מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה
19 בינואר 2015
פרוטוקול זה מתאר את מדידת ההתכווצות האיזומטרית בתכשיר שריר חלק מבודד, באמצעות מערכת אמבט רקמות מבודדת ורכישת נתונים מבוססת מחשב.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד טונוס שרירים חלק. זה מושג על ידי ניתוח והכנת רקמות תחילה. השלב השני הוא הרכבת הרקמה באמבט רקמות מבודד.
לאחר מכן נבדקת כדאיות הרקמה ונלקחות מדידות התכווצות איזומטריות. בסופו של דבר, תכשיר אמבט הרקמות המבודד משמש לבדיקת תפקוד הקולטן, איתות הקולטן ותגובתיות השרירים החלקים. באופן כללי, היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם גמישות המערכת, מהירות השגת התוצאות ושמירה על הרקמה כולה שלמה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום המשתמש בתרופות כדי להפריע לאיתות קולטנים או לנשמת שרירים חלקים, ישנם כמה תכשירים שיש להדגיש. חיוני לחמם מראש את מערכת אמבט הרקמות ל-37 מעלות צלזיוס על ידי הפעלת אמבט המים המחומם המחזורי. המים חייבים לזרום לכל רכיב בחיבור הדוקרני הנמוך ביותר ולזרום החוצה בחיבור הדוקרני הגבוה ביותר.
יש לחבר כל רכיב. יש לכייל את מתמרי הכוח ולהפעיל אותם לפחות 15 דקות לפני הניסוי כדי להביא את הטמפרטורה שלהם לשיווי משקל. לאחר מכן, בעת חיבור הגז, בדוק אם יש נזילות, ואז לחץ על המערכת.
לאחר מילוי המערכת בתמיסה, הקפד לטשטש אותה ולהסיר בועות אוויר. בדיקת מאווררי אמבט הרקמות מוצדקת גם כן. אוורור טוב יפיץ תרופות ביעילות, אך לא יערער את יציבות הרקמה מיד לפני הניסוי.
נתח את הרקמה. לאחר הרדמת החולדה, צור פנאומוטורקס באמצעות מספריים. קלל לאורך הסרעפת בתחתית כלוב הצלעות.
ואז חותכים מתחתית כלוב הצלעות לעצם החזה וחותכים את הרקמה. נקה את האיברים מעל עמוד השדרה כדי לאתר את אבי העורקים, שנמצא ישירות לאורך עמוד השדרה. כעת נתק את כל החיבורים לאבי העורקים וחתך את אבי העורקים בניצב לעמוד השדרה בגובה הסרעפת.
לאחר מכן, החזק בעדינות את אבי העורקים ונתח את אבי העורקים מעמוד השדרה. התחל באזור הסרעפת התחתונה הסמוך לעמוד השדרה והתקדם לכיוון הלב. רק היזהר לא למשוך או למשוך את רקמת אבי העורקים כי זה יכול להזיק לה באופן מיידי.
מניחים את אבי העורקים בכלי דיסקציה המכיל PSS. עכשיו קח חוט ועשה זווית קטנה של 90 מעלות. בקצה אחד, עוגן את הקצה הזוויתי של החוט בבסיס צלחת החיתוך.
לאחר מכן השחילו בזהירות את חוט ההנחיה ללומן אבי העורקים והחליקו את אבי העורקים על החוט. כאשר הקצה החופשי של החוט נראה לעין, כופפו אותו בעדינות ודחפו אותו לתוך הבסיס, ובכך ייצבו את הרקמה. כעת בעזרת מספריים ומלקחיים קטנים של ונוס, הסר את רקמת השומן הפרי-וסקולרית ורקמות זרות אחרות עד שאבי העורקים החזי נראה לבן וסיבי במקצת.
לאחר ניקוי הרקמות העודפות, הסר בזהירות את אבי העורקים הנקי מהחוט. סיים את החלק הזה על ידי חיתוך אבי העורקים לטבעות ברוחב של שלושה עד חמישה מילימטרים. טבעת אבי העורקים הגיעה.
הכינו שני ווי רקמה עם תפרים כדי לאבטח אותו בתא האמבטיה. וו אחד צריך להיות בעל תפר עם לולאה מסוקסת קטנה לחיבור למוט. הקרס השני זקוק לחתיכת תפר באורך 10 עד 14 סנטימטרים.
כדי לקשור קשר, חבר בזהירות זוג ווי רקמה אלה לכל טבעת אבי העורקים. היזהר להימנע מהסתבכות הווים. לאחר מכן, העבירו כל חתיכת טישו לצלחת PSS בטמפרטורת החדר עם מחזיק טישו מאובטח למעמד טבעת.
לאחר מכן, החלק את הלולאה הקשורה על יתד המוט והשתמש בחתיכת התפר הארוכה כדי להחזיק את הרקמה למעלה. לאחר מכן הכניסו את המוט לתא וודאו שהמוט מאובטח. כעת, קשרו את התפר מהוו שנותר למתמר הכוח.
השאירו מספיק רפיון בתפר, כך שניתן לכוונן את המתח בין מתמר הכוח לרקמה על ידי המיקרומטר. חזור על תהליך זה עבור כל טבעת בכל תא. כעת, הגדר את המתח הפסיבי.
השתמש במיקרומטר כדי להגביר את המתח לשני גרם והמתן עד שהמתח על הרקמה יפסיק לעלות. לאחר מכן הגדל את המתח בשני גרם נוספים, ושוב, המתן לשינוי במתח. לסיום.
המתח אמור להיות כעת בסביבות 3.2 גרם. חזור על תהליך זה על כל טבעת בכל תא. לאחר הגדרת כל המתחים הפסיביים, אפשר לרקמות להתאזן למשך שעה.
במהלך תקופה זו יש להחליף את ה-PSS כל 15 דקות ולבצע הכנות נוספות לניסוי, כגון הכנת התרופות בתום תקופת שיווי המשקל. שטפו את הטישו בפעם האחרונה, שמרו את הנתונים והחזירו את כל התשומות. לאחר מכן, בעקבות הפרטים בפרוטוקול הטקסט, בצע את האתגר הראשוני.
הקפד לתעד פעולות אלה בתוכנה. לאחר האתגר הראשוני, שינוי המתח יתייצב. לאחר מכן שטפו את תרופת האתגר כך שהטונוס של הרקמה יגיע לקו הבסיס.
תנו לרקמה לנוח בטונוס הבסיס הזה כ-10 דקות עכשיו לאמבטיה אחת ברכב במקרה זה, מים לשנייה. הוסף מספיק פרזוצין לריכוז של חמישה ננו-מולרים באמבטיה. תנו לאמבטיות הטישו לדגור במשך שעה ללא כביסה.
בינתיים, תקן את רין הפנול בטווח רחב של ריכוזים לאורך עקומה לוגריתמית. לאחר שעה הוסף אגוניסט פניל רין בריכוזים הולכים וגדלים לאמבטיה כדי ליצור תגובת ריכוז מצטברת. לאחר כל הוספה, המתן לתגובת הרקמה למישור לפני הוספת הריכוז הבא.
המשיכו להוסיף עד שהם כבר לא משנים את הטונוס של הרקמה או עד שכל עקומת התגובה תתייצב. במקום זאת, אבי העורקים החזי הודגר באנטגוניסט הקולטן האדרנרגי אלפא אחד POZ sim למשך שעה אחת לפני הוספת הפניל רין האגוניסט האדרנרגי אלפא אחד לאמבטיית הרקמות ויצירת עקומות תגובת התכווצות מצטברות של ההתכווצויות המקסימליות וחצי המקסימליות של פניל ריין. ברכב לבדו רקמות הבקרה מסומנות בירוק.
חצי המקסימום מזהה את הריכוז היעיל של התרופה. אותן מידות עבור הרקמה המטופלת ברזין נראות בשחור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את תפקוד השרירים החלקים באמבט רקמות מבודד.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את מדידת התכווצות איזומטרית בשריר חלק מבודד באמצעות מערכת אמבט רקמות. הוא מפרט את ההכנה ובדיקת טונוס השריר החלק, תוך דגש על החשיבות של שמירה על חיוניות הרקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- פרמקולוגיה
רקע
- מדידות של התכווצות איזומטרית הן חיוניות להבנת תפקוד השריר החלק.
- מערכת אמבט הרקמה המבודדת מאפשרת ניסויים מבוקרים.
- גמישות וקבלת תוצאות מהירות הן יתרונות מרכזיים של טכניקה זו.
- שיטה זו יכולה לענות על שאלות הנוגעות לאיתות של קולטנים ולתגובתיות של שריר חלק.
מטרת המחקר
- למדידת טונוס השריר החלק בהכנות מבודדות.
- להערכת תפקוד רצפטורים ואותות (signaling) בשריר חלק.
- להערכת ההשפעות של סוכנים פרמקולוגיים על תגובתיות השריר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה והכנת רקמה מאורטה של חולדה.
- הצבת הרקמה באמבט רקמה מבודד.
- כיול של חיישני כוח והגדרת המערכת.
- מדידת התכווצויות איזומטריות בתגובה לאגוניסטים.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של התכווצויות איזומטריות בטבעות אאורטות.
- הקמה של עקומות ריכוז-תגובה עבור פנילפרין.
- השוואה של תגובות התכווצות ברקמות מטופלות לעומת רקמות בקרה.
- זיהוי ריכוזים יעילים עבור חומרים פרמקולוגיים.
מסקנות
- אמבט רקמה מבודד יעיל לחקר דינמיקה של שריר חלק.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי התכווצויות המתווכות על ידי רספטורים.
- התוצאות יכולות להנחות התערבויות פרמקולוגיות המכוונות לשריר חלק.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת אמבט רקמה מבודדת מאפשרת מדידה מדויקת של כושר התכווצות שריר חלק, ומספקת נתונים קריטיים לתיקוף מטרות בתוכניות למחלות קרדיווסקולריות ומטבוליות. על ידי כימות העוצמה של אגוניסטים והיעילות של אנטגוניסטים ברקמה שלמה, שיטה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של התערבויות פרמקולוגיות לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization). השחזוריות והיכולת להרחבת קנה המידה הופכות אותה לכלי בעל ערך בתהליכי גילוי מוקדמים הדורשים תיקוף תפקודי של מטרות קרייתיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן מסלולי העברה של רספטורים באמצעות ניתוח תגובה לריכוז של אגוניסטים מכווצים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות כגון רספטורים אדרנרגיים בהקשר של רקמה רלוונטית פיזיולוגית.
- ערך ניבוי: תומך בהחלטות המשך (go/no-go) על ידי כימות השפעות התרופה על תוון הרקמה והתגובה המכווצת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר נתונים כמותיים וניתנים לשחזור של התכווצות איזומטרית המתאימים למסלולי סריקת תרכובות.
- סטנדרטיזציה: תומך בפיתוח פרוטוקולים סטנדרטיים להערכת תגובתיות כלי דם בין מעבדות שונות.
- סקלביליות (ניתנות להרחבה): תואם לגדלי רקמות שונים, מה שמאפשר אקסטרפולציה בין מינים, ממודלים של מכרסמים למודלים של בעלי חיים גדולים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל באופן ישיר את תפקוד השריר החלק בכלי דם במחקרים על יתר לחץ דם ואתרוסקלרוזיס.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים במערכות in vitro ליעילות פרה-קלינית על ידי שמירה על שלמות הרקמה ותגובתיות פיזיולוגית.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לבחירת מועמדים פרה-קליניים על בסיס נתוני כיווץ תפקודיים ולא רק על סמך זיקה של קישור (binding affinity).
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
אמבט רקמה מבודד משמש כבדיקה בשלב הגילוי, המנחה את בחירת המטרה ואת זיהוי המולקולה המובילה (lead identification) על ידי אספקת קריאות תפקודיות של תגובות שריר חלק המתווכות על ידי קולטנים.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת היפותזות לגבי תפקוד רצפטורים ואיתות בסביבות רקמה טבעיות.
- סריקה: מספקת ערכי EC50 ו-Emax המאפשרים דירוג של תרכובות לפי עוצמה ויעילות.
- אנליטיקה: מייצרת עקומות תגובה-ריכוז התומכות בהשוואה כמותית של סוכנים פרמקולוגיים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית כדי לתמוך בהשלכה למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת מטרות וסקולריות בתחומי טיפול מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי התכווצויות המתווכות על ידי רצפטורים, ובכך מפחית עמימות בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק פלטים סטנדרטיים וניתנים לשחזור באמצעות רכישת נתונים וניתוח מבוססי מחשב.
- ערך אסטרטגי: משפר את ניבוי היכולת לתרגום קליני על ידי הערכת השפעות התרופה ברקמה שלמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף תרכובות מבוסס סיכון על בסיס פעילות וסקולרית תפקודית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, קיבוע ובדיקות חיוניות.
- תלוי במתמירי כוח, ממירים מאנלוגי לדיגיטלי ומערכות פרפוזיה בבקרה טמפרטורלית.
- מחייב שימוש בתמיסות סטנדרטיות (למשל PSS) ובפרוטוקולי שיווי משקל כדי להבטיח עקביות בנתונים.
- חובה להתחשב בתכונות התכווצות ספציפיות לרקמה בעת ביצוע אקסטראפולציה בין מודלים.
- מוגבל לחלונות חיוניות של רקמות ex vivo, דבר המצריך ביצוע מהיר של הניסויים לאחר הדיסקציה.
