הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב Coli Escherichia

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חלבוני ממברנה המתבטאים ב-SIA coli לצורך ניתוחים מבניים ופונקציונליים. ראשית, החיידקים נקצרים, משקרים ומנותחים על ידי דף SDS להדמיה של חלבוני GFP המקופלים כהלכה על ידי פלואורסצנטיות אינגל. בשלב השני, הייצור של ה-e coli שנקבע לבטא את חלבוני הממברנה המעניינים מוגדל, ומכינים שבר ממברנה כולל מהתאים לאחר השראת ביטוי החלבון.

לבסוף, חלק הממברנה הכולל מסיס בארבעה חומרי ניקוי שונים ופיזור מונו של חומר הניקוי. מסיס. חלבוני GFP מנותחים על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. בסופו של דבר, ניתן לנטר את החלבונים על ידי פלואורסצנטיות ולשרטט את הפרופילים האלוציאניים כדי להעריך את פיזור הצבירה המונו ואת ה-GFP החופשי בדגימות.

הייצור של חלבוני ממברנה רקומביננטיים למחקרים מבניים ופונקציונליים נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל מסיסותם הנמוכה והם יורשים חוסר יציבות לאחר מיצוי לחומרי ניקוי. הניסיון הראה כי סינון גרסאות מרובות של חלבוני ממברנה כגון אורתולוגים ממינים שונים יכול לשפר את שיעור ההצלחה של ביטוי חלבון הממברנה. היתוך לחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים המשמשים לדיווח על קיפול אותנטי.

השלב הראשון בפרוטוקול מבוסס GFP שלנו לסינון ביטוי של חלבוני ממברנה ואי קולי משתמש בפלואורסצנציה של ליזטים של דטרגנט מתאים שלמים כדי לזהות את מבני חלבון הממברנה לניתוח נוסף על סמך רמת הביטוי במסך, לאחר מכן מוערכת ההתנהגות של בחירת חלבוני ממברנה וחומרי ניקוי שונים באמצעות זיהוי פלואורסצנטי יחד עם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. זה מספק מידע על פיזור המונו של קומפלקסי חלבון הניקוי. כדי לנתח ביטוי חיידקי המושרה על ידי IPTG התחל בהעברת מיליליטר אחד של שכפול e coline שטופל ב-IPTG מתרבית לילה 24 גושי באר עמוקים ל-96 גושי באר עמוקים, אטום את הבלוקים ולאחר מכן סובב את התאים למשך 10 דקות ב-6,000 פעמים G בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הפוך את הבלוק כדי לשפוך את המדיה תוך הקשה עדינה על מגבת נייר כדי לנקז את כל הנוזלים שנותרו. אוטמים שוב את הצלחת ומאחסנים את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחר 20 דקות לפחות. הפשירו את הכדורים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להשעות את התאים לחלוטין ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

טפל בתאים עם 20 מיקרוליטר של תמיסת DLPI רעדה ב-1000 סל"ד וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטר של 10% דודה מולטיסייד לכל באר ודגרו על התאים למשך 60 דקות נוספות בניעור. לאחר צנטריפוגת הטיפול ב-DDM, הבאר העמוקה חוסמת ולאחר מכן מעבירה 10 מיקרוליטר של הליזט המנוקה לצלחת מיקרוטיטר ומוסיפה 10 מיקרוליטר של מאגר טעינת ג'ל עמוד SDS.

כעת טען את הג'ל ב-10 מיקרוליטר מתמיסת חיץ הליזאט לכל באר והפעל את הג'ל במתח קבוע בין 100 ל-120 וולט בחדר קירור למשך שעתיים עד 2.5 שעות כאשר הסרעפת מגיעה לתחתית. הנח את הג'ל על הדמיה עם מסנן אור כחול כדי לזהות את חלבוני ההיתוך כדי להגדיל את תרביות התאים. לאחר הפיכת Eloqua של אי קולי מוכשר, בחר מושבה ל-10 מיליליטר של מרק כוח לצמיחה בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר יש לדלל חמישה מיליליטר מתרבית הלילה ל-500 מיליליטר של מרק כוח ולהמשיך לגדל את התרביות בטלטול ב-250 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. כאשר ה-OD ב-595 ננומטר הוא כ-0.5, השרה ביטוי על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של מילי-מולר אחד, ולאחר מכן הנח את התרבית בחזרה בשייקר למשך הלילה, הפעם ב-20 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, קצרו את התאים בצנטריפוגה ואחסנו את הכדורים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

להכנת קרומי התאים. השעו מחדש את כדורי טמפרטורת החדר השלישיים בחמישה מיליליטר PBS לגרם של כדור תא, והגדל את הנפח לפי הצורך עד שהצמיגות פוחתת לעקביות נוזלית. לאחר מכן הוסף מגנזיום כלוריד לריכוז סופי של DNA מילי-מולרי אחד לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר וטבליה אחת של מעכב פרוטאז ארוז מראש לכל 20 גרם של כדור תא לתאים.

לאחר מכן, פתחו את התאים באמצעות משבש תאים מקורר בלחץ של 30 KPSI ולאחר מכן גלולו את התאים והפסולת למשך 15 דקות בטמפרטורה של 30,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופינטה לצינור אולטרה-צנטריפוגה ואספו את שבר הממברנה הכולל על ידי סיבוב הסופינט למשך שעה אחת ב-200, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בהומוגנייזר התאים כדי להשעות מחדש את גלולת הממברנה ב-10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי להמיס את הממברנות עבור כל חומר ניקוי לשימוש.

Aliquot 900 מיקרוליטר של תרחיף הממברנה לתוך צינור פולי צנטריפי בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מכל חומר ניקוי טרי שהוכן לצינורות המתאימים של 1.5 מיליליטר ודגרו את התערובות בארבע מעלות צלזיוס עם צמחייה קלה. לאחר שעה, גלולה את חומר הניקוי והשברים המסיסים עם אולטרה צנטריפוגה שולחנית, וודא שהצינורות מלאים לפחות למחצה ושומרים על חומר השכיבה לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי או ניתוח FEC.

לאחר מכן, עמודת אי הכללה בגודל קו המשווה עם טווח פיצול רחב עם מאגר זרימה רץ בקצב של 0.3 מיליליטר לדקה. לאחר מכן הזרקו 100 מיקרוליטר של דגימת ממברנה מסיסה על העמודה באותו קצב זרימה ופקחו על פרופיל האלוסיאן באמצעות אופטיקה פלואורסצנטית. לבסוף, ייבא את נתוני הנפח האלוסיאני ועוצמת הקרינה לתוכנית גיליון אלקטרוני לתצוגה גרפית ונתח את חומר הממברנה המסיס שנותר על ידי פלואורסצנטי אינגל.

כפי שהודגם קודם לכן, משפחת החלבונים האמורה חיונית לחלוקת תאי חיידקים. בתמונות אלה מוצג נציג בהדמיה פלואורסצנטית של ג'ל של 24 OUTTA 47 מבנים אמרים. עוצמת הרצועות נותנת אינדיקציה לרמת הביטוי.

לדוגמה, חלבון ההיתוך בסצנה הרביעית מתבטא היטב בשני הזנים. עם זאת, רצועות המשקל המולקולרי הנמוכות הנוספות מצביעות על כך שהחלבון מתפרק חלקית בנתיבים רבים. יש רצועה שמתאימה בגודלה ל- GFP בלבד.

לדוגמה, G ארבע ו-H ארבע מפורקים לחלוטין ל-GFP חופשי בזן C 41 DE שלוש P שוכב S. ואילו ב-LEMO 21 DE שלוש, יש חלבון שלם בגרפים האלה. ניתוח של שני מבנים שביצעו ביצועים טובים במסך הראשוני על ידי אי הכללת גודל פלואורסצנטית מדגים כיצד החלבונים מתנהגים בצורה שונה בהתאם לאיזה מארבעת חומרי הניקוי נבדקו.

לדוגמה, חלבון זה נתן רק שיא סימטרי עם צבירת פסולת בדול מולטיסייד מה שהופך אותו לחומר הניקוי המועדף לטיהור לאחר מכן. לעומת זאת, חלבון ההיתוך האחר הראה פרופיל דומה בכל חומרי הניקוי שנבדקו. ניתן להרחיב פרוטוקול זה בקלות כך שיכלול, למשל, זני אי קולי שונים הגדלים בתנאי ביטוי שונים ומרתיעים נוספים במסכים ראשוניים ומשניים כאחד.

לסיכום, המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לאפשר סינון של מספר רב של חלבוני ממברנה מבחינת ביטוי וחומרי ניקוי על מנת לזהות מועמדים לניתוח נוסף.