במבחנה אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H 3 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע אם תרכובות אנטי סרטניות פוטנציאליות מעכבות חומצת גרעין צלעות, או שעתוק RNA. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של תגובות שעתוק RNA, כולל מעכבים פוטנציאליים בניסוי זה, תרכובות CHO המציגות תכונות ציטוטוקסיות דיפרנציאליות נחקרות לעיכוב שעתוק RNA ומשווים למעכבים ידועים. לאחר ערבוב יסודי של התגובות, צינורות התגובה מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס ומסירים את האליקוטים בנקודות הזמן הרצויות.

אלקטרופורזה של ג'ל הבא משמשת להערכת עיכוב יחסי מכיוון שאירידיום ברומיד זוהר עם קשירת RNA, רצועות כהות יותר בג'ל תואמות לריכוזים גבוהים יותר של RNA. כדי לכמת את היקף עיכוב השעתוק, מבוצעת אולטרה סגול, נראה או UV לעומת ספקטרוסקופיה. בסופו של דבר, סרטון זה מדגים שיטה פשוטה להערכת תכונות מועמדות אנטי-סרטניות.

באמצעות הערכת עיכוב שעתוק על ידי אלמוגים, יש להעריך תרופות אנטי-סרטניות פוטנציאליות על יכולתן לעכב RNA. שעתוק. תאי סרטן אנושיים הופכים לעתים קרובות לתלויים באונקוגן מופעל יחיד לטיפולי הישרדות. חסימת ביטוי האונקוגנים יעילה בחיסול תאים סרטניים.

הליך עיכוב שעתוק ה-RNA המתואר כאן הוא דרך שימושית לזהות מועמדים פוטנציאליים לתרופות אנטי-סרטניות וללמוד עוד על מנגנון הפעולה שלהם. כדי להתחיל להכין את תרכובות קרול ומעכבים ביחס מולארי של 0.01 לאחד של קומפלקס ל-DNA. לשם כך יש להמיס את cin d Tripoli, TPFC וגליום TPFC ותחמוצת דימתיל סולף במיכלים נפרדים נקיים.

השג את הריכוז הסופי על ידי שימוש בדילול דגנים עם מים נטולי נוקלאז לפני תחילת תגובת השעתוק. הכן את הריאגנטים הדרושים בנפרד או רכוש אותם מספק מסחרי. הפשירו את כל הריאגנטים הקפואים על קרח.

לאחר מכן שלב את הריאגנטים לתגובת השעתוק בטמפרטורת החדר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים היטב על ידי הזזת הצינור או פיפטינג של התערובת בעדינות למעלה ולמטה לפני הדגירה של תערובת התגובה ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר ארבע אליקוטים של מיקרוליטר מכל תגובה לאחר כל שעה ואחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס, ושנה לפי הצורך לנקודות הזמן הרצויות לאחר תגובת השעתוק.

טהר את ה-RNA ממרכיבי התגובה האחרים באמצעות עמודות הספין של RNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט לביצוע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס הכנת מאגר ריצה של tris acetate EDTA או TAE ותמיסת מלאי של 1000 x של Etherium bromide. וכפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש ללבוש תמיד ציוד מגן מתאים בעת עבודה עם אתריום ברומיד מכיוון שהוא רעיל. לאחר מכן, הכינו ג'ל 1% על ידי המסת 10 גרם אגרוס אולטרה-טהור בליטר אחד של מאגר XTAE אחד והמסת האגרוס בתנור מיקרוגל קונבנציונאלי.

לאחר שהתקרר ל-50 מעלות צלזיוס, הוסיפו מיליליטר אחד של 1000 x אירידיום ברומיד לתמיסת הג'ל של 1% אגרוס וערבבו על ידי סיבוב עדין או על ידי היפוך במיכל סגור. לאחר מכן שפכו את תמיסת האגרו לפלטפורמת יציקת ג'ל ואפשרו לג'ל להתמצק בטמפרטורת החדר לאחר שהג'ל התמצק. הסר את הטריזים ממיכל האלקטרופורזה והוסף מספיק מאגר TAE כדי לכסות את הג'ל עד שהבארות שקועות.

בדוק שרמת מאגר ה-TAE היא כמילימטר אחד מעל מפלס הג'ל לפני הסרת מסרק הג'ל. כדי להכין את דגימות ה-RNA לאלקטרופורזה של ג'ל, שלב מיקרוליטר אחד מכל דגימה מטוהרת עם מיקרוליטר אחד של מאגר העמסת ג'ל מעורבב היטב על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם מיקרו פיפטה טען את הג'ל עם כל דגימה על ידי פיפטינג בזהירות של התמיסה לתחתית כל אחת. ובכן, הקפד לא להשאיר בועות אוויר או לערבב דגימות בין בארות.

חבר את המוליכים כך שה-DNA ינדוד לתוך הג'ל לכיוון העופרת החיובית. הגדר את המתח לרמה הרצויה. בדרך כלל אחד עד 10 וולט לסנטימטר ג'ל.

ג'ל בגודל 23 ס"מ על 25 ס"מ ב-250 וולט יפעל כשעה. ג'ל שמונה סנטימטר על שמונה סנטימטר ב -150 וולט יפעל כ -20 דקות. שברי RNA קטנים יותר פועלים ברזולוציה טובה יותר במתחים גבוהים יותר.

הפעלת הג'ל למשך זמן רב ככל שתספיק להפרדה משמעותית בין שברי RNA פוטנציאליים באמצעות נדידת צבעים כדי לעקוב אחר התקדמות ההפרדה. כבה את אספקת החשמל לפני שהצבע ממאגר הטעינה נדד לסוף תמונת הג'ל. ה-RNA באור אולטרה סגול כ-atherium bromide יזוהר , יצלם את התמונה וישווה את העוצמות הפלואורסצנטיות של ה-RNA המטוהר מכל מצב.

כדי לבצע כימות RNA באמצעות ספקטרוסקופיה UV V, הניחו שני מיקרוליטר מים על מכונה NanoDrop 2000 או דומה ומדדו את הריק. לאחר מכן, הניחו שני מיקרוליטר מכל דגימת RNA לאחר הטיהור על הספקטרופוטומטר ומדדו את האור הנראה האולטרה סגול מטווח אורכי גל של 200 ננומטר עד 800 ננומטר במקרה שהספיגה היא מעל צפיפות אופטית של אחד. לדלל את הדגימות במים נטולי נוקלאז כדי לקבל צפיפות אופטית קטנה מאחת.

לבסוף, השתמש בתוכנת גרפים כדי לשרטט את הדגימות השונות ולהשוות את הצפיפות האופטית ב-260 ננומטר אלקטרופורזה של ג'ל משמש להדמיית ה-RNA המתועתק. אם הקומפלקס מעכב את שעתוק ה-RNA, ייצור ה-RNA מצטמצם והתבאן ייראה קל יותר. אקטין d וטריפטולין מראים ירידה ברורה של RNA בהשוואה לביקורת כפי שמצופה ממעכבי אלה שנחקרו זמן רב.

לפס Gallium TPFC יש גם רמה נמוכה מאוד של RNA בעוד שרצועת ה-TPFC מראה עיכוב מועט עד ללא עיכוב ומציגה את אותה עוצמה יחסית כמו ה-UV הבקרה לעומת מדידות שנלקחו עבור כל דגימה. לאחר שעבר שעתוק RNA במשך ארבע שעות וטוהר עם כרומטוגרפיה של עמודת ספין RNA, הספקטרום של אורכי גל 220 ננומטר עד 350 ננומטר מוצג כאן.

שלוש מתוך ארבע תגובות השעתוק שטופלו במעכבים הניבו פחות RNA מאשר הביקורת, כאשר ה-DNA שטופל בגליום TPFC משעתק רק 14 יותר RNA מאשר ה-DNA המטופל ב-D-N-A-T-P-F-C שלא טופל לא הראה עיכוב נראה לעין. לפיכך, ציטוטוקסיות בקווי תאים המטופלים ב-TPFC אינה נובעת מעיכוב שעתוק RNA. לכל הדגימות יש יחס ספיגה של 260 על פני 280 ננומטר של כ-2.2 מה שמעיד על דגימות טהורות יחסית.

בעקבות הליך זה, ניתן לבדוק משתנים אחרים בתגובה כמו ריכוז וסדר החיבור על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מנגנון פעולה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע אם התרכובת האנטי-סרטנית שלך מעכבת את שעתוק ה-RNA. אל תשכח כי הברומיד עלול להיות מסוכן ביותר לבריאותך.

ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים ולעולם אל תמיסות מיקרוגל או אגרוס המכילים אתן ברומיד.