Name: הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו לזהות שותפי אינטראקציה חלבוניים באמצעות מבחן השלמת קטעי חלבון DHFR-PCA בתאים חיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח רשתות חלבוניות בקנה מידה גדול לחקר מחלות כגון סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכון הקנדי לחקר בריאות (CIHR) מעניק 191,597, 299,432 324,265 ו, מדעי טבע והנדסת מועצת מחקר של מענק Discovery קנדה ומענק Frontier אדם תכנית המדע לCRL. CRL הוא חוקר CIHR חדש. גיום Diss נתמך על ידי מענק PROTEO. סמואל Rochette נתמך על ידי מלגות NSERC וFRQNT.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92, 291-294 (1998).</li>
<li>Diss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+avenues+for+exploring+the+dynamics+and+evolution+of+protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks.</a> Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).</li>
<li>Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactome+networks+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interactome networks and human disease.</a> Cell. 144, 986-998 (2011).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS biology. 7, e96(2009).</li>
<li>Arifuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+protein-protein+interaction+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12.</a> Genome Res. 16, 686-691 (2006).</li>
<li>Rajagopala, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binary+protein-protein+interaction+landscape+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli.</a> Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).</li>
<li>Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+landscape+of+membrane-protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 489, 585-589 (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Tarassov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+map+of+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An in vivo map of the yeast protein interactome.</a> Science. 320, 1465-1470 (2008).</li>
<li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li>
<li>Guruharsha, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+network+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein complex network of Drosophila melanogaster.</a> Cell. 147, 690-703 (2011).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+interactome+network+of+the+metazoan+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A map of the interactome network of the metazoan C. elegans.</a> Science. 303, 540-543 (2004).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li>
<li>Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+insight+from+noisy+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracting insight from noisy cellular networks.</a> Cell. 155, 983-989 (2013).</li>
<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li>
<li>Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+networks%3A+the+puzzling+riches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction networks: the puzzling riches.</a> Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-purification+coupled+to+mass+spectrometry%3A+basic+principles+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies.</a> Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).</li>
<li>Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).</li>
<li>Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+yeast+protein+interactome+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteomics%22%5BJournal%5D)">Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage.</a> Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).</li>
<li>Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+for+the+genetic+dissection+of+protein+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells.</a> Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).</li>
<li>Gagnon-Arsenault, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+divergence+plays+a+role+in+the+rewiring+of+protein+interaction+networks+after+gene+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication.</a> Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).</li>
<li>Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+assay+for+condition-dependent+changes+in+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+PCA%2C+a+systematic+approach+for+identifying+genes+important+for+the+physical+interaction+between+protein+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs.</a> PLoS Genet. 9, e1003838(2013).</li>
<li>Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCA%3A+a+scalable+assay+to+measure+the+perturbation+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).</li>
<li>Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+domain-directed+reassembly+of+active+dihydrofolate+reductase+from+rationally+designed+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+epistatic+miniarray+profiles+%28E-MAPs%29+and+its+application+to+chromatin+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions.</a> Methods. 40, 344-352 (2006).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Wagih, O., Parts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gitter%3A+A+Robust+and+Accurate+Method+for+Quantification+of+Colony+Sizes+From+Plate+Images%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images.</a> G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).</li>
<li>Leducq, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+robustness+of+protein+complexes+to+inter-species+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization.</a> PLoS Genet. 8, e1003161(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+Core+Team%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">Development Core Team: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).</li>
<li>Stark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioGRID%3A+a+general+repository+for+interaction+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioGRID: a general repository for interaction datasets.</a> Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).</li>
<li>Vinayagam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complex-based+analysis+framework+for+high-throughput+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets.</a> Science signaling. 6, rs5(2013).</li>
<li>Jansen, R., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+function+on+a+genomic+scale%3A+the+importance+of+gold-standard+positives+and+negatives+for+network+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction.</a> Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
</ol>

חלק מדמי פרסום גישה הפתוחים לכתבה זו שולם על ידי רובוטיקה S &amp; P.

אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על assay DHFR-PCA מאפשר זיהוי השיטתי של interactors הפיזי לכל חלבון פיתיון ניתנו בתפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על ידי בדיקות סקר ליותר פיתיונות, וזה בכל רמה רצויה של שכפול. אנחנו מדגימים את האמינות של פרוטוקול זה על ידי זיהוי של שותפי אינטראקציה פיזיים לחלבון פיתיון המעורב במתחם הגרעיני נקבובי: Nup82. הניתוח שלנו אפשר למצוא חמישה interactors שדווח בעבר ואחד interactor (איורים 3F &amp; 3G) לא פורסם בעבר, המדגיש את היכולת של השיטה ללמוד interactome שמרי החלבון. הפרוטוקול המתואר כאן כולל מספר שלבים קריטיים שהנסיין צריך לשים לב. אנו ממליצים ל1) ודאו שDHFR הפיתיון F [1,2] היתוך נכון (איור 1); זו יכולה להיות מושגת על ידי רצף הבנייה וmeasuring ביטוי חלבון נכון באמצעות אנטי-DHFR F [1,2] או אנטי DHFR-F [3] נוגדן; 2) לפני תחילת המסך, מומלץ לבדוק אם כל פיתיון של עניין מציג אינטראקציות מופקרות במסכי PCA. ניתן לעשות זאת על ידי ביצוע מסכי שליטה עם פיתיונות חצו עם הבקרה הנאותה L-DHFR או על ידי הזדווגות ידנית את הפיתיון עם הבקרה הנאותה L-DHFR וביצוע assay צמיחה במדיום MTX. 3) צלחות צריכה להיות שפכו היום לפני שהם נמצאים בשימוש, כך שהלחות היא אופטימלית לדבקות תא על פני השטח אגר במהלך תהליך ההדפסה; 4) אין להשתמש בצלחות מקור יותר מארבע פעמים להעביר מספיק תאים בצלחת היעד. הגדלת מספר העותקים של צלחת היעד יכול להיעשות על ידי צעדים רצופים של התרחבות (למשל 4 עותקים -&gt; 16 עותקים -&gt; 64 עותקים). לחלופין, ניתן לאסוף תאים בעמדות שונות על המדשאות או במושבה בין סבבים השונים של שכפול; 5) אם מספר positions חסרים לאחר בחירת דיפלואידי (s), לוודא כי צלחות המקור לא היו בשימוש פעמים רבות מדי בשלב החיזור (שלבים 4.5-4.7); 6) ודא שמדיום MTX מכיל את כל המרכיבים החיוניים בריכוזים הנכונים. ואכן, אם אין צמיחה בכלל הוא ציין על מדיום MTX, זה יכול להיות גם משום שאין אינטראקציה ניתן לזהות על ידי PCA לחלבונים של עניין, או משום בינוני MTX לא היה מוכן כראוי. כדי להבטיח שהמדיום מאפשר צמיחה של זנים מראים DHFR ברי שלמה, ניתן להוסיף אינטראקציה מכוננת בעמדות ריקות של האיסוף ושימשה כביקורת חיובית כגון DHFR-ברים התמזגו moieties הרוכסן לאוצין 33 (איור 1 ג). בדיקות מקבילות באמצעות שברי המקשר DHFR או שברי הרוכסן-מקשר DHFR יאפשרו להבחין בין תנאים שיאפשר לכל התאים לגדול (ריכוז MTX נמוך או חלבון פיתיון שנוטים לעשות אינטראקציות חיוביות כוזבות, כdescribed להלן) ותנאים המונעים צמיחה של כל הזנים (מרכיב ריכוז MTX גבוה או חיוני מדי חסר במדיום); 7) בהתחשב בכך שPCA מתבצעת באמצעות סיבובים רצופים של משוכפלים ממדיום אחד למשנהו, זיהום צולב בין זנים בין לוחות שונים עלול להתרחש אם, למשל, פיני הכלי אינו מעוקר כראוי בין סיבובי שכפול ו / או המים שעבר אמבטיה (תחנה כלומר רטובה) בהליך העיקור מזוהם על ידי מושבות של סיבובי שכפול קודמים. מספר התפקידים במערכים ריקים ולכן יכולים לשמש כעמדות שליטה שבו אין צמיחה, יש לשים לב לגילוי זיהומים צולבים. ניתוח תמונה יכול להתבצע באמצעות כמה תוכנות שפורסמו (ראה סעיף 5 לפרוטוקול) או כל תסריט מותאם אישית. במחקר זה, את התסריט המותאם אישית מבצע את השלבים הבאים: 1) התסריט גורע ערכי פיקסל של צלחת ריקה לפיקסל ערכים של כל צלחת כדי לשתףrrect להטיות תאורה. 2) התסריט ממיר כל תמונה מתוקנת רקע בינארית באמצעות סף ערך פיקסל של 10. 3) לכל 1,536 עמדות של כל צלחת, שנקבעו על ידי שכיסה מלבן במושבות הקצה, התסריט פועל ImageJ &quot;לנתח חלקיקים ... &quot;פונקציה בבחירה חוזר. הבחירה החוזר מוגדרת ברדיוס שווה לרווח בין שתי עמדות מינוס 10 פיקסלים. 4) התסריט בוחר את החלקיקים הקרובים ביותר ממרכז הבחירה ומאשר את זה כמושבה אם המיקום שלה הוא לא יותר ממחצית המרווח בין שתי מושבות מהמרכז של הבחירה. 5) התסריט מודד ערכי פיקסל של החלקיקים שנבחרו על התמונה מתוקנת רקע. 6) כדי לתקן עוד כל הטיות תאורת רקע שנותרו, את התסריט מחסיר את הערך הממוצע של כל הפיקסלים מהבחירה בחוזר, כי לא היו חלק מחלקיקים לערכי פיקסל של המושבה. הסכום של ערך פיקסל תיקן אלהים, מאוחסן בטור &quot;IntDenBackSub&quot; לוח משלים 1, משמש כמדד לגודל מושבה. שלב קריטי בחלק הניתוח הוא הבחירה של סף המשמעות. כאן, בחרנו סף המבוסס על חלוקת L-DHFR F השלילי [3] הבקרה, אך בהתאם למטרה של המסך, סף כזה עשוי להיות מחמיר מדי. ואכן, L-DHFR F [3] פקדי ביטוי יתר (אמרגן TEF חזק) באופן שהברים המשלימים עשויים באופן ספונטני משלימים אחד את השני ואלה ובכך אינם מייצגים את הביטוי של רוב החלבונים. זה מודגש על ידי העובדה שההפצה של L-DHFR F [3] הבקרות היא גבוהה מהממוצע של צמיחת הרקע (איור 3D). לכן, כמה אינטראקציות שיש ציונים מתחת לסף מחמיר זה אבל זה בבירור מחוץ להפצת צמיחת רקע יכול להיחשב כלהיטים משוערים שעשויות לייצג, למשל היתר, חולף או חלשפעולות. ניתן ללמוד אלה נוספים ומאומתים צולבים אם, למשל, שני החלבונים אינם באים לידי ביטוי ברמות שיכולות להרשות לשלמה הספונטנית של שברי DHFR כמו פקדי L-DHFR. כחלופה, אפשר להגדיר סף משמעות בהתאם לחלק היחסי של חפיפה עם interactors הפיזי דווח במסדי נתונים כמו 35 BioGRID על מנת למקסם את חלקם של תוצאות חיוביות האמיתיות על תוצאות חיוביות שגויות. עם זאת, בניגוד לשימוש בהפצת L-DHFR, חלופה זו עשויה שלא להיות תמיד אפשרית אם, למשל, מספר interactors הפיזי הידוע הוא לא גבוה מספיק. יתר על כן, הבחירה של סף המשמעות יש השפעה על השיעור של תוצאות חיוביות שגויות וגם שליליים שווא בערכת הנתונים הסופי. ואכן, כמו כל assay זיהוי PPI אחר, חיוביים שגוי יכול להיגרם כתוצאה מאינטראקציה נוקבת של חלבון עם חלבון DHFR-ההיתוך אם, למשל, החלבון הוא נרחב ביותר כאמור. זהמודגם על ידי העובדה שחלק פושט שיטתי אינטראקציה עם כל חלבוני הפיתיון במסכי PCA, ולכן, יש צורך להסיר מהניתוח 11 (לדוגמא Tef2 וAde17 ולוח משלים 2). כדי לעקוף בעיה זו, מסך PCA שליטה של ​​שני אוספים נגד הבקרה הנאותה L-DHFR (F [1,2] או F [3]) כדי לזהות פיתיונות ופושט מציגים ספונטני DHFR ברי שלמה יכולה להתבצע בתנאים מסוימים של כל מסך. יתר על כן, ביצוע ניתוח העשרת Gene אונטולוגיה יכול להגדיל את האמון בנתונים אם הפונקציה של פיתיון נתון ידועה. מצד השני, DHFR-PCA יכולה להצמיח שליליים שגוי מכמה סיבות: 1) לא ניתן התמזגו כל החלבונים לברי DHFR כמו אלה עלולים לערער את היציבות בחלבונים או לשנות את הלוקליזציה שלהם, אם, למשל, היתוך DHFR ל C-הסופי מפריע לאות לוקליזציה; 2) הכינון מחדש DHFR בכמה תאים סלולריים מ &#39;איי לא לייצר חומצה פולית אם, למשל, מבשר חיוני לסינתזה של חומצה פולית אינו זמין; 3) C-Termini צורך להיות במרחק של 8 ננומטר לשלמת DHFR להתרחש 11. לפיכך, אינטראקציה ידועה לא תזוהה אם C-Termini שלהם לא קרוב מספיק בחלל. זה בא לידי ביטוי כאן בעובדה שחלק גדול מאינטראקציות פיזיות Nup82 דווחו במאגרי מידע, אשר רובם עקיפים, לא התגלה assay שלנו. בדומה לכך, אינטראקציות בין חלבוני קרום שC-טרמיני נמצאים בטרנס ביחס לקרום לא יובילו לDHFR ברי שלמה ולא יזוהה 11. מגבלות 1) ו -3) ניתן לעקוף יחסית פשוט על ידי איחוי שבר DHFR לN-Termini של החלבון. פעולה זו עלולה למנוע להפריע לאות לוקליזציה ליד C-Termini ועשוי לאפשר לגילוי אינטראקציה בין החלבונים בממברנה שN ו- C-הסופי נמצא ביחסי cisהקרום. כמה אתגרים להישאר במחקר של מספרי זיהוי אישיים (שנסקר ב2,3). המפות של סיכות הופקו עד כה במידה רבה תוארו בתנאי ניסוי יחידים עבור כל מין ובכך להציע תמונת מצב אחת לאופן שעשויות להיות מאורגנים רשתות חלבון. אין אפוא צורך בבדיקה של תנאי ניסוי אחרים כדי לראות איך מספרי זיהוי אישיים עשויים להיות מחדש בתגובה לשינויים סביבתיים, גירויים מסוימים, על פני פיתוח או המוטציות הבאות. אתגרים אלה יהיו להתגבר על ידי פיתוח הטכנולוגיות חדשות לחקירת PPIs בזמן אמת, בתאים חיים ועל ידי התאמת טכניקות הנוכחיות, כך שהם יכולים להיות בשימוש על ידי קהילה גדולה יותר של מעבדות. כטכניקה כמותית שיכול לזהות שינויים בכמות של שלמת DHFR קומפלקסי 27, ניתן להתאים DHFR-PCA להתגבר על אתגרים אלה ונעשה שימוש כדי ללמוד איך PPIs מושפע DNA נזק סוכן 22 </sup&gt;, חומרים כימיים 25, מחיקות גן 23,26 או במינים שמרים אחרים והכלאיים שלהם 33. היכרות עם הממדים החדשים אלה תהפוך ליותר ויותר חשובים לחשוף את הדינמיקה של PIN.

רשתות אינטראקציה חלבון (PIN) מציעות מפה ברזולוציה נמוכה של כמה חלבונים מאורגנים מבחינה תפקודית בתא 1. כל חיבור פיזי בין שני חלבונים, או אינטראקציה בין חלבונים (PPI), עשוי לייצג עמותה כי הוא יציב בזמן, כמו אלה שנמצאו בתוך קומפלקסי חלבונים ושתורם לארגון המבני של התא. קשרים אלה עשויים גם לייצג עמותות חולפות המסדירות את הפעילות, יציבות, הלוקליזציה ואינטראקציות של שני השותפים. זיהוי שותפי אינטראקציה הפיזי של חלבון נתון לכן מספק מידע עשיר על התפקוד והרגולציה של החלבון ש2,3. מסיבות אלה, כבר לשים מאמצים גדולים למיפוי של סיכות באורגניזמים מודל, כולל Escherichia coli 4-6, thaliana ארבידופסיס 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, דרוזופילה melanogaster &lt;/ Em&gt; 13, Caenorhabditis elegans 14 וההומו ספיינס 15. מחקרים אלה סיפקו תובנות חשובות כיצד חלבונים מאורגנים בתא ומידע ובכך מפתח בחלבונים עם פונקציות ידועות קודם לכן. כמה אסטרטגיות שפותחו במשך השנים ללמוד מספרי זיהוי אישיים. טכנולוגיות אלה יכולות להיות מקובצים באופן כללי בשלוש קטגוריות המבוססות על הסוג של מידע שהם מספקים ב- PPI (שנסקר ב16-18). הראשון מבוסס על שמרי שתי-היברידי ונגזרותיו 19. טכנולוגיות אלו מספקות מידע על העמותה הישירה בין הזוגות של חלבונים, המאפשר בניית רשתות בינארי. המשפחה השנייה מבוססת על טיהור הזיקה של חלבוני פיתיון וזיהוי של השותפים הקשורים בם, כגון טיהור זיקה ואחריו ספקטרומטריית מסת 20. גישות אלה לזהות קבוצות של חלבונים אשר מתייחסות ישירותאו קשור באופן עקיף, בדרך כלל באופן יציב, והם חזקים מאוד לזהות קומפלקסי חלבונים. הגישה השלישית מתבססת על מבחני חלבון-בר שלמה (PCAs) 11,21. גישה זו מספקת רמה בינונית של החלטה בין שתי הגישות הקודמות, שכן היא מאפשרת איתור עמותות ישירות והפרוקסימלי בין חלבונים. לכל אחד יש טכניקה עוצמות משלה וחולשות, כפי שנסקר 18 לאחרונה. PIN אוקריוטים ביותר שתואר הוא ללא ספק אחד משמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae, בין שאר משום שproteome היא יחסית פחות מורכבת מאלה של אאוקריוטים מודל אחרים וכי מבחני תפוקה גבוהה כדי לזהות PPIs ראשון כבר assayed ויעילות רב יותר מיושם באורגניזם מודל זה 9-12. שיטה חזקה במיוחד למערכת השמרים היא assay דיהידרופולאט רדוקטאז שלמת חלבון-בר (DHFR-PCA), assay כי כברמשמש בהקשרים שונים כדי ללמוד את PIN השמרים בתנאים סטנדרטיים ומוטרדים 11,22-26. שיטה זו מסתמכת על assay הישרדות המאפשר זיהוי של PPI ישיר וכמעט ישיר לחלבון פיתיון ניתנו בשתי רמות ביטוי אנדוגני והמגוירים subcellular יליד שותפי האינטראקציה 11,21 באופן כמותי 27. האות שהושגה באמצעות assay זה (גודל מושבה כלומר על מערכי מושבה בצפיפות גבוהה) ובכך משקפת את הסכום של קומפלקסי חלבונים שנוצרו בין הפיתיון והטרף בסביבה סלולרית כמעט שווה ערך לאחד מתאי wild-type. Assay מבוסס על הכינון מחדש של אנזים כתב המעורב במטבוליזם של חומצה פולית, דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR), לפיה שני שברים משלימים של DHFR שהתמזגו שני חלבונים של עניין הם הביאו לקרבה כאשר שני חלבוני האינטראקציה, ש בתורו מוביל לכינון מחדש הפיך של פעילות אנזים 1גידול של 1 ושל העומס על methotrexate בינוני מכיל (MTX; איור 1). מתחם זה מעכב את אנזים אנדוגני DHFR, אבל לא אחד שעבר מוטציה בשימוש assay 28. שני אוספים של זני PCA, אחד המכיל ~ 4,300 מאטה זנים עם ORF התמזג DHFR F [1,2] ובר אחד המכיל ~ 4,800 MAT α זנים עם ORF התמזג DHFR [3] שבר, ניתן לרכוש ל ליישם DHFR-PCA בקנה מידה קטנה או גדול בכל מעבדה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כללי אבל מפורט למסך ל- PPI בין חלבון פיתיון אחד ו~ 4,800 חלבוני טרף באמצעות assay זה.

<table><tbody><tr><td>רובוט BioMatrix, תצורת ספסל</td><td>S& פי רובוטיקס בע"מ</td><td>BM5-BC</td><td></td></tr><tr><td>96 פורמט סיכה</td><td>S& פי רובוטיקס בע"מ</td><td>PH-96-10</td><td>כלי סיכה סטנדרטי בפורמט 96 עם 96 פינים צפים ברמת דיוק גבוהה</td></tr> כלי <tr><td>סיכה בפורמט 384</td><td>S& פי רובוטיקס בע"מ</td><td>PH-384-10</td><td>כלי סיכה סטנדרטי בפורמט 384 עם 384 פינים צפים ברמת דיוק גבוהה</td></tr><tr><td>כלי סיכה בפורמט 1536</td> S<td>& פי רובוטיקס בע"מ</td><td>PH-1536-05</td><td>כלי סיכה מותאם אישית בפורמט 1536 עם סיכות צפות ברמת דיוק גבוהה של 0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>מודול הדמיה אוטומטי&nbsp;</td><td>S& פי רובוטיקס בע"מ</td><td>IMG-02</td><td></td></tr><tr><td>מטוטרקסט&nbsp;</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>MTX440&nbsp;</td><td>זהירות: תרכובת רעילה</td></tr><tr><td>Hygromycin B&nbsp;</td><td>ביושופ קנדה בע"מ</td><td>HYG003</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin dihydrogen sulfate</td><td>Werner BioAgents</td><td>5010000</td><td></td></tr><tr><td>אוסף שמרים-אינטראקטום&nbsp;</td><td>מגש Omni</td><td>YSC5849</td><td></td>Thermo Scientific</tr><tr><td>עם מכסה סטרילי&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד DHFR F[1,2]&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1067</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד DHFR F[3]&nbsp; &nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D0942</td><td></td></tr></tbody></table>

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה assay (pca) בתאים חיים

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

חלבונים הם אבני הבניין, האפקטורים ומתווכי האותות של תהליכים תאיים. תפקודו, ויסות ולוקליזציה של חלבון תלויים לעתים קרובות באינטראקציות שלו עם חלבונים אחרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת השלמת חלבון שמרים (PCA), שיטה רבת עוצמה לאיתור קשרים ישירים ופרוקסימליים בין חלבונים בתאים חיים. האינטראקציה בין שני חלבונים, שכל אחד מהם התמזג למקטע חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR), מתורגמת לצמיחה של זני שמרים בנוכחות התרופה מטוטרקסט (MTX). ניתן לכמת כושר דיפרנציאלי, הנובע מכמויות שונות של אנזים DHFR משוחזר, על מערכי מושבות בצפיפות גבוהה, מה שמאפשר להבדיל בין אינטראקציה לבין זוגות פיתיון-טרף שאינם מתקשרים. פרוטוקול התפוקה הגבוהה המוצג כאן מבוצע באמצעות פלטפורמה רובוטית המקבילה להזדווגות של זני פיתיון וטרף הנושאים חלבוני היתוך משלימים של DHFR ובדיקת ההישרדות ב-MTX. פרוטוקול זה מאפשר לבדוק באופן שיטתי אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) הכוללות חלבוני פיתיון מעניינים ומציע מספר יתרונות על פני מבחני זיהוי PPI אחרים, כולל חקר חלבונים המתבטאים מהמקדמים האנדוגניים שלהם ללא צורך בשינוי לוקליזציה של חלבון ולהרכבה של מבני מדווח מורכבים.

לוח משלים 2 הוא דוגמא לתוצאות שהושגה באמצעות נציג שמרי החלבון Nup82 התמזג DHFR F [1,2] הבר כפיתיון. הסף שנקבע עם L-DHFR F [3] בקרות יכולים לשמש כסף אמפירי כדי לקבוע להיטי ביטחון גבוהים (איורים 3D &amp; 3E). לחלופין, דירוג הציון ניתן להשתמש כדי לבצע מוספים לג&#39;ין אונטולוגיה או אחרים תפקודי מנתח 36 המבוסס על סטנדרטים זהב 37. Interactors הפיזי הידוע של הפיתיון יכול להאסף ממאגרי מידע כמו 35 BioGRID ומעולף על נתונים (הנתונים 3E &amp; 3F). בדוגמא זו, חמש מתוך שמונה להיטי ביטחון גבוה כבר דווחו בעבר כinteractors Nup82 ושני הם חלק מsubcomplex Nup82, Nup116 וNup159 (איור 3F &amp; 3G). חבר האחר של המתחם, Nsp1, לא מראה שום Interaction בניסוי שלנו. שני פושט, Ade17 וTef2 (לא מוצג באיור 3F), קבל ציונים מעל הסף הקשה ליישם, אבל אלה עשויים להיות חיוביים שגויים כפי שהם אינטראקציה עם כמעט כל חלבון פיתיון במסכי PCA שבוצענו (תוצאות לא פורסמו). מצד השני, Pex30 עשוי לייצג interactor פיזי רומן של Nup82 והיינו יכול לאשר אינטראקציה זו באמצעות DHFR-PCA בתפוקה נמוכה (איור 3G). Pex30 הוא חלבון קרום peroxisomal וכמה אינטראקציות ישירות דווחו בין מורכב הנקבובית הגרעיני (NPC) ואברון זה. מסך דו-היברידי זיהה שני חלבוני NPC אחרים, Nup53 וAsm4 (Nup59), כinteractors הפיזי של Pex30 38, ואינטראקציה גנטית בין Pex30 וNup170 דווחה 39. שני שותפים אחרים אינטראקציה זוהה, Nup120 וNup85 (איור 3F &amp; 3G), אינם חלקים מהמשנה המורכבת Nup82, הממחישים את היכולתשל DHFR-PCA כדי לזהות אינטראקציות בתוך ובין subcomplexes במתחמים גדולים יותר 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> איור 1:. זני שמרי הנדסה לתפוקה גבוהה DHFR-PCA (. הדמות המותאמת מLeducq et al 2,012 33) בנייה (א) לזני מאטה וα MAT הפלואידים למזג Gene1 (G1) וGene2 (G2) עם DHFR F [1,2] -NatMX וDHFR F [3] -HPH קלטות, בהתאמה. קלטות הן מוגברות מפלסמידים pAG25-DHFR F [1,2] וpAG32-DHFR F [3] עם G1-5 פריימרים קדימה &#39;וG2-5&#39;, ולהפוך פריימרים G1-3 &#39;וG2-3&#39;, ולאחר מכן הוכנס בגנום בסוף &#39;3 של גן המטרה על ידי רקומבינציה ההומולוגית. החלבונים וכתוצאה מכך, P1 ו- P2, הם בהתאמה התמזגו DHFR F [1,2] בר (מאטה) וDHFR F [3] שבר (MATα) באמצעות מקשר גמיש. (ב) אימות של הבנייה ב() מתבצע על ידי רצף צמתים בין Gene1 של וORFs של Gene2 ו קלטות DHFR. זני PCA בנויים מנוגדים סוגי הזדווגות מכן הזדווגו כדי ליצור דיפלואידי. זני דיפלואידי לגדול במדיום MTX אם שני שברי DHFR משלימים הם הביאו לקרבה על ידי אינטראקציה בין P1 ו- P2, שreconstitutes הפעילות של אנזים DHFR. בנייה (C) של שליטת PCA דיפלואידי זנים למסכי DHFR-PCA. הבקרות השליליות (L-DHFR) בנויות על ידי הפיכת זני מאטה וMATα בנפרד הפלואידים עם פלסמידים P41-מקשר DHFR F [1,2] וP41-מקשר DHFR F [3] 11, בהתאמה. שני זנים הם הזדווגו וכתוצאה מכך מתח דיפלואידי ביקורת שלילית שבו שברי DHFR אינם מסוגליםלמשלים אחד את השני (למעלה). בקרות חיוביות נבנות תוך שימוש באותה הגישה כמו לבקרה השלילית, אבל פלסמידים הפכו בזנים הפלואידים (P41-רוכסן-מקשר DHFR F [1,2] (P41-ZL-DHFR F [1,2]) וP41 -zipper-מקשר DHFR F [3] (P41-ZL-DHFR F [3])) מכיל שברי שני GCN4 אוצין המקביל רוכסן התמזגו ברי DHFR המשלימים, מה שמוביל לאינטראקציה חזקה ומכוננת שreconstitutes פעילות DHFR (תחתון ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> איור 2: הליך DHFR-PCA תפוקה גבוהה (דמות שהותאמה מet al Leducq 33.) () MAT α DHFR F [3] האוסף.<html> הוא מרוכז בפורמט 1,536 באמצעות שני סיבובים רצופים של עיבוי. ראשית, צלחות מניית גליצרול משולבות בקבוצות של ארבעה על מדיום YPD + HygB סלקטיבית בפורמט 384 באמצעות 96 פיני הכלי. שנית, 384 מערכים משולבים על ידי קבוצות של ארבעה על מדיום YPD + HygB סלקטיבית בפורמט 1,536 באמצעות 384 פיני הכלי. מדשאות תא (B) של זן פיתיון מאטה PCA ערוכות על ידי גידול תרבות רוויה של זן הפיתיון ב YPD סלקטיבית + בינוני נט וציפוי התרבות בנט YPD + omnitray. (C) מדשאות אלה משמשים להזדווג מתח הפיתיון עם DHFR F [3] האוסף על מדיום YPD. תאים ברציפות מועברים פעמיים על מדיום YPD + HygB + נט כדי לבחור עבור diploids ופעמים במדיום MTX לבצע PCA. צמיחה יקויימו רק על מדיום MTX אם שברי DHFR משלימים אחד את השני הבא אינטראקציה בין הפיתיון וחלבוני הטרף.&quot;Target =&quot; e.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> איור 3:.. נורמליזציה נתונים הניתוח באמצעות צעדי נורמליזציה, קביעת סף משמעות וזיהוי של אינטראקציות חיוביות () הפצת צפיפות של גודל מושבה על כל צלחת (יומן 2) (ב) על ידי החציון של כל תמונה מתקנת להטיות קשור בתופעות צלחת לצלחת. Heatmap (C) המציגה את מקדם מתאם ספירמן בין הצלחות, המאשר את שחזור של ההליך. הפצה (D) של ציונים לPPIs נבדק וL-DHFR F [3] בקרות. סף קשיח יכול להיות מוגדר 95 אחוזון ה של L-DHFR F [3] הפצה לזהות PPIs ברמה ודאות גבוהה (המיוצג על ידי מקווקו אנכיהפצה) כדי דרגה. (E) שורה של הציון הממוצע של כל טרף. שותפים שדווחו בעבר פיזי אינטראקציה של Nup82p בBioGRID 35 מזוהים על ידי חוגים ואלו שדווחו במחקר זה מזוהים על ידי נקודות אדומות. הסף שנקבע ב( D) מוצג כקו מקווקו. (F) רשת מציגה את PPIs ברמה ודאות הגבוהה שזוהה במחקר זה. interactors קצוות כחולים מראים שדווחו בעבר הפיזי (35 BioGRID) וקצוות צהובים להראות אינטראקציה שלא דווחה בעבר עם Pex30. assay ספוט-הדילול של זני דיפלואידי PCA מעורבים Nup82-DHFR F [1,2] והטרף-DHFR F [3 (G) ] זוגות זוהו כinteractors הפיזי של Nup82p במחקר הנוכחי. assay הצמיחה בוצע במדיום DMSO (ממס MTX, פנל משמאל) ובינוני MTX (פנל מימין). בקרות שליליות בהיקף של Nup82-DHFR F [1,2] - לינקר-DHFR F [3] ולינקר-DHFR F [1,2] - לינקר-DHFR F [3] ושליטה חיובית בהיקף של tהוא אינטראקציה חזקה בין שתי moieties הרוכסן לאוצין (רוכסן-DHFR F [1,2] - הרוכסן-DHFR F [3]) היו כלולים. תא צמיחה מעולה לבקרה השלילית במדיום MTX יש לפרש כאינטראקציה פיזית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומצת אמינו </td><td> כמות (ז) </td></tr><tr><td> סולפט אדנין * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Tryptophane </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-טירוזין </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> ל-פנילאלנין </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> חומצה גלוטמית L-(מלח מונוסודיום) </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-asparagine </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-Valine </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 2.0 </tד&gt; </tr><tr><td> L-Serine </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-היסטידין HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L- ארגינין HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-מתיונין * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L ליזין * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> * הסתגרות בעת ביצוע PCA סטנדרטית (כמו בפרוטוקול זה) אך ניתן להוסיף למטרות אחרות. </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. כמויות הרכב 10X -lys / הנשירה / ADE נפגשה במדיום MTX הן לליטר אחד של 10x נשירה. כוכביות לציין את התרכובות שיש משיכה למדיום MTX הסטנדרטי, אבל שניתן להוסיף למטרות אחרות. לוח משלים 1:. נתונים משולבים מצלחות מבחן 12 טבלה 1 מכילה את דה בשרשורta מניתוח ImageJ בוצע באמצעות תסריט ImageJ מותאם אישית עם כל שורה המתאימה לעמדה אחת על כל מערך 1,536. בנוסף, כל שורה כבר מבוארת עם המידע על קובץ התמונה, צלחת אוסף DHFR, לשכפל, ORF ושם חלבון. לוח משלים 2:. צמיחה מנורמלת ממוצעת למתח טבלה 2 מכילה את הצמיחה מנורמלת יומן 2 הממוצעת עבור כל זן של האוסף יחד עם סטיית התקן. פושט מסונן, להיטים וinteractors הפיזי הידוע מזוהים בעמודות נפרדות.

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את שותפי האינטראקציה החלבונית של חלבון מעניין באמצעות מבחן השלמה של חלבון DI הידרו פולאט רדוקטאז, או D-H-F-R-P-C-A. זה מושג על ידי עיבוי ראשון של אוסף DH FFR F שלוש או שבחים על מערכי מושבות בצפיפות גבוהה. לאחר מכן, זן הפיתיון מיוצר עם מגוון שבחים על מדיום עשיר.בשלב האחרון, נבחרים הדיפלואידים הנובעים מהזדווגות זו. בסופו של דבר, הבנייה מחדש של ה-DHFR מכומתת על ידי מדידת גודל המושבה על מדיום PCA סלקטיבי, שנותן אות פרופורציונלי לכמות קומפלקס הטרף של הפיתיון שנוצר מחדש בתאים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות כמו סרטן, כפי שהיא על ידי חיווט מחדש של רשתות אינטראקציה עם חלבונים.שמוטציות יכולות להוביל למחלות כאלה. בבוקר ההליך, יש לעקר את הפלטפורמה הרובוטית על ידי השריית כלי ה-PIN חמש פעמים למשך 10 שניות בתחנת אמבט המים כדי להסיר שאריות של גושי תאים. לאחר מכן יש להשרות את כלי ה-PIN פעמיים קדימה ואחורה בתחנת המברשת ופעמיים בתחנת ה-so cater למשך 20 שניות כל אחת כדי להסיר את כל התאים הנותרים בזמן ניקוי כלי ה-PIN.הפעל את מנורת ה-UV למשך חמש דקות כדי לעקר רובוט. מארז לאחר הכביסה האחרונה, יבש את כלי ה-PIN בתחנת מייבש האוויר למשך 25 שניות. דחסו את אוסף A-D-H-F-R ל-16 מערכים של 384 זנים כאן.ניתן לחלק מערך 384 לארבעה רבעים מרווחים בעלי עניין שווה, כל אחד מורכב מ-96 מיקומים בפריסת מטריצה של שניים על שניים בסך הכל ארבעה רבעים. כדי לעשות זאת עבור כל מערך 384, הדפס ארבע לוחות גליצרול על ארבעת הרבעים של מגש אומני המכיל YPD בתוספת 250 מיקרוגרם למיליליטר. Hygromycin B, באמצעות הכלי 96 פינים לשם כך, הכנס 4 צלחות באר 96 המכילות את ה-LDH FFR F שלוש בקרה שלילית בין 60 לוחות הגליצרול מאוסף DHFR 3 על מנת לקבל סט סופי של 64 צלחות הממלאות בדיוק ארבעה 1,536 מערכים.לאחר מכן הכנס 4 לוחות באר 96 המכילים את ה-LDH FFR F שלוש בקרה שלילית בין 60 הלוחות האחרים כדי לקבל סט סופי של 64 לוחות הממלאים בדיוק 4 15 36 מערכים לפני הוספת תאים ללוחות המקור הרטיבו את הפינים המעוקרים ב-35 מיליליטר מים סטריליים במגש אומני בתחנה הרטובה. דגרו את המערכים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים, ולאחר מכן דחסו את האוסף לארבעה מערכים של 1,536 זנים. הדפס ארבעה מערכים של 384 זנים על כל אחד מארבעת לוחות היעד.שימוש בכלי 384 פינים. עיקור כלי ה-PIN בין כל מחזור שכפול כפי שהודגם זה עתה לאחר יומיים נוספים של דגירה. תקנן את גודל המושבה על ידי שכפול ארבעת המערכים במדיום ה-YPD שנבחר עם כלי של 1,536 פינים ודגירה על הלוחות למשך 48 שעות נוספות.לתפוקה גבוהה. D-H-F-R-P-C-A חיסנו תחילה תרבית של זן הפיתיון ב-20 מיליליטר של YPD נוזלי בתוספת CIO ריצין בשפופרת של 50 מיליליטר ודגרו על התאים במשך יומיים ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד. כאשר התרבות הגיעה לרוויה.צלחת חמישה מיליליטר של תרחיף התאים על מגש YPD פלוס אומני גרנט, ותן לתאים להיספג על פני השטח לאחר חמש עד 10 דקות, הסר את עודפי הנוזל ודגר את התרבית ב -30 מעלות צלזיוס לאחר יומיים. השתמש בכלי 1,536 פינים כדי להדפיס את מתח הפיתיון על 12 לוחות YPD באמצעות כל מדשאת תאים לא יותר מארבע פעמים. לאחר מכן באמצעות הכלי 1, 536 פינים, שוב, הדפס את המערך המתאים לאוסף DHFR F שלוש על גבי תאי הפיתיון.תן לזנים להזדווג במהלך דגירה נוספת של יומיים ולאחר מכן בחר את התאים הדיפלואידים על ידי הדפסת המושבות על מגשי אומני המכילים YPD בתוספת הידרו מיצין B ונורדין. דגרו על הדיפלואידים במשך יומיים נוספים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חזרו על הבחירה כפי שהודגמה רק יום אחד לתוך הדגירה. מזגו צלחות עם חומר המכיל מטוטרקסט למחרת.השתמש בכלי 1,536 פינים כדי להדפיס תאים דיפלואידים על מדיום המטוטרקסט ולדגור את הצלחות במשך ארבעה ימים נוספים בשקיות ניילון כדי למנוע מהתרביות להתייבש. ביום השלישי לדגירה. יוצקים אצווה שנייה של מגשי אומני המכילים מדיום MTX כפי שהודגם זה עתה למחרת, הדליקו את אור הרובוט והשתמשו בפלטפורמה רובוטית כדי לצלם את הלוחות כדי להפחית את צמיחת הרקע של זני ה-PCA וכדי להגדיל את הרזולוציה הכמותית, שכפל את התאים באצווה השנייה של מדיית MTX כדי לבצע סיבוב שני של בחירת MTX כפי שהודגם זה עתה.לבסוף, לאחר רכישת תמונות מקבוצת הלוחות השנייה, נתח את מערכי המושבה עם התוכנה המתאימה, ואסף את המידע על גודל המושבה עבור כל מיקום של כל מערך. הסף המוגדר עם שלוש פקדי LDH FFR F יכול לשמש כסף אמפירי לקביעת פגיעות הביטחון הגבוהות. לאחר מכן ניתן לאחזר את האינטראקציות הפיזיות הידועות של הפיתיון ממאגרי מידע כמו Biogrid ולשכב על הנתונים.לדוגמה, כאן, חמש מתוך שמונה פגיעות ברמת ביטחון גבוהה דווחו בעבר כאינטראקטורים של NUP 82, ביניהם NUP אחד 16 ו-NUP 1 59 נקבעו כחלק מתת-קומפלקס NUP 82. הנתונים מצביעים גם על כך שחלבון הממברנה המשוער PEX 30 עשוי לייצג אינטראקציה פיזית חדשה של Nup 82 כפי שאושר באמצעות D-H-F-R-P-C-A בתפוקה נמוכה שזוהו שניים משותפי האינטראקציה האחרים שזוהו. החדש 20 והחדש 85 נקבעו כלא חלק מתת-הקומפלקס החדש 82, מה שממחיש את היכולת של D-H-F-R-P-C-A לזהות את האינטראקציות בתוך ובין תת-קומפלקסים של קומפלקסים גדולים יותר.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במדיית דיווח טרי כדי להימנע מפתרון בעיות בשלבי ההדפסה, ולכלול את הפקדים הדרושים כדי לוודא שמדיית ה-PCA הסופית מאפשרת צמיחה של תאים בלבד המדגימים השלמת DHFR.

genome-wide-protein-protein-interaction-screening-protein-fragment

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור פיצול-BioID, שיטת שברי-קומפלמנטציה מבוסס על טכניקת קרבה-תיוג BioID. מופעל על האינטראקציה של שני חלבונים נתונה, היא מאפשרת ניתוח פרוטאומיקס של חלבונים תלויי-ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית. השיטה היא פשוטה, חסכונית ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים.

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

למדו לזהות שותפי אינטראקציה חלבוניים באמצעות מבחן השלמת קטעי חלבון DHFR-PCA בתאים חיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח רשתות חלבוניות בקנה מידה גדול לחקר מחלות כגון סרטן.

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים