הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב

המטרה הכללית של הליך זה היא לזהות חלבון ממברנה המובעים ב-SIA coli לצורך ניתוחים מבניים ותפקודיים. ראשית, החיידקים נאספים, נליזים וננותחים באמצעות SDS page להדמיה של חלבוני GFP מקופלים כהלכה באמצעות פלואורסצנציית Ingel. בשלב השני, הייצור של ה-e coli שנקבע כי הוא מביע את חלבוני הממברנה הרלוונטיים מוגדל, ומוכן שבר ממברנה כולל מהתאים לאחר השראת ביטוי החלבון.

לבסוף, פракציית הממברנה הכוללת מומסת בארבעה דטרגנטים שונים, והמונו-דיספרסיות של חלבוני ה-GFP המומסים בדטרגנט מנותחת באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography). בסופו של דבר, ניתן לעקוב אחר החלבונים באמצעות פלואורסצנציה, ולהגדיר את פרופילי האלוציה כדי להעריך את רמת האגרגציה, המונו-דיספרסיות וכמות ה-GFP החופשי בדגימות.

ייצור של חלבון ממברנה רקומביננטי למחקרים מבניים ותפקודיים נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל מסיסותם הנמוכה וחוסר היציבות שהם מקבלים לאחר חילוץ באמצעות דטרגנטים. הניסיון הראה שסריקה של וריאנטים מרובים של חלבוני ממברנה, כגון אורתולוגים ממינים שונים, יכולה לשפר את שיעור ההצלחה של ביטוי חלבוני ממברנה. חיבור לחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים משמש לדיווח על קיפול אותנטי.

השלב הראשון בפרוטוקול מבוסס GFP שלנו לסריקת ביטוי של חלבוני ממברנה ב-e coli משתמש בפלואורסצנציה בתוך הג'ל של ליזטים עם דטרגנט מתאים של תאים שלמים, כדי לזהות את קונסטרוקטי חלבוני הממברנה לאנליזה נוספת בהתבסס על רמת הביטוי בסריקה. התנהגותם של חלבוני ממברנה נבחרים ודטרגנטים שונים מוערכת לאחר מכן באמצעות זיהוי פלואורסצנציה המשולב עם כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (SEC). דבר זה מספק מידע על המונו-דיספרסיוניות של קומפלקסי הדטרגנט-חלבון. כדי לנתח ביטוי בקטריאלי שהושרה על ידי IPTG, התחילו בהעברה של 1 mL של e coli שעבר טיפול ב-IPTG, משכפלים, מתוך בלוקים של 24 בארות עמוקות של תרבית לילה לבלוקים של 96 בארות עמוקות; אטמו את הבלוקים ולאחר מכן הריצו את התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-6,000 ×g בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הפכו את הבלוק כדי לשפוך את המצע, תוך הקשה עדינה על נייר סופג כדי לנקז שאריות נוזל. אטמו את הפלטה שנית ואחסנו את התאים בטמפרטורה של 80- degrees Celsius לאחר 20 דקות לפחות. הפשיקו את הפלטים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי לסספנד את התאים במלואם ב-200 µL של lysis buffer.

טפל בתאים עם 20 µL של תמיסת DLPI תוך ניעור במהירות של 1000 RPM ובטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 25 µL של 10% DDM לכל באר והדגר את התאים למשך 60 דקות נוספות עם ניעור. לאחר הטיפול ב-DDM, סבב במערך צנטריפוגה את בלוק הבארים העמוקות והעבר 10 µL מהליזט המצולל ללוחית מיקרוטיטר, והוסף 10 µL של בופר טעינה לג'ל SDS page.

כעת טענו את הג'ל עם 10 µL של תמיסת בופר הליזאט לכל באר, והריצו את הג'ל במתח קבוע שבין 100 ל-120 volts בחדר קר למשך שעתיים עד 2.5 שעות, עד שהדיאפרגמה תגיע לתחתית. הניחו את הג'ל על מכשיר דימוי (imager) עם מסנן אור כחול כדי לזהות את חלבוני הפוזיה לצורך הגדלת תרביות התאים. לאחר טרנספורמציה של תאי e coli כשירים, העבירו מושבה אחת ל-10 mL של power broth לצמיחה לילה במבטב בטמפרטורה של 37 °C.

בבוקר למחרת, דללו חמישה מיליליטר של תרבית הלילה לתוך 500 מיליליטר של power broth והמשיכו לגדל את התרביות תחת ניעור ב-250 RPM ובטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר ה-OD באורך גל של 595 ננומטר הוא בערך 0.5, השרו את הביטוי על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 1 מילימולר, ולאחר מכן החזירו את התרבית למנער למשך הלילה, הפעם בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בבוקר למחרת, קצרו את התאים באמצעות סנטריפוגה ואחסנו את המשקעים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

להכנת ממברנות התאים, יש לסבב מחדש את משקעי התאים השלישיים בטמפר PBS בנפח של חמישה מיליליטר לגרם של משקע תאים, ולהגדיל את הנפח במידת הצורך עד שהצמיגות תרד למרקם נוזלי. לאחר מכן, יש להוסיף למסות של התאים מגנזיום כלוריד בריכוז סופי של 1 millimolar, DNAs בריכוז סופי של 10 µg/mL וטבליה אחת של מעכב פרוטאזאה ארוזה מראש לכל 20 גרם של משקע תאים.

בשלב הבא, פתחו את התאים באמצעות מפצח תאים מקורר בלחץ של 30 KPSI, ולאחר מכן השקיעו את התאים שלא נפתחו ואת השאריות למשך 15 דקות ב-30,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הנוזל העליון לשפופרת אולטרסנטריפוגה ואספו את פראקציית הממברנה הכוללת על ידי סבב של הנוזל העליון למשך שעה אחת ב-200,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמשו בהומוגניזר תאים כדי לסuspended מחדש את משקע הממברנה ב-10 milliliters של PBS קר מאוד, כדי להמיס את הממברנות עבור כל דטרגנט שייעשה בו שימוש.

העבירו מנה של 900 µL מת сусפנסיית הממברנה למבחנה פוליפרופילן עם מכסה לסרכזגה בנפח 1.5 mL. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL מכל חומר דטרגנט שהוכן טרי למבחנות ה-1.5 mL המתאימות והדגירו את התערובות בטמפרטורה של 4 °C תחת ערבוב עדין. לאחר שעה, השקיעו את פראקציות הדטרגנט והפראקציות הממיסות באמצעות אולטרסנטריפוגה לשולחן, תוך וידוא שהמבחנות מלאות לפחות עד חצייה, ושמרו את העלייה (supernatant) לצורך כרומטוגרפיית גודל השראה עם זיהוי פלואורסצנטי או אנליזת FEC.

בשלב הבא, השתמש בעמודת הפרדה לפי גודל (size exclusion) של equator בעלת טווח הפרדה רחב, עם תמיסת זרימה (flow buffer) בקצב של 0.3 milliliters per minute. לאחר מכן, הזרק 100 microliters של דגימת ממברנה מומסת לעמודה באותו קצב זרימה, ועקוב אחר פרופיל האלוציה באמצעות אופטיקה פלואורסצנטית. לבסוף, ייבא את נתוני נפח האלוציה ועוצמת הפלואורסצנציה לתוכנת גיליון אלקטרוני להצגה גרפית, ובחן את חומר הממברנה המומס שנותר באמצעות פלואורסצנציית ג'ל (in-gel fluorescence).

כפי שהודגם קודם לכן, משפחת חלבונים זו חיונית לחלוקת תאים חיידקיים. בתמונות אלו מוצג מיזוג של ויזואליזציה פלואורסצנטית בג'ל עבור 24 מתוך 47 מהבניות האמורות. עוצמת הפסים מעידה על רמת הביטוי.

לדוגמה, חלבון החיבור במסלול ארבעה מבוטא היטב בשני הזנים. עם זאת, פסים נוספים בעלי משקל מולקולרי נמוך יותר מעידים על כך שהחלבון עובר פירוק חלקי במסלולים רבים. קיים פס התואם בגודלו ל-GFP לבדו.

לדוגמה, G four ו-H four מתפרקים לחלוטין ל-GFP חופשי במאבקי C 41 DE three P lies S. לעומת זאת, ב-LEMO 21 DE three, ניתן לראות בגרפים אלה חלבון שלם מסוים. ניתוח של שני מבנים שביצעו ביצועים טובים בסריקה ראשונית באמצעות הפרדה בגודל על ידי פלואורסצנציה מדגים כיצד החלבונים מתנהגים באופן שונה בהתאם לאחד מארבעת הדטרגנטים שנבדקו.

לדוגמה, חלבון זה הראה רק שיא סימטרי עם אגרגציה מועטה ב-Dool Multiside, מה שהפך אותו לדטרגנט המועדף לניקוי המשכי. לעומת זאת, חלבון היתוך אחר הראה פרופיל דומה בכל הדטרגנטים שנבחנו. ניתן להרחיב פרוטוקול זה בקלות כך שיכלול, למשל, זנים שונים של e coli שגודלו תחת תנאי ביטוי שונים ודטרגנטים נוספים הן בסריקות ראשוניות והן בסריקות משניות.

לסיכום, המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לאפשר סריקה של מספר רב של חלבוני ממברנה מבחינת ביטוי וסולבליזציה בדטרגנט, במטרה לזהות מועמדים להמשך ניתוח.