עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

מטרת הניסוי הבא היא להיות מסוגל לדמות מקרומולקולות במצב הלחות הקפוא שלהן באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני השידור. זה מושג על ידי הבזק צלילת הרשת עם הדגימה על הקריוגן כדי לקבל דגימה מזוגגת דקה. כשלב שני, הדגימה נחשפת לקרן האלקטרונים, שתיצור תמונת הקרנה של מולקולות המאקרו.

לאחר מכן, התמונות מעובדות במחשב על מנת לקבל שחזור תלת מימדי של מולקולת המאקרו. התוצאות מראות מבנה תלת-ממדי מפורט ביותר של מולקולת המאקרו, אישורה והמיקום התלת-ממדי של שותפיה המולקולריים. יש יתרון עיקרי בטכניקה זו, בשיטות אחרות להכנת דגימות לאלקטרומיקרוסקופיה.

בקריו, התמונה נוצרת ישירות על ידי האלקטרונים בתוך המקרומולקולה. זה משקף בצורה נאמנה יותר את המבנה הכמעט אינדיאני שלו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

הכנת רשת הקריו ומועברת למיקרוסקופ האלקטרונים קשה ללמוד בגלל הסיבוך הנוסף בעבודה בטמפרטורות קריוגניות, מחזור החימום משמש בתחילת רצף השאיבה ולאחר מפגש קריו EM. כדי להתחיל בהליך זה, הכנס את מחזיק הקריו לאחת מיציאות השאיבה של תחנת השאיבה. התחל את אפשרות מחזור החימום.

בבקר השלב הקר, פתח את שסתום הפרפר V שתיים, וכאשר הוואקום בתחנת שאיבת הטורבו מתייצב וקורא 10 לסיור מינוס שלוש, או עדיף לפתוח את שסתום הפרפר V אחד. לאחר שהטמפרטורה במחזיק יציבה מעל טמפרטורת החדר ומחזור החימום הושלם. נמוך V אחד ועוצר את המחזור.

לאחר מכן, התחל את אפשרות מחזור האור ze ובחר את הזמן הדרוש להשגת ואקום טוב בטווח של אחד עד פעמיים 10 עד מינוס ארבע טור. כאשר הוואקום מגיע ל-10 למינוס שלוש לטווח, פתח את שסתום הפינוי DU B שלוש ואת השסתום על מחזיק הקריו. לאחר השלמת המחזור, עלו השסתומים בסדר ההפוך בו הם נפתחו.

בעזרת פינצטה, השאירו חתיכת MICA כדי לחשוף שני משטחים חדשים. הניחו את משטחי הנציץ החשופים החדשים עם הפנים כלפי מעלה על פיסת נייר לבנה בצלחת פטרי. לאחר הנחת צלחת הפטרי בצנצנת של מאייד פחמן, בצע את רצף המשאבה למטה עד שהוואקום נמוך מ-10 למינוס שש ציפוי הנציץ בשכבה דקה של פחמן.

לאחר מכן העבירו את הפחמן הדק לרשת. שחתיכה של 0.5 על סנטימטר אחד של נציץ מצופה וצפה את הפחמן על פני השטח השטוחים של מים מסוננים. בעזרת הפינצטה, הניחו את צד הפחמן הקדוש של הרשת במגע עם המשטח העליון של שכבת הפחמן הצפה והרימו אותו.

הנח את הרשת כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה על מגלשת זכוכית בגודל 7.5 על 2.5 ס"מ מכוסה בסרט כוח. לאחר מכן הנח את מגלשת הזכוכית לתא של ציוד פריקת הזוהר וסגור את החדר. שאבו את צנצנת הפעמון וזהרו.

פריקה למשך 20 שניות ב -25 מיליאמפר ושבע פעמים 10 למינוס שני מיליבר. בשלב זה, הפעל את מנגנון הקפאת הצלילה. משוך את מיכל איתן כלפי מטה על ידי מילוי המאגר בחנקן נוזלי.

ברגע שהחנקן הנוזלי מפסיק לרתוח, הנח את קצה הצינור המגיע ממיכל איתן בתא הפנימי ופתח את השסתום לאט מאוד. נוזל את האתאן בתא הפנימי ומלא אותו עד מילימטר אחד מלמעלה. הפעל את הלחות.

לאחר מכן, טען רשת על פינצטה וטען שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של דגימה על משטח הפחמן של הרשת הקדושה. לאחר המתנה לספיגה של הדגימה לרשת, בצע ספיגה כדי להשיג סומק שכבה נוזלית דקה, הקפיאו את הרשת על ידי צלילה לתוך האתאן הנוזלי. הסר בזהירות את מכלול רשת הפינצטה מהאתאן הנוזלי והעביר אותו לתא החיצוני המכיל חנקן נוזלי.

לאחר מכן העבירו את הרשת לקופסת רשת קטנה שקועה בחנקן הנוזלי. בשלב זה, הכנס את מחזיק הקריו לתחנת העבודה להעברת קריו. מלאו את העושה של מחזיק הקריו ואת כלי תחנת העבודה בחנקן נוזלי.

העבירו במהירות את קופסת הרשת הקריו המכילה את הרשת המיובשת הקפואה לחנקן הנוזלי בתחנת העבודה. לאחר פתיחת קופסת רשת הקריו, קח את הרשת היבשה הקפואה והנח אותה בחריץ מחזיק הדגימה. לאחר מכן, הנח את טבעת הקליפ על גבי הרשת ולחץ עליה בעדינות עם הקצה הקהה של כלי טבעת הקליפ ועד שהיא יושבת היטב במקומה.

לאחר מכן סגור את תריס הקריו. השלם את האנטי זיהום TEM בחנקן נוזלי. הטה מחדש את שלב המיקרוסקופ למינוס 60 מעלות.

לאחר מכן, התחל את מחזור נעילת האוויר PrepU במיקרוסקופ. לאחר סיום רצף נעילת האוויר של המשאבה, הכנס את מחזיק המקהלה לנעילת האוויר וחבר את הקורtagכבל הבקרה למחזיק כדי לפקח על הטמפרטורה. לאחר כיבוי האור האדום, סובב את המחזיק למצב אפס מעלות לצורך הכנסתו לעמודת הוואקום הגבוהה של T EM.

החזר את תריס הקריו ופתח את שסתומי העמודים. הפעל את תוכנית המינון הנמוך במצב חיפוש. מרכז את הבמה והגדר את הגובה המרכזי באמצעות האלפא וובלר כדי לנענע את הבמה פלוס מינוס 15 מעלות, בחר חור מתאים והנח אותו במרכז השדה עם בקר הבמה XY.

עבור למצב מיקוד ומיקוד התמונה. ואז תחת מיקוד התמונה בין 0.5 ל -4.5 מיקרון. עבור למצב חשיפה והקלט את התמונה.

לבסוף, חזור למצב חיפוש כדי לבחור את החור הבא ולחזור על הרצף. תמונות מיקרוסקופיות המתקבלות בשיטות של צביעה שלילית ו-cryo EM עבור ארבע דגימות מייצגות בעלות מאפיינים מבניים שונים מושווים כאן, קפסידי נגיף הקשורים לאדנו, מוכתמים שלילית, חושפים חלקיקים דמויי נגיף ו-cryo EM מראה שהם ריקים. תמונות של וירוס פסיפס טבק מראות מוטות סליליים כאשר התעלה המרכזית מלאה בכתם בכתמים שליליים וריקה בתמונות ה-cryo EM.

KLH מורכב בחביות אופייניות המציגות שישה פסים הן בתמונות צביעה שליליות והן בתמונות EM קריו. מראות צד מלבניים ומעגליים ונופים חושפים ריק במבנה על ידי cryo EM בקולטן האודין. מאפייני פני שטח מורכבים כגון צלב מרכזי ושקע מרכזי באים לידי ביטוי בהצטברות כתמים על ידי צביעה שלילית וכאזורים בצפיפות נמוכה יותר על ידי קריו-אם.

דוגמאות אופייניות לחפצי קריו EM הם קרח גבישי, זיהום קרח, אסטיגמציה ומבנים דמויי רשת. ניתוח חלקיקים בודדים ושחזור תלת מימדי של קולטן אין מיובש קפוא אחד חושפים את המבנה הסימטרי המרובע. התחום הציטופלזמי יוצר פריזמה מרובעת ומכיל מספר תחומים גולריים הניתנים לשחזור היוצרים מבנה דמוי פיגום.

ברזולוציה של 10 אנגסטרום, ניתן לדמיין אלפא HELOCs תלת מימדיים. מיפוי הבדלים יכול לחשוף את מיקומם של ליגנדים חשובים. שינויים מאשרים מספקים מבט דינמי על מולקולת המאקרו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין דגימות EM קריו באיכות גבוהה. Cryo EM, בשילוב עם עיבוד תמונה, אפשרו לחוקרים לחקור את המבנה, ארגון תת-היחידות והדינמיקה הקונפורמטיבית של מכונות מקרו-מולקולריות.