זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר באתר שימוש בשיטת TUNEL
16 בדצמבר 2014
סרטון זה מתאר דיסקציה, עיבוד רקמות, חתך ותיוג TUNEL מבוסס פלואורסצנטי של שריר השלד של העכבר. הוא גם מתאר שיטה לניתוח אוטומטי למחצה של תיוג TUNEL.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שברי DNA ומוות תאים ב-C שתיים. זה מושג על ידי קטעי רקמת סלסול ראשונים כדי לאפשר לריאגנטים של מנהרה להיכנס לגרעין התא. אנזים TDT הבא משמש לחיבור קוולנטי של DTPs לשלושה קצוות ראשוניים של שבירות DNA בתאים אלה.
ואז ה-DUTP מתויג עם בדיקה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, האות החיובי של המנהרה מכומת בקטעי רקמה המשקפים את התדירות היחסית של שבירות DNA בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כתמים דרומיים או אימונוהיסטוכימיה, הוא שהיא ספציפית מהירה יחסית ומספקת דרך לחסל רעש ואוטופלואורסצנטיות.
התחל בקיבוע גפיים אחוריות מבודדות ב-4%Para formaldehyde ב-PBS בצינור של 15 מיליליטר מאפשר לקיבוע להימשך ארבע עד לכל היותר 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. נדרשות רק שעתיים אם הרקמה עוברית. עם זאת, לאחר הקיבוע, החלף את התמיסה בסוכרוז של 10% כדי להגן על הרקמה ולדגור אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, החלף את התמיסה לסוכרוז 30% מסונן סטרילי והמשיך את הדגירה למשך הלילה או עד שהגפיים האחוריות שוקעות לתחתית הצינור. בעת ההטבעה, חשוב שהגפיים האחוריות יהיו שקועות לחלוטין במדיום ההטבעה. ניתן להניח את תבניות ההטבעה ישירות על קרח יבש או באיזופ פנטן על קרח יבש כדי להקפיא את המדיום.
בעת הקפאה. הבלוקים חותכים קטעי העברה בעובי 10 מיקרון או דקים יותר, קטעים עבים יותר לא יחדרו על ידי ריאגנטים לתיוג המנהרה. אסוף את החלקים הדקים הללו על גבי שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין או וקטור בונד בטמפרטורת החדר.
מהר מאוד, העבירו את המגלשות לקרח יבש לאחסון. ראשית יש להפשיר שקופית של רקמה קפואה לטמפרטורת החדר ולתת לה להתייבש במשך 16 עד 64 שעות. לאחר שהמגלשה בטמפרטורת החדר, החזירו את החלק לצנצנת צימוד מלאה ב-PBS למשך 10 דקות.
חזור על שלב ההתייבשות הזה פעם אחת, ולאחר מכן יבש בזהירות את השקופית עם מגבון מעבדה מבלי להפריע לחלק הרקמה כדי לחלחל את הקטע, הנח את השקופית בתא לחות ופיפטה 50 מיקרוליטר של ריאגנטים מסחריים על בסיס ספונין שאינם פרוטאוליטיים על הקטע. אין לתקוע פיפטה ישירות על החלקים מכיוון שהיא עלולה להתנתק או להינזק. לאחר מכן הניחו חתיכה קטנה של סרט פרה מעל החלק כדי לפזר את המגיב.
אם נוצרות בועות, יש למרוח מחדש את סרט הפרה. תן למגלשה לדגור במשך שעה אחרי שעה. הסר את הריאגנטים באמצעות שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS וייבש אותו בזהירות.
לצד התווית שבירות DNA על ידי TDT, השתמש בערכה זמינה מסחרית. ראשית, הפוך את מאגר ה-XTDT האחד ופיפט מעל הקטע. לאחר מכן דגרו את המגלשה למשך חמש דקות בתא הלחות.
שנית, הכינו תערובת תיוג TDT בהתאם להוראות הערכה או שקופית בקרה חיובית. הוסף DNA לתערובת התיוג TDT. עבור שקופית בקרה שלילית, השמיט את אנזים ה-TDT מהתערובת.
כעת בעזרת מגבון, הסר כמה שיותר חיץ מהמגלשה ופיפטה אותו על תערובת התיוג. 50 מיקרוליטר אמורים להספיק. שוב, מורחים את התמיסה עם פרפורם מבלי ליצור בועות.
תנו למגלשה לדגור בתא למשך שעה עכשיו ב-37 מעלות צלזיוס. שלישית, צור את מאגר העצירה האחד לפי הוראות הערכה. לאחר הסרת תערובת התיוג עם מגבון המעבדה, הוסף בין שניים ל -300 מיקרוליטר מתערובת העצירה כדי לכסות לחלוטין את הקטע.
לאחר מכן דגרו את המגלשה למשך חמש דקות בתא. בשלב זה לא נעשה שימוש בסרט פרה. כדי להסיר את מאגר העצירה, השתמש בשתי שטיפות של שתי דקות ב-PBS.
עכשיו פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת תיוג פלואורסצאין טרי שהוכנה. על המגלשה, מרחו פרפיל ודגרו במשך 20 דקות בתא, אך כעת בחושך. הסר את תמיסת התיוג בשטיפה אחת של שתי דקות ב-PBS בזמן הכביסה ודלל כמה ווים.
3 3, 2, 5 8 למיקרוגרם אחד למיליליטר ב- PBS. לאחר השטיפות, מכסים את החלקים באחד עד 200 מיקרוליטר מתמיסת הווים המדוללת. לאחר מכן דגרו את המגלשה למשך חמש דקות, מוגנת מאור כדי להסיר את הווים להכתים, השתמשו בשלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBS.
לאחר מכן יבש בזהירות את השקופית עם מגבון מעבדה והחל פתק כיסוי להדמיה. דמיין את הקטע באמצעות מסנני dpi, fitzy ואדום טקסס כדי להפריד את אותות כתמי הווים, כתם המנהרה והאוטופלואורסצנטי לשלושה ערוצי צבע כוזבים בתמונה אחת. תקנן ושמור על אותן הגדרות הדמיה בין כל השקופיות כך שניתן יהיה להשוות אותן בקלות.
אל תשתמש בהגדרות חשיפה או רווח אוטומטיות לעיון אנטומי. השתמש בתמונת שדה בהיר של קטע גפה אחורית סמוך מוכתם ב-h ו-e בתוכנת ניתוח התמונה. כבה את ערוץ המנהרה.
לאחר מכן עקוב ידנית אחר קווי המתאר של אזור השריר שיש לכמת באמצעות הערוצים האחרים. המירו את אזור העקיבה למסיכה. לאחר מכן הפעל שוב את תעלת המנהרה והתאם את סף העוצמה המינימלי כדי לא לכלול אות אוטו-פלואורסצנטי.
השתמש באותה מגבלת סף בכל הסעיפים שנותחו במחקר. לאחר מכן, המירו את פיקסלי הסף למסיכה. בכל תמונה, שלב את מסכת אזור השרירים ומסכת מנהרת הסף.
זה מייצג את אות המנהרה בתוך אזור השריר המעקב. כעת כמת את המסכה המשולבת כדי לקבוע את מספר האובייקטים החיוביים במנהרה ואת שטח הפיקסלים הכולל של אות המנהרה בתוך השריר. השתמש בערכים אלה לניתוח סטטיסטי.
עצמים חיוביים מנהרה שהגדלה נמוכה עשויים להופיע כשברים בהירים לא סדירים בשריר השלד. עם זאת, בהגדלה גבוהה יותר, יש להבחין בכמה עצמים חיוביים במנהרה עם המורפולוגיה האפופטוטית הקלאסית אם סוג מוות התאים היה מעורב באפופטוזיס זה. הבקרה החיובית עם תוספת DNA D אמורה להציג אות חיובי מנהרה בשפע המופץ באופן אחיד על פני כל הרקמות.
במקטע. הבקרה השלילית ללא אנזים TDT צריכה להיות בעלת רקע בעוצמה נמוכה ולהראות רק אוטופלואורסצנטיות. עם הפרוטוקול המתואר, נמצא כי תאי העצם והאנדותל של RBC תרמו לאות האוטו-פלואורסצנטי בקטעי הגפיים הגבוהים המוכנים.
האות החיובי האמיתי של המנהרה היה הרבה יותר אינטנסיבי. ניתן לבודד אותו מהאות האוטו-פלואורסצנטי באמצעות סף עוצמת פיקסלים. אפשרות נוספת לבודד את אות המנהרה הייתה להחסיר דיגיטלית את תעלת האוטופלואורסצנטיות האדומה מתעלת המנהרה.
באמצעות טכניקה זו, מוות של תאי שריר השלד. במודל עכבר של SMA הוערך, תיוג מנהרה חשף יותר תאים אפופטוטיים בעכברי SMA בני חמישה ימים מאשר בביקורת. על ידי כימות צביעת המנהרה, תצפית זו הוכחה כמובהקת סטטיסטית עבור קבוצות שרירים מרובות בתוך הגפה האחורית.
לאחר שליטה, ניתן לבצע את טכניקת המנהרה תוך כארבע שעות כדי לייצר תוצאות כמותיות אמינות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מציג שיטה לזיהוי שברים ב-DNA ומות תאים בשריר שלד של עכבר באמצעות סימוני TUNEL. הסרטון מפרט את שלבי הניתוח, עיבוד הרקמה והניתוח החצי-אוטומטי הכלולים בטכניקה זו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- היסטולוגיה
רקע
- הבנת שברים ב-DNA היא קריטית לחקר מוות תאי.
- סימון TUNEL הוא שיטה ספציפית לזיהוי שברים אלו.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות איטיות יותר ופחות ספציפיות.
- טכניקה זו שואפת לשפר את מהירות ודיוק הזיהוי.
מטרת המחקר
- אספקת שיטה מהימנה לכימות שברים ב-DNA בחתכי רקמה.
- שיפור ההבנה של מנגנוני מוות תאי.
- הצעת חלופה מהירה יותר לשיטות קיימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של שריר שלד של עכבר.
- עיבוד רקמות להכנת דגימות לניתוח.
- סימון TUNEL מבוסס פלואורסצנציה לזיהוי שברים ב-DNA.
- ניתוח חצי-אוטומטי לכימות אותות חיוביים ל-TUNEL.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של שברים ב-DNA ברקמת שריר.
- כימות של אותים חיוביים ב-TUNEL המשקפים מוות תאי.
- הדגמה של מהירות וספציפיות השיטה.
- השוואה לשיטות מסורתיות המדגישה את היתרונות.
מסקנות
- שיטת הסימון ב-TUNEL יעילה לחקר מוות תאי.
- גישה זו יכולה לשפר את המחקר בביולוגיה של השריר.
- היא מספקת כלי בעל ערך למחקרים עתידיים על נזקי DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי נזק ל-DNA בשריר השלד מספק תובנה מכניסטית לגבי נתיבי מוות תאי הרלוונטיים למודלים של מחלות נוירו-מוסקולריות ולהערכת יעילות טיפולית. שיטת ה-TUNEL מאפשרת מדידה כמותית וניתנת לשחזור של אפופטוזיס בחתכי רקמה, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובזיהוי מועמדים בשלב הגילוי הפרה-קליני. באמצעות בידוד האות האמיתי מאוטופלורסצנציה על ידי חיסור ערוצים דיגיטלי, הבדיקה משפרת את הביטחון החזוי באישור המנגנון הפתולוגי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי אישור של נזק ל-DNA כמנגנון פתולוגי במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה ישירה של מוות תאי ברקמות רלוונטיות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות יעילות האפופטוזיס של התערבויות טיפוליות in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר מדידות כמותיות וסטנדרטיות של אות TUNEL-positive עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- שחזור: כימות חצי-אוטומטי מבטיח זיהוי אות עקבי בין חיתוכים וקבוצות ניסוי.
- הפחתת רעש: חיסור ערוץ דיגיטלי מוציא אוטופלואורסצנציה, ובכך משפר את הרגישות והמהימנות של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: יושם במודלים של עכברים עם SMA להערכת מוות של תאי שריר שלד, ובכך הוכיח תועלת תרגומית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאשר את מעורבות האפופטוזיס בתמותת התאים, ובכך מפחית עמימות בניתוח המסלולים.
- רציפות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור בין מודולציה של מטרה לתוצאות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ומספקת מדדים כמותיים של אפופטוזיס המנחים החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go).
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות על ידי זיהוי שברים ב-DNA והבהרת מנגנוני מוות תאי בשריר השלד.
- סריקה: מספק תוצרים כמותיים המוכנים לבדיקה לצורך הערכת השפעות של תרכובות על אפופטוזיס ברמת הרקמה.
- אנליטיקה: מייצר מסכות אות מבוססות סף וספירות אובייקטים המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי התגליות לתיקוף פרה-קליני באמצעות מידול אפופטוזיס רלוונטי למחלה בשריר עכבר.
- שימוש חוזר ארגוני: מקיים פלטפורמה מבוססת פלואורסצנציה לשימוש חוזר לצורך זיהוי אפופטוזיס בסוגי רקמות ובמודלים של מחלות מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית סביב נתיבי מוות של תאים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות הגדרות דימוג קבועות וכמתור חצי-אוטומטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור החלטות מוקדמות של go/no-go המבוססות על נתונים לגבי יעילות האפופטוזה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכון על ידי כימות ההשפעה הטיפולית על נזקי DNA ומוות של תאים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, חיתוך רקמות ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בשימוש בקריוסטט, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותוכנה לניתוח תמונות עם יכולות להפרדה בין ערוצים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע, הטמעה וחיתוך בין צוותים שונים.
- חובה להתחשב באוטופלואורסצנציה ספציפית לרקמה ממקורות כגון RBCs, עצם ותאים אנדותליאליים.
- מוגבל על ידי ארטיפקטים הנגרמים מעיבוד הרקמה, העשויים להשפיע על יעילות אנזים ה-TdT ועל יחס האות לרעש.
