Name: מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב Saccharomyces cerevisiae שימוש ב Rpb1-1 זנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: למדו למדוד שיעורי ריקבון mRNA ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות שימוש בזנים Rpb1-1 רגישי לטמפרטורה. שיטה זו מאפשרת ניתוח יציבות mRNA ותרומה להבנת רגולציית ביטוי גנים בחיידקי שמרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר במעבדה של המחבר נתמך על ידי תוכנית המחקר המתקדם של נורמן האקרמן של מועצת התיאום להשכלה גבוהה של טקסס וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת ביילור.

1. צמיחה של תאי שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את זני שמרים המתאימים כדי להיות מנוצלת למדידות קצב דעיכת mRNA. לעכב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, להשתמש זני שמרי מחסה המוטציה rpb1-1 1. להשיג שמרי זן זה ממעבדה שיש אחד כבר, או ליצור אותו במעבדה תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית אם נדרש רקע גנטי ספציפי 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, להכין שמרי מדיה באמצעות נהלים סטנדרטיים 10. אם לא נדרשת בחירה, להכין מדיה עשירה כגון YPD. לחלופין, להכין תקשורת סלקטיבית אם תאי השמרים הופכים עם פלסמידים ובחירה נדרש. החיטוי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תאי שמרים על 28 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה מתירנית לזן שמרים זה. לעשות זאת בשני שלבים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לO הראשון / N, לגדול תאי השמרים ב 5 מיליליטר של תקשורת צמיחה לרוויה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת O השני / N בסופו של היום השני. לO השני / N, לחסן כמויות שונות של תאי שמרים מO ​​הראשון / N ל100-150 מיליליטר של תקשורת צמיחה (הנעה בין 100 μl למיליליטר 1, 2 מיליליטר או יותר, תלוי מתי תאי השמרים צריכים להיות שנקטפו ביום שלמחרת). לעשות את הצעד הזה כדי להבטיח שאחד מהתרבויות הוא בOD הנכון 600 היום הבא. </li></ol></li></ol> 2. קציר תאי השמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לקצור את תאי שמרים. העיתוי לצעד זה הוא קריטי; תווית כל הצינורות הנדרשים ולאסוף את כל הציוד וחומרים הדרושים במקום אחד. מחממים אמבט מים ל -39 מעלות צלזיוס ומחמם שתי 15 מיליליטר מבחנות של תקשורת הצמיחה על 28 מעלות צלזיוס ועל 60 מעלות צלזיוס. הערה: 15 מיליליטר צמיחת תקשורת הנפח יכול להיות מגוון בהתאם למספר נקודות זמן התאים להיות שנקטפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את תאי שמרים, כאשר הם מגיעים OD 600 של 0.4 ל -0.7. Transfאה התאים - 4 מיליליטר 6 סטרילי 50 בורג בקבוקי כובע. צנטריפוגה ב 7500 XG בצנטריפוגה במהירות גבוהה במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend את כדורים ב -15 מיליליטר תקשורת הצמיחה שequilibrating על 28 מעלות צלזיוס. בריכת תאי שמרים בבקבוק 250 מיליליטר סטרילי אחד ולאזן אותם ל~ 5 דקות בטמפרטורת הגידול של 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמרי התאים equilibrated בטמפרטורת הצמיחה, מייד להוסיף 15 מיליליטר של תקשורת צמיחת equilibrated ב 60 ° C כדי להעלות את הטמפרטורה ל -39 מעלות צלזיוס (טמפרטורת nonpermissive) ומקום באופן מיידי את הבקבוק באמבט המים C ° 39 . ודא שמדיום התרבות נשאר באמבט המים C ° 39 בכל שלבי איסוף תאים שנותרו על מנת להבטיח כי השעתוק כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים בזמנים שונים לאחר הצבת הבקבוק באמבט המים C ° 39. לנקודת הזמן הראשונה, לקצור את התאים מייד לאחר הצבת הבקבוק ב 39 &amp; #176; C. קציר aliquot 3 מ&quot;ל ולהפיץ 3 מיליליטר לשני, 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. גלולה התאים במשך 10 שניות בצנטריפוגה מיני או picofuge עם האטה מהירה ולשפוך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להקפיא את גלולה באמבט קרח / אתנול יבש או בחנקן נוזלי. לייעד את נקודת הזמן הראשונה התאים נקצרים כבנקודת זמן אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי לקבוע את נקודות זמן התאים נקצרים בלאחריו על ידי ניסוי פיילוט, בהתאם לmRNAs של עניין. בדרך כלל, תאי שמרי קציר בנקודות הזמן הבאים: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 ו -35 דק &#39;(איור 2). אם זמן מחצית החיים mRNA לא ניתן לקבוע באמצעות נקודות הזמן שצוינו לעיל, להתאים נקודות הזמן הללו. לדוגמא, לmRNAs עם זמן מחצית חיים קצרים צפוי, להשתמש בנקודתי זמנים קצרות יותר, (כלומר, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ו -18 דקות) ולmRNAs עם זמן מחצית חיים ארוכים צפוי, להאריך נקודות הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים חהrvested, לאחסן אותם במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד מיצוי RNA מתבצע. </li></ol> 3. RNA חלץ מתאי השמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חלק מיצוי RNA של הפרוטוקול, להשתמש RNase טכניקות חופשיות כדי למנוע השפלה של RNA על ידי RNases. הכן RNase פתרונות חופשיים, כלי זכוכית וכלי פלסטיק לשימוש במיצוי של RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את RNA מתאי השמרים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בדרך כלל, משתמש בשיטת פנול החמה 12. לחלופין, להשתמש בערכות שיכולים לשמש כדי לחלץ RNA מתאי שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות וטוהר של RNA, בדרך כלל על ידי מדידת הספיגה ב 260 ושל 280 2 μl של RNA באמצעות Nanodrop. קבע את הריכוז של RNA מ260. בהתבסס על הריכוז, לדלל את RNA עד 1 מיקרוגרם / μl שימוש במים שטופלו DEPC. הערה: היחס של 260/280 מספק מידע על tהוא טוהר RNA. מדגם RNA הוא טהור אם היחס 260/280 הוא 2.0 ± 0.1. </li></ol> 4. צפון כתם ניתוח הערה: השתמש בכתמים הצפוניים לכמת רמות ה- mRNA ולקבל מידע על הגודל של התמלילים. בנוסף, שימוש בכתמים צפוני כדי לזהות mRNAs המייצרים isoforms מרובה של אותו mRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.0% ג&#39;ל agarose-פורמלדהיד. הפעל כמויות שווה של RNA המדגם על הג&#39;ל פורמלדהיד agarose ידי אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. הפעל סולם RNA לצד דגימות RNA ולהשתמש בו כדי לקבוע את הגדלים של RNA שאותרו על הכתם הצפוני. לפני העברת RNA מופרד על הג&#39;ל פורמלדהיד agarose לממברנה, לחתוך את הנתיב עם סולם RNA מן הג&#39;ל ולדמיין באמצעות רומיד ethidium. הערה: לחלופין, את כל הג&#39;ל ניתן מוכתם ברומיד ethidium לפני העברת RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">דגימות חרו RNA היגרו למרחק מתאים על הג&#39;ל, להעביר את RNA לממברנה באמצעות RNase טכניקות חופשיות. השתמש באחת מכמה פרוטוקולים זמינים להעברת RNA לממברנות 12-13. כדי להעביר את RNA לממברנה, לחתוך את הקרום לבערך באותו גודל כמו ג&#39;ל. העבר את RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV קשר צולב RNA לממברנה באמצעות crosslinker UV הבא הוראות היצרן. לחלופין, לאפות את הקרום בתנור בחום עד 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. אחסן את הקרום ב -20 ° C בשקית ניילון ללא הגבלת זמן עד שהוא הכלאה לבדיקות ספציפיות. הערה: הקרום היבש גם יכול להיות מאוחסן על RT בין ניירות לסנן. </li></ol> 5. בדיקות להכליא משלים לRNA של ריבית לממברנה הערה: דרך אחת לגלות mRNA על הקרום היא להכליא בדיקות DNA שכותרתו 32 P. זהירות: Researchers עבודה עם 32 P צריך להשתמש נהלי הגנה על מנת למנוע זיהום. פעל לפי הנחיות מוסדיות על שימוש בחומר רדיואקטיבי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הבדיקה DNA על ידי תיוג 25-50 ng של DNA להיות הכלאה הקרום על פי פרוטוקולים סטנדרטיים 12. צור קטע DNA על ידי PCR או עיכול פלסמיד. לקבוע את הפעילות הספציפית של חללית DNA על ידי ספירת 1 μl של חללית DNA radiolabelled לאחר נוקלאוטידים מאוגדים יוסרו 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר prehybridization / הכלאה מחממים על 42 מעלות צלזיוס. השתמש ~ 10 מיליליטר של חיץ prehybridization / הכלאה לכל 100 סנטימטר 2 של הקרום 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכליא 1-5 x 10 6 עותקים לדקה של הבדיקה DNA radiolabeled לכל מיליליטר של חיץ הכלאה לO הקרום / N בתנור הכלאה כדי לזהות את ה- mRNA של עניין 12. ודא כי בהכלאת סיבוב תנור ההכלאה הוא בכיוון זהגורם כל הקרום להיחשף לפתרון ההכלאה, על מנת להבטיח הכלאה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה פעמיים ב RT במשך 15 דקות עם 50 מיליליטר של 2x SSPE ופעם אחת על 65 מעלות צלזיוס עם 50 מיליליטר של 2x SSPE / 2% SDS במשך 15 דקות 12. עטוף את הקרום בניילון הנצמד, כדי להבטיח שזה לא יתייבש או לזהם את המסך זרחני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במונה גייגר, להעריך את עוצמת הקרינה רדיואקטיבית על הממברנה. הערה: הערכה זו מבטיחה כי הקרום חשוף למסך זרחני לכמות המתאימה של זמן. השתמש בזמני חשיפה ארוכים יותר לממברנות עם כמויות נמוכות של רדיואקטיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכתמים הצפוניים, להשתמש שליטת טעינה כדי לוודא שכמויות שווה של RNA מועמסות על כל נקודה. כדי לעשות זאת, להפשיט את הקרום וreprobe זה עם RNA שאינו מושפע מנבחנים התהליך. להפשיט את הקרום על ידי הצבתו במגש זכוכית המכיל 200 מיליליטר של רותח (0.1% הפשטת פתרון SDS / 0.01 XSSC) למשך 2 דקות. יוצקים את פתרון הפשטה ולחזור על התהליך חמש פעמים 12. הערה:. דוגמא של RNA המשמש כביקורת טעינה היא SCR1 SCR1 הוא תעתיקי הרנ&quot;א פולימראז III שהוא יציב ושופע שפע RNA SCR1 לא צריך לשנות באופן משמעותי בתקופות קצרות של RNA פולימראז II עיכוב.. </li></ol> 6. לכמת את RNA, כי הוא חייב ממברנה הערה: כדי לכמת את כמות הרדיואקטיביות על קרום, לחשוף את הקרום למסך זרחני. לאחר זמן החשיפה המתאים, לסרוק את המסך זרחני באמצעות phosphorimager. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המסך זרחני באמצעות ההוראות הניתנות על ידי היצרן של phosphorimager. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ה- mRNA בכל נקודת זמן. לכמת רמות ה- mRNA באמצעות תוכנת ImageQuant או תוכנה קשורה. לנרמל את ה- mRNA בכל נקודה לטעינה מלאה זמן. אם SCR1 שימש הטעינהשליטה, לנרמל את northerns מחצית החיים לSCR1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן מחצית החיים של mRNA מחושבים על ידי חלוקת הסך של mRNA שנותר בכל נקודה בסך של mRNA זמן הווה בנקודת זמן 0 (נקודת הזמן הראשונית). גרף mRNA האחוזים הנותר לעומת זמן על מגרש semilogarithmic (איור 2 ג). חישוב זמן מחצית חיים mRNA על ידי המשוואה הבאה: t 1/2 = -.693 / k (שלילי .693) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> k הוא השיפוע של הקו בכושר הטוב ביותר ולא 1/2 הוא זמן מחצית החיים mRNA. </li></ol>

<ol><li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li>
<li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li>
<li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+thiolutin%2C+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.</li>
<li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.</li>
<li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li>
<li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li>
<li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li>
<li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMD%3A+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li>
<li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Polymerase+II+subunit+composition%2C+stoichiometry+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).</li>
<li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li>
<li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

עיכוב של סינתזת mRNA וניטור מחזור mRNA בהעדר הסינתזה החדשה הוא שיטה המשמשת לעתים קרובות כדי למדוד שיעורי ריקבון mRNA. בS. cerevisiae, מדידת שיעורי ריקבון mRNA על ידי עיכוב שעתוק באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר בשימוש. שיטה זו במיוחד מעכבת RNA פולימראז II. השלבים הקריטיים ביותר לקביעת שיעורי ריקבון mRNA באמצעות טכניקה זו הם: 1) לפני קצירת תאי שמרים, להבטיח שעתוק שכבר כבה על ידי שמירה על התרבות ב 39 ° C; 2) במהלך שלבי אלקטרופורזה ...

השעתוק והריקבון של mRNA הספציפי הם גורמים מכריעים של ביטוי גנים. שיעור הסינתזה והריקבון של mRNAs הספציפי קובע את הרמה יציבה של mRNA המסוים. רמות המצב היציב של mRNAs לשלוט בשפע של mRNAs ולקבוע כמה כל mRNA זמין עבור סינתזה של חלבונים. מדידות של מחצית חיים mRNA נמצאות בשימוש נרחב על מנת לקבוע את קצב הדעיכה של mRNAs. ריקבון mRNAs ספציפי בשיעורים שונים הקשורות לתכונות של mRNA, הפונקציה של החלבון מקודד על ידי ה- mRNA והתנאים הסביבתיים. בהתאם לטכניקה מנוצלת כדי לקבוע שיעורי ריקבון mRNA, ניתן לקבוע מדידות קצב דעיכה אם באופן גלובלי או לתמלילים בודדים. בשמרים ס cerevisiae, הטכניקות ההנפוצות ביותר המשמשות למדידת שיעורי ריקבון mRNA הגלובלי כולל ניצול זן שמרי מחסה אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II וtransc הכימימעכבי riptional כגון thiolutin ו1,10-phenanthroline 1-5. יכולים גם להיות מנוצלים שיטות אלו למדידת שיעורי ריקבון mRNA פרט 4. יכולים גם להיות מנוצלת שיטות אחרות למדידת שיעורי ריקבון mRNA. שיטות אלה גישה לתיוג מצב יציב או ניצול של מולקולות mRNA שבאות לידי ביטוי מאמרגן בפיקוח המתבטא רק בתנאים בחרו לכלול. לכל אחת מהטכניקות הללו יתרונות ומגבלות מסוימים. הטכניקה המתוארת כאן מנצלת את האלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. שיטה זו משתמשת S. cerevisiae כמודל, אבל יכול שונו ומנוצל במערכות אחרות תוך שימוש בטכניקות עיכוב תעתיק ספציפי 6. מדידות זמן מחצית החיים mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II נמצאות בשימוש נרחב עבור שני מדידות הגנום ובודדים של mRNA ריקבון 4-5. טכניקה זו דורשת שימוש בspecifזן שמרי ic שמטפח אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1 1. הרציונל לטכניקה זו הוא שחשיפה של טמפרטורת זן שמרים רגיש לטמפרטורת nonpermissive מעכבת סינתזת mRNA. בהמשך לכך, דעיכה של mRNA preexisting מנוטרת בנקודות זמן שונות לאחר השעתוק כבר עכבות. היעלמותו של mRNA preexisting מנוטרת על ידי חילוץ RNA מתאי השמרים בנקודות זמן שונה לאחר השעתוק בוטל. נקודות הזמן שבו תאי השמרים נקצרים קבועות מראש על ידי ניסוי פיילוט, ותלויות בפרוטוקולים ובמערכת נחקרות. נקודות זמן מהירות יותר משמשות לתמלילים קצרים ימים, ואילו נקודות זמן ארוכות יותר משמשות לתמלילים כבר חיו. לאחר מכן, הריקבון של mRNA מנוטר על ידי שני ניתוח הכתם הצפוני, PCR כמותי או RNAseq. מדידה של זמן מחצית חיים mRNA באמצעות teאלל רגיש mperature של RNA פולימראז II יש את היתרונות שלה. ראשית, טכניקה זו היא קלה וישר קדימה. שנית, ברגע שזן השמרים נרכש או שנוצר במעבדה ניתן לקבוע מדידות זמן מחצית החיים mRNA בתנאי גידול שונים; מאפשר קביעת ההשפעה סביבתית על ריקבון mRNA. שלישית, ניתן לנטר שיעורי ריקבון mRNA הגנום. שימוש בטכניקות עיכוב שעתוק אחרים יש גם יתרונות ומגבלות. לדוגמא, שימוש במקדם מושרה דורש subcloning לייצר mRNA שנמצא תחת השליטה של ​​האמרגן המוסדר. Thiolutin הוא לא זמין ויקר כאשר זמין. בנוסף, המצב של thiolutin פעולה אינו מובן לחלוטין וזה כבר דווח להשפיע תהליכים תאיים אחרים, כולל עיכוב ריקבון mRNA 7. לחלופין, 1,10-phenanthroline, הוא יותר זמין. יתר על כן, כל הטכניקות המשמשים ללעכב שעתוק יכול חצוףUrb פונקציה סלולרית ויכול להשפיע על mRNAs שונה בדרכים שונות. חוקר צריך לקבוע את השיטה המתאימה ביותר לשימוש בתנאי הניסוי שלהם כדי להשיג את התוצאות הכי אמינות. כדי לקבוע איזו שיטה המתאימה ביותר ליישום שלהם, חוקר צריך לזהות את התמלילים ותפקוד של החלבונים המקודדים על ידי התמלילים נחקרים. מדידות קצב דעיכת mRNA אמינות ביותר הן אלה הנקבעים תוך שימוש בטכניקות מרובות ולהראות את אותו שיעור הריקבון. אין טכניקה אחת היא תמיד הטובה ביותר, ואת הטכניקה המתאימה ביותר תלויה במצב הספציפי. מחקרים רבים בS. cerevisiae מדד שיעורי ריקבון mRNA בתנאים שונים ורקע גנטי. התנאים ששיעורי ריקבון mRNA נמדדים בתלויים בניסוי הספציפי הנחקר. מדידת שיעורי ריקבון mRNA בסביבות סלולריות שונות קובעת אם התנאים שבדקתי מעדיף להשפיע על שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי. שיעורי הריקבון של mRNAs יכולים גם משתנים בהתאם לזן השמרים בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבוע שיעורי ריקבון mRNA בתאי שמרים wild-type ותאי שמרים עם מסלול nonfunctional השפלה mRNA בתיווך שטויות (NMD). מסלול השפלה mRNA זה נמצא בכל יצורי אוקריוטים שנבדקו עד כה והיא מפעילה את ההשפלה של mRNAs שבטרם עת לסיים תרגום 8. NMD תחילה זוהה כמסלול שמבזה mRNAs עם קודונים סיום מוקדמים או קודונים שטויות, אבל מוכר כיום כמסלול שגם מסדיר את הביטוי של אי-שטויות מכילות mRNAs הטבעי. mRNAs שהם מטרות של המסלול מפורק במהירות בתאי שמרים עם מסלול NMD פונקציונלי והתייצב בתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional. כך, זמן מחצית החיים של mRNAs שהם מטרות ישירות של מסלול זה הם קצרים יותר בשמרים cel wild-typels בהשוואה לתאי שמרים עם מסלול NMD nonfunctional.

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה במהירות גבוהה</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Genescreen Plus ממברנה</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>מסך זרחן</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon phosphorimager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>לחלופין ניתן לאפות את הממברנה בתנור המכוון ל-80&deg; למשך שעה</td></tr><tr><td>אחת NorthernMax מאגר קדם-היברידיזציה/הכלאה&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>זני שמרים המכילים את המוטציה</td><td></td> rpb1-1 <td>זני שמרים ניתן להשיג ממעבדה או ליצור עם רקע</td><td></td> ספציפי</tr></tbody></table>

מדידת שיעורי ריקבון mrna ב<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; rpb1-1</em&gt; זנים

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

רמות מצב יציב mRNA משתנות בהתאם לתנאי סביבה. הסדרת רמות הצטברות מצב היציב של mRNA מבטיחה כי הסכום הנכון של חלבון מסונתז עבור תנאי הגידול הספציפיים של התא. גישה אחת למדידת שיעורי ריקבון mRNA היא עיכוב שעתוק ולאחר מכן ניטור היעלמותו של mRNA שכבר קיים. קצב דעיכת mRNA לאחר מכן ניתן לכמת, ומחצית חיים מדויקים ניתן לקבוע תוך שימוש במספר טכניקות. בS. cerevisiae, פרוטוקולים המודדים mRNA מחצית חיים פותחו וכוללים עיכוב שעתוק של mRNA באמצעות זנים כי נמל אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II, rpb1-1. טכניקות אחרות למדידת mRNA מחצית חיים כוללים עיכוב שעתוק עם מעכבי תעתיק כגון thiolutin או 1,10-phenanthroline, או לחלופין, על ידי ניצול mRNAs שנמצאות תחת השליטה של ​​אמרגן ויסותכמו-off TET מערכת אמרגן והעין מתנהלת גלקטוז. כאן אנו מתארים מדידה של ס &#39; שיעורי ריקבון cerevisiae mRNA באמצעות אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז II. טכניקה זו יכולה לשמש כדי למדוד את שיעורי ריקבון mRNA של mRNAs או הגנום האישי.

<html> היכולת של פרוטוקול זה כדי למדוד במדויק שיעורי ריקבון mRNA תלוי בעיכוב של שעתוק, הקצירה של תאי שמרים בנקודות הזמן המתאימות, ושימוש בטכניקות חופשיות RNase תוך חילוץ RNA וסופגים צפוני. חיטוט לשני mRNAs השליטה ידוע להיות לא יציב ויציב, בהתאמה, מספק ביטחון כי הניסוי עבד. לדוגמא, זה יכול להיות מושלם על ידי חיטוט עם בדיקה שמזהה שני CYH2 מראש mRNA וmRNA. איור 2 מראה את היעלמותה של CYH2 הרנ&quot;א הראשוני בwild-type וזני שמרי מוטציה NMD בנקודות זמן ...

רמת המצב היציב של mRNAs הספציפי נקבעת על ידי קצב הסינתזה והריקבון של mRNA. שיעורי השפלה mRNA הגנום או שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי יכולים להימדד על ידי קביעת זמן מחצית חיים mRNA. פרוטוקול זה מתמקד במדידה של שיעורי ריקבון mRNA בSaccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את שיעורי דעיכת ה-mRNA בשמרים Saccharomyces visi. זה מושג על ידי גידול תאי שמרים לרישום שלב בטמפרטורה המתירנית. לאחר מכן, התאים מועברים לטמפרטורה גבוהה יותר שבה מעוכבת סינתזת ה-mRNA הכוללת.לאחר מכן נקצרות דגימות שמרים בנקודות זמן קבועות מראש עבור כל דגימה. ה-RNA הכולל מופק מופרד על ידי אלקטרופורזה של ג'ל, ומועבר לממברנה. לבסוף, הכלאה צפונית מבוצעת כדי לוודא כל שינוי ברמות ה-mRNA כפונקציה של זמן.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי למדוד את שיעורי דעיכת ה-mRNA של mRNA בודדים או של הגנום בתנאי גידול שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום דעיכת RNA, כגון DO שיעורי דעיכת RNA משתנים בתנאים תאיים שונים וברקע גנטי. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה מייגן פלי, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, הכינו תרבית התחלה על ידי חיסון מושבת שמרים בודדת לחמישה מיליליטר של מצע סלקטיבי מתאים לזן הנבדק. אם הזן מכיל אלל רגיש לטמפרטורה של RNA פולימראז 2, גדל את התאים לרוויה למשך הלילה בטמפרטורה מתירנית של 28 מעלות צלזיוס. למחרת, הקימו סדרה של תרביות לילה גדולות יותר, כל אחת בנפח כולל של 100 עד 150 מיליליטר וחיסנו כמויות שונות של תרבית ההתחלה למצע הגידול.ניתן להסיק את טווח גורם הדילול האופטימלי אם ידועים גם זמן הכפלת הזן וגם זמן הגידול הכולל. גדלו את התרביות החדשות למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ביום השלישי ולפני קציר התאים. מחממים מראש שני צינורות המכילים 15 מיליליטר של מדיה טרייה ב-28 מעלות צלזיוס ו-60 מעלות צלזיוס בהתאמה.כמו כן, חממו מראש אמבט מים ייעודי ב-39 מעלות צלזיוס בזמן הקציר המתוכנן. מדוד את ה-OD 600 של כל התרבויות. בחר את הבקבוק המכיל תאים בגידול שלב לוג והעביר את כל תכולתו למספר צינורות סטריליים של 50 מיליליטר.סובבו את התאים במשך חמש דקות בחדר, טמפרטורה, צנטריפוגה ושפכו. הסופרנטנט לאיגום התאים. התחל בהוספת 15 מיליליטר של המדיה המחוממת מראש של 28 מעלות צלזיוס לכל צינור המכיל גלולת תא.לאחר החייאה, השעיית הגלולה מעבירה את כל תכולתה לצינור הבא. חזור על תהליך השעיית החידוש הסדרתי עד שכל התאים נאספו ל-50 מיליליטר יחיד. חרוטי. העבירו את התאים המאוחסנים לבקבוק של 250 מיליליטר.אזנו את תרחיף התא על ידי דגירה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בניסוי העיקרי, הוסף 15 מיליליטר מתוך 60 מעלות צלזיוס. מדיה שחוממה מראש לתאים, סובבו את הבקבוק כמה פעמים לערבוב והניחו מיד את הבקבוק באמבט המים של 39 מעלות צלזיוס והפעילו טיימר מעבדה.שינוי טמפרטורה לא מתירני זה ב-39 מעלות צלזיוס ישבית את RNA פולימראז 2 וידכא את סינתזת ה-mRNA הרחבה של הגנום. פיפטה שלושה מיליליטר של התרבית ומכניסים לשני צינורות מיקרו צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר בצנטריפוגה מיני. סובב את הצינורות במלוא המהירות למשך 10 שניות והוציא את הסופרנטנט מיד, הקפיא מיד את כדור התא בחנקן נוזלי או באמבט קרח יבש אתנול בנקודות זמן שנקבעו מראש.חזור על תהליכי איסוף הדגימות של שלושה מיליליטר והקפאת הבזק כמה פעמים שתרצה. הקפידו לשמור את בקבוק העבודה באמבט 39 מעלות צלזיוס לאורך כל הדרך אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. בודד את סך ה-RNA מכל דגימה.באמצעות פרוטוקול מיצוי פנול חם סטנדרטי עבור כל הדגימות, טען כמויות שוות של RNA כולל על ג'ל דנטורציה פורמלדהיד סטנדרטי של 1.0%. הקפד להקדיש לפחות נתיב חיצוני אחד לסולם RNA מסחרי. הפעל את הג'ל בחמישה וולט לסנטימטר עם מאגר מגב אחד.לאחר אלקטרופורזה, כרתו את נתיב הסולם מהג'ל לאורכו עם כתמי סכין גילוח את לוח הסולם בתמיסת AUM, ברומיד או סייבר זהב למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר יש לעצור למשך 30 דקות על שולחן תאורת טרנס UV. הנח את לוח הסולם המוכתם ואת הג'ל הלא מוכתם על סרגל שקוף.דמיין את הג'ל עם אור ה-UV על הקלט את המיקומים היחסיים של רצועות סולם ה-RNA הבולטות ביחס הן לסימוני הסרגל והן לקצה העליון או התחתון של הג'ל הלא מוכתם. לאחר מכן מודדים וחותכים קרום התואם את מידות הג'ל. העברת ה-RNA מהג'ל הלא מוכתם לקרום באמצעות טכניקות העברת ג'ל סטנדרטיות לאחר ההעברה.קשר את ה-RNA על הממברנה על ידי אפיית הממברנה למשך שעה ב-80 מעלות צלזיוס או על ידי הכנסת הממברנה לתנור צולב UV. אחסן את הממברנה בשקית ניילון בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש לפני שתמשיך בפרוטוקול, הגדר שולחן עבודה בטוח לקרינה עם מגן פוליקרבונט, מונה גייגר ותגי מוניטור דוזימטריה על שכבות מעבדה. כדי להתחיל להפשיר את בדיקות ה-DNA של תווית הרדיו על ספסל המעבדה, מחממים מראש את מאגר ההכלאה וההכלאה ב-42 מעלות צלזיוס.השתמש בכ -10 מיליליטר מכל מאגר לכל 100 סנטימטרים רבועים של קרום. מרחו את מאגר ההכלאה המקדים על הממברנה ודגרו בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, דנטורציה של הרדיו שסומן ב-DNA ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.הוסף את ה-DNA המסומן ברדיו ישירות למאגר ההכלאה וערבב. דגרו את הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס כדי להשלים את תהליך ההכלאה. למחרת יש לשטוף את הממברנה פעמיים עם 50 מיליליטר טמפרטורת החדר, מאגר מלח למשך 15 דקות כל אחת.לאחר מכן יש לשטוף את הממברנה שוב עם 50 מיליליטר של 65 מעלות צלזיוס מאגר דטרגנט למשך 15 דקות. לבסוף, אטמו את הממברנה בניילון נצמד כדי לשמור על לחות וכדי להבטיח שהממברנה לא תזהם את מסך הפוספו. בעזרת מונה גיר העריכו את הרדיואקטיביות של הממברנה, ואז הניחו את הממברנה על מסך פוספו וחשפו אותה למסך.סרוק את מסך הפוספו עם מצלמת פוספו באמצעות תוכנת הדמיה מסחרית. כמת את כמות פס ה-mRNA הספציפי למטרה בכל נתיב על ידי נורמליזציה של עוצמתו כנגד רצועת בקרת טעינה באותו נתיב בגיליון אלקטרוני, טבלאות את עוצמת פס ה-mRNA עבור כל נתיב החל מהדגימה הראשונה שנאספה בנקודת הזמן האפס בגרף חצי לוג. שרטט את אחוז ה-RNA שנותר לעומת זמן איסוף הדגימה וקבע את השיפוע של קו ההתאמה הטוב ביותר.חשב את מחצית החיים של mRNA עבור גן המטרה על ידי חלוקת שלילי 0.693 בשיפוע. כאשר ניתן לכבות את שעתוק ה-mRNA ב-RNA פולימראז רגיש לטמפרטורה, שני מוטנטים, ניתן לחקור בקלות את הדינמיקה של פירוק mRNA על ידי בחינת מוטנטים פגומים בדעיכת mRNA מתווכת שטויות או בקיצור NMD. לדוגמה, בשמרים מסוג בר, כל הצטברות של מיני mRNA המכילים קוד סיום מוקדם על או PTC מדוכאת במהירות על ידי הפירוק הממוקד שלהם על ידי md.מצד שני, מוטנטים עם מסלול NMD פגום יציגו לרוב קצב פירוק איטי משמעותית מאותו סוג mRNA. לפיכך, ל-mRNA יהיה זמן מחצית חיים ארוך יותר על ידי ביטול כל אירועי סינתזת ה-mRNA החדשים עם שינוי טמפרטורה לא מתירני. ניתן לבצע שתי תצפיות מניסוי זה כצפוי בזן מסוג פרא עם מסלול NMD פונקציונלי ו-RPB רגיש לטמפרטורה מקף אחד רקע.קיומם של שטויות המכילות prem NNA דוכא לחלוטין על ידי השפלות ממוקדות רגילות בזן מוטנטי פגום NMD. עם זאת, קצב הפירוק הממוקד של ה-nonsense pre-NNA היה איטי יותר באופן ניכר, מה שהביא לעלייה במחצית החיים שלו על ידי כימות כמות השטויות המכילות mRNA. ביחס לזמן עם תוכנת הדמיה, ניתן להסיק את זמן מחצית החיים האפקטיבי של ה-mRNA מהשיפועים של חלקת ה-mRNA למחצה.כמות מול זמן לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבוע אחד אם מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את שיעורי דעיכת ה-mRNA ואת הקרוסים.

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.

סימון מטבולי של רנ&quot;א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ&quot;א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

שיעורי מוטציה בתאי cerevisiae Saccharomyces הצעיר נמדדו באמצעות בדיקות תנודות משמשים כדי לחזות תדרי מוטציה בתאי אמא של גילאי replicative שונים. מיון וcytometry זרימה מגנטי משמש לאחר מכן למדידת תדרי מוטציה בפועל וגיל של תאי אם לזהות כל חריגה מתדרי מוטציה חזו.

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב Saccharomyces cerevisiae

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

אנו מתארים פרוטוקול מתרבים ביצירת ו fibroblasts השבתה הדרגתית העיקרי עורי אנושי, ניטור התעתיק הניוון ולאחר זיהוי גנים רקובה באופן שונה.

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה לא רדיואקטיבית ולא פולשנית כדי להעריך סינתזת חלבון דה נובו ב vivo, ניצול elegans caenorhabditis נמטודה והתאוששות פלואורסצנציה לאחר photobleaching (FRAP). שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מסכים גנטיים ו/או תרופתיים כדי לזהות אפנונים חדשניים של סינתזת חלבונים.

הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.

הערכה כמותית אופטימלית של יציבות RNA משפר בתאי גזע עובריים בעכבר

למדו למדוד שיעורי ריקבון mRNA ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות שימוש בזנים Rpb1-1 רגישי לטמפרטורה. שיטה זו מאפשרת ניתוח יציבות mRNA ותרומה להבנת רגולציית ביטוי גנים בחיידקי שמרים.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב

גלה סרטונים נוספים