הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את שותפי האינטראקציה החלבונית של חלבון מעניין באמצעות מבחן השלמה של חלבון DI הידרו פולאט רדוקטאז, או D-H-F-R-P-C-A. זה מושג על ידי עיבוי ראשון של אוסף DH FFR F שלוש או שבחים על מערכי מושבות בצפיפות גבוהה. לאחר מכן, זן הפיתיון מיוצר עם מגוון שבחים על מדיום עשיר.

בשלב האחרון, נבחרים הדיפלואידים הנובעים מהזדווגות זו. בסופו של דבר, הבנייה מחדש של ה-DHFR מכומתת על ידי מדידת גודל המושבה על מדיום PCA סלקטיבי, שנותן אות פרופורציונלי לכמות קומפלקס הטרף של הפיתיון שנוצר מחדש בתאים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות כמו סרטן, כפי שהיא על ידי חיווט מחדש של רשתות אינטראקציה עם חלבונים.

שמוטציות יכולות להוביל למחלות כאלה. בבוקר ההליך, יש לעקר את הפלטפורמה הרובוטית על ידי השריית כלי ה-PIN חמש פעמים למשך 10 שניות בתחנת אמבט המים כדי להסיר שאריות של גושי תאים. לאחר מכן יש להשרות את כלי ה-PIN פעמיים קדימה ואחורה בתחנת המברשת ופעמיים בתחנת ה-so cater למשך 20 שניות כל אחת כדי להסיר את כל התאים הנותרים בזמן ניקוי כלי ה-PIN.

הפעל את מנורת ה-UV למשך חמש דקות כדי לעקר רובוט. מארז לאחר הכביסה האחרונה, יבש את כלי ה-PIN בתחנת מייבש האוויר למשך 25 שניות. דחסו את אוסף A-D-H-F-R ל-16 מערכים של 384 זנים כאן.

ניתן לחלק מערך 384 לארבעה רבעים מרווחים בעלי עניין שווה, כל אחד מורכב מ-96 מיקומים בפריסת מטריצה של שניים על שניים בסך הכל ארבעה רבעים. כדי לעשות זאת עבור כל מערך 384, הדפס ארבע לוחות גליצרול על ארבעת הרבעים של מגש אומני המכיל YPD בתוספת 250 מיקרוגרם למיליליטר. Hygromycin B, באמצעות הכלי 96 פינים לשם כך, הכנס 4 צלחות באר 96 המכילות את ה-LDH FFR F שלוש בקרה שלילית בין 60 לוחות הגליצרול מאוסף DHFR 3 על מנת לקבל סט סופי של 64 צלחות הממלאות בדיוק ארבעה 1,536 מערכים.

לאחר מכן הכנס 4 לוחות באר 96 המכילים את ה-LDH FFR F שלוש בקרה שלילית בין 60 הלוחות האחרים כדי לקבל סט סופי של 64 לוחות הממלאים בדיוק 4 15 36 מערכים לפני הוספת תאים ללוחות המקור הרטיבו את הפינים המעוקרים ב-35 מיליליטר מים סטריליים במגש אומני בתחנה הרטובה. דגרו את המערכים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים, ולאחר מכן דחסו את האוסף לארבעה מערכים של 1,536 זנים. הדפס ארבעה מערכים של 384 זנים על כל אחד מארבעת לוחות היעד.

שימוש בכלי 384 פינים. עיקור כלי ה-PIN בין כל מחזור שכפול כפי שהודגם זה עתה לאחר יומיים נוספים של דגירה. תקנן את גודל המושבה על ידי שכפול ארבעת המערכים במדיום ה-YPD שנבחר עם כלי של 1,536 פינים ודגירה על הלוחות למשך 48 שעות נוספות.

לתפוקה גבוהה. D-H-F-R-P-C-A חיסנו תחילה תרבית של זן הפיתיון ב-20 מיליליטר של YPD נוזלי בתוספת CIO ריצין בשפופרת של 50 מיליליטר ודגרו על התאים במשך יומיים ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד. כאשר התרבות הגיעה לרוויה.

צלחת חמישה מיליליטר של תרחיף התאים על מגש YPD פלוס אומני גרנט, ותן לתאים להיספג על פני השטח לאחר חמש עד 10 דקות, הסר את עודפי הנוזל ודגר את התרבית ב -30 מעלות צלזיוס לאחר יומיים. השתמש בכלי 1,536 פינים כדי להדפיס את מתח הפיתיון על 12 לוחות YPD באמצעות כל מדשאת תאים לא יותר מארבע פעמים. לאחר מכן באמצעות הכלי 1, 536 פינים, שוב, הדפס את המערך המתאים לאוסף DHFR F שלוש על גבי תאי הפיתיון.

תן לזנים להזדווג במהלך דגירה נוספת של יומיים ולאחר מכן בחר את התאים הדיפלואידים על ידי הדפסת המושבות על מגשי אומני המכילים YPD בתוספת הידרו מיצין B ונורדין. דגרו על הדיפלואידים במשך יומיים נוספים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חזרו על הבחירה כפי שהודגמה רק יום אחד לתוך הדגירה. מזגו צלחות עם חומר המכיל מטוטרקסט למחרת.

השתמש בכלי 1,536 פינים כדי להדפיס תאים דיפלואידים על מדיום המטוטרקסט ולדגור את הצלחות במשך ארבעה ימים נוספים בשקיות ניילון כדי למנוע מהתרביות להתייבש. ביום השלישי לדגירה. יוצקים אצווה שנייה של מגשי אומני המכילים מדיום MTX כפי שהודגם זה עתה למחרת, הדליקו את אור הרובוט והשתמשו בפלטפורמה רובוטית כדי לצלם את הלוחות כדי להפחית את צמיחת הרקע של זני ה-PCA וכדי להגדיל את הרזולוציה הכמותית, שכפל את התאים באצווה השנייה של מדיית MTX כדי לבצע סיבוב שני של בחירת MTX כפי שהודגם זה עתה.

לבסוף, לאחר רכישת תמונות מקבוצת הלוחות השנייה, נתח את מערכי המושבה עם התוכנה המתאימה, ואסף את המידע על גודל המושבה עבור כל מיקום של כל מערך. הסף המוגדר עם שלוש פקדי LDH FFR F יכול לשמש כסף אמפירי לקביעת פגיעות הביטחון הגבוהות. לאחר מכן ניתן לאחזר את האינטראקציות הפיזיות הידועות של הפיתיון ממאגרי מידע כמו Biogrid ולשכב על הנתונים.

לדוגמה, כאן, חמש מתוך שמונה פגיעות ברמת ביטחון גבוהה דווחו בעבר כאינטראקטורים של NUP 82, ביניהם NUP אחד 16 ו-NUP 1 59 נקבעו כחלק מתת-קומפלקס NUP 82. הנתונים מצביעים גם על כך שחלבון הממברנה המשוער PEX 30 עשוי לייצג אינטראקציה פיזית חדשה של Nup 82 כפי שאושר באמצעות D-H-F-R-P-C-A בתפוקה נמוכה שזוהו שניים משותפי האינטראקציה האחרים שזוהו. החדש 20 והחדש 85 נקבעו כלא חלק מתת-הקומפלקס החדש 82, מה שממחיש את היכולת של D-H-F-R-P-C-A לזהות את האינטראקציות בתוך ובין תת-קומפלקסים של קומפלקסים גדולים יותר.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במדיית דיווח טרי כדי להימנע מפתרון בעיות בשלבי ההדפסה, ולכלול את הפקדים הדרושים כדי לוודא שמדיית ה-PCA הסופית מאפשרת צמיחה של תאים בלבד המדגימים השלמת DHFR.