשני x מדיה פלואורסצנטית נמוכה, לאחר מכן ממיסים תמיסה של 2% AROS במים מזוקקים עם מיקרוגל מעבדה באופן מיידי. הוסף נפח תואם אחד של ורד ה- HA החם למדיה ופיפטה בעדינות את התערובת למעלה ולמטה. הימנעות מהיווצרות בועות, פיפטה מיד כ-200 מיקרוליטר מהתערובת שנוצרה על החלקת כיסוי מיקרוסקופ בגודל סטנדרטי.

השאירו את הכיסוי על הספסל למשך דקה בטמפרטורת החדר עד שהג'ל מתמצק או אחסון זמני הניחו כיסוי נקי שני על הכרית הטרייה והפעילו בעדינות לחץ מלמעלה כדי לפלאס בוורד הביצה, החל ממלאי של ביומולקולות פלואורסצנטיות שהוכנו במאגר בעל חוזק יוני נמוך. העבירו עד חמישה מיקרוליטר של הביו-מולקולות לתוך 20 מיקרוליטר של חיידקים מוכשרים, או 50 מיקרוליטר של תאי שמרים מוכשרים. כמות הביו-מולקולות הפלואורסצנטיות המודגרות עם התאים נמצאת בקורלציה ישירה עם כמות הביו-מולקולות המופנמות בכל תא.

לאחר האלקטרופורציה, דגרו את התערובת על קרח עד 10 דקות. במקביל, בחר בדיקת אלקטרופורציה של מרווח אלקטרודות מתאים וצנן על קרח. העבירו את תערובת התאים לתוך הווט המצוננת מראש.

הקש בעדינות על הווטר כמה פעמים כדי להסיר בועות מהתמיסה. הסר כל לחות מהווט בעזרת מגבת נייר והנח את הווט לתוך האלקטרו-אטור. החל דופק מתח גבוה על התאים מיד לאחר תהליך זה.

ודא שקבוע הזמן המוצג על האלקטרו-אטור הוא בין ארבע לשש אלפיות השנייה. קבועי זמן נמוכים יותר נובעים לעתים קרובות מנוכחות עודף מלח או בועות בתוך ה-qve, וזה עלול להפחית או לעכב לחלוטין את ספיגת הביו-מולקולות לתאים. פולסים במתח גבוה יותר משפרים את עומס התאים, אך יכולים גם להשפיע על כדאיות התא מיד לאחר אלקטרופורציה.

הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה עשירה והעביר את התאים לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. תנו לקרום התא להתאושש על ידי דגירה של חיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס או שמרים בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 10 דקות. לאחר שילוב ביומולקולות והתאוששות הצמיחה, סובב את התאים למשך דקה אחת בצנטריפוגה מקוררת מראש של ארבע מעלות צלזיוס והשליך את חומר השכיבה ריס.

השעו את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ וחזרו על תהליכי השעיית הסיבוב וההסרה והחיצוץ. שלוש פעמים נוספות. שלבי שטיפה אלה יסירו את כל העקבות של ביומולקולות לא מופנמות מהשעיית התא.

במקרה של הפנמת חלבון מסומן ושלב טיהור נוסף מתבצע על ידי פיפטינג של תרחיף התא לתוך צינור של 1.5 מיליליטר המצויד במסנן ממברנה של 0.22 מיקרון מעל. הפרד את התאים מהמאגר על ידי צנטריפוגה תוך הקפדה על שאריות מספיק נוזלים מעל המסנן כדי למנוע התייבשות של התאים ולהשליך את הזרימה דרך שבר. מתחת למסנן, הוסף 500 מיקרוליטר PBS טרי מעל התאים וחזור על השילוב של סיבוב למטה ואחריו מהדורת PBS טרייה.

עוד פעמיים. בצע סיבוב אחרון ב-3,300 G למשך דקה אחת. כדי להסיר את שטיפת ה- PBS הקודמת, השעו מחדש את התאים עם 150 מיקרוליטר PBS.

לבסוף, הסר את החלקת הכיסוי העליונה מכרית הארוס שנעשתה בעבר. טען את התאים על הרפידה על ידי פיפטינג של 10 מיקרוליטר של מתלה התא טיפה. לאחר הנחת תלוש כיסוי נקי חדש על גבי כרית הקמה, תאי הסנדוויץ' מוכנים כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

בקרות שליליות כגון בקרות לא מדורגות, שהודגרו עם ביומולקולות מסומנות או תאים ריקים, שלא דורגו אלקטרו ולא הודגרו, צריכות להיות מוכנות גם במקביל לכל דגימות טעונות, ניתן לדמות תאים טעונים בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים. בעוד שמצב הדמיה בשדה רחב מאפשר הדמיה וניתוח ברמת התא, דשא או תאורה נמוכה גבוהה או אופטימלי לתצפית ומעקב אחר מולקולה בודדת. כדי למנוע הלבנה עודפת של הביו-מולקולות, אנא ודא שכל תאורת הלייזר על הבמה כבויה או חסומה עם מסנן אטום לפני טעינת הדגימה.

יתר על כן, כבה את רווח מצלמת E-M-C-C-G כדי למנוע נזק לחשיפת יתר למצלמה. להגדרת מיקרוסקופ הפוך, הנח את כריך כרית אריס על שלב המיקרוסקופ כשהצד המכוסה בתא פונה כלפי מטה לכיוון המטרה התחתונה. לאחר מכן הפעל את אור הלוגן בצד העליון והביא את התאים למיקוד במצב מיקרוסקופ אור לבן מועבר לפני הפעלת הלייזר, צלם את התאים במצב העברת אור לבן.

תמונה זו תשמש כמפת ייחוס מיקום שתתאם בין אזורים של פלואורסצנציה ביו-מולקולרית למיקומים בפועל של תאים באותו שדה ראייה. למדידת כדאיות, השתמש בתנור חימום אובייקטיבי המוגדר בטמפרטורה האופטימלית והקלט תמונות עוקבות של אותו שדה ראייה תחת תאורת אור לבן כל 30 דקות מבלי להזיז את ה-stage, כבה את התאורה העליונה והגן על הדגימה שלך מכל מקורות האור הסביבתיים האחרים במעבדה. לאחר מכן הפעל את מצלמת ה-CCD והתחל ברכישת נתונים.

התחל להקליט את יון הפלואורסצנט רגע לפני הפעלת תאורת הלייזר. לאחר ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, התחל את ניתוח הנתונים על ידי פתיחת כל הצילומים עם תוכנת עיבוד תמונה כגון Image J כדי להתחיל לנרמל את כל פרמטרי התמונה הבסיסיים כגון בהירות או ניגודיות על פני כל התמונות על ידי לחיצה על כפתור ההגדרה ובחר את ההפצה לכל התמונות האחרות. אפשרות ראשונה יכולה לברר באופן איכותי אם טעינת התאים הצליחה מכיוון שתאים טעונים צריכים להיות בהירים משמעותית מהתאים הלא אלקטרופוטיים המשמשים כבקרה שלילית לתמונה נתונה.

השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית והקיף אזורים שונים של פלואורסצנטיות במצולעים שצוירו ביד. השווה את עוצמת הקרינה בין כל המצולעים הרלוונטיים על ידי בחירת אפשרות המדידה מתפריט הניתוח. חזור על תהליך זה באופן ידני או באמצעות קובץ Script אוטומטי כדי לחלץ את העוצמה לפיקסל של כל התאים בכל דגימה ופקדים שליליים.

כאשר תא מדורג אלקטרו נטען בביומולקולה פלואורסצנטית אחת או כמה, עוצמת הפליטה הממוצעת שלו תהיה גדולה מהעוצמה הממוצעת של דגימת בקרה שלילית. כדי להעריך את כדאיות התא, ספור ידנית את אחוז החלוקה השלמה על ידי תאים שאינם מתחלקים ופגומים. באותו שדה ראייה שעבורו נרשמו נתונים כל 30 דקות על פני כמה חלוקות, לא תמיד ניתן לספור את מספר הביו-מולקולות המופנמות לכל תא ישירות, במיוחד כאשר הביו-מולקולות מתפזרות במהירות או כאשר התאים נטענים ביותר מחמש ביומולקולות מסומנות.

ניתוח פוטו-הלבנה מבוסס תאים מאפשר להעריך את מספר הביו-מולקולות המסומנות לתא בתנאים כאלה. באמצעות כפתור הבחירה ביד חופשית, עקוב אחר קווי המתאר של תא פלואורסצנטי נתון וחלץ ושרטט את הקרינה של התא הגולמי כפונקציה של זמן עקב השפעות פוטו-הלבנה. גרף העוצמה לעומת הזמן יהיה עקומה יורדת באופן אקספוננציאלי, התאים העמוסים בכבדות, אך עבור תאים המכילים פחות מ-10 ביומולקולות, יש להבחין בצעדים ברורים.

חשב את האוטו-פלואורסצנציה הממוצעת לאחר פוטו-הלבנה על ידי חישוב ממוצע ערכי עוצמת הפלואורסצנט הגולמי ליד חלק קצה הזנב השטוח של הניסוי, שיכול להיות, למשל, מ-50 עד 100 מסגרות התמונה האחרונות בסדרת זמן-lapse. לאחר קביעת עוצמת הבסיס גם כן, חשב את עוצמת ההלבנה התלויה בזמן על ידי הפחתת האוטופלואורסצנציה הבסיסית מנתוני הקרינה הגולמיים, ולאחר מכן חסום את נתוני עוצמת ההלבנה המתקבלים וכמת את הגובה של כל שלב באופן ידני או באמצעות אלגוריתם. יש לחזור על תהליך זה עבור מספר תאים המציגים יותר מ-100 שלבים בסך הכל על מנת לקבל הערכה מדויקת של גובה הצעד הממוצע, ערך זה מתאים לעוצמת הפלואורו היחידה ארבע עקב הלבנה של פלואורו ארבע בודד.

לבסוף, ניתן לחשב את מספר המולקולות המופנמות לתא על ידי חלוקת עוצמת התא המופחתת הבסיסית בזמן שווה לאפס בפלואורו היחידתי. ארבע עוצמות לפרוטוקול אלקטרופורציה זה. ניתן לשלוט בכמות ה-DNA או החלבון המסומנים בפלואורסצנט שניתן להפנים לחיידקים או שמרים על ידי התאמת כמות בדיקות ה-DNA הקיימות בתוך מאגר האלקטרופורציה.

כאשר קצב ההפנמה הביו-מולקולרי גבוה, אורך חיי ההלבנה הפוטו-הלבנה של הביו-מולקולה המסומנת על ידי התוויית תחילה של עוצמת הפלואורסצנט כפונקציה של זמן ולאחר מכן חילוץ קבוע הזמן האקספוננציאלי שלה נותן מידע על יציבות הצילום של הצבעים in vivo. במקרה של שיעורי התאגדות נמוכים, קוונטיזציה של עוצמת הפלואורסצנט תספק אמצעי לקירוב המספר הכולל של ביומולקולות בתוך תא נתון. ניתן להשתמש באלקטרופורציה גם כדי לשלב חלבונים בחיידקים או בשמרים.

במקרה של חלבון עם תווית פלואורסצנטית. מכיוון שניתן להפנים את הפלואורופורים החופשיים עצמם ביעילות רבה, חשוב להסיר את כל הפלואורופורים החופשיים והלא מחוברים קוולנטית ממלאי החלבון. לבסוף, ניתן גם להפנים את הסימון הכפול על ידי המולקולות שלנו באמצעות השיטה שלנו כדי לאפשר תצפית על מולקולה בודדת בתאים חיים במשך מספר שניות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין ולנתח גם את דגימות הבקרה כגון תאים שאינם אלקטרו, אשר מודגרים עם ביומולקולה מסומנת או תאים ריקים, שאינם אלקטרופורטים או מודגרים עם מולקולה מסומנת. בקרות אלה מאפשרות לנו להעריך את רמת האוטופלואורסצנטיות של התאים ואת המחסור בשלבי השטיפה, וככאלה הם נחוצים כדי להעריך אם ניסוי האלקטרופורציה הצליח לאחר פיתוחיו. טכניקה זו פתחה אפיקים חדשים לחוקרים בתחום הביופיזיקה והביולוגיה השלישית לחקור את הדיפוזיה וההתנהגות הדינמית של ביומולקולת תווית במיקרואורגניזמים חיים.

וזה בטווח זמן אחד עד שניים יותר מאשר עם חלבונים אוטו-פלואורסצנטיים כמו GFPs. זה העביר את הגמישות של תיוג d אורגני in vivo מה שהפך את ניסויי האיום של מולקולה בודדת להרבה יותר אפשריים לחקר הדינמיקה התוך-מולקולרית והבין-מולקולרית בתאים חיים.