הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות במבחנה ו In vivo

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את היעילות של רגישות לתרופות לסרטן על ידי מדידת שינויים בחילוף החומרים של התאים במבחנה ותדירות גרורתית in vivo. זה מושג על ידי טרנסקטציה ראשונה של תאים סרטניים במבחנה עם מולקולות אנטי-סנס כדי להפיל את המטרה המעניינת. לאחר מכן, התאים המועברים מצופים על שבבי חיישנים ביולוגיים ונטענים למערכת מדידת חילוף חומרים כדי לספור שינויים בהחמצה, בנשימה ובהידבקות במהלך טיפול תרופתי.

בנפרד, תאים שעברו טרנספטציה מטופלים בתרופה ומוזרקים למחזור הוורידי של עובר תרנגולת על מנת להעריך את ההשפעות על התדירות הגרורתית. התוצאות מראות רגישות לתרופות לסרטן כפי שמומחש על ידי שינויים בחילוף החומרים של התאים ובתדירות גרורתית. טכניקה זו מרחיבה את פיתוח הטיפול בסרטן מכיוון שהיא מאפשרת הערכה בו זמנית של פרמטרים שלא תמיד נלקחים בחשבון במהלך בדיקות פרה-קליניות קונבנציונליות של מטרות או תרכובות תרופתיות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מטרות תרופות חדשות המעורבות בתיקון DNA, ניתן ליישם אותה גם לאימות מטרה במערכות אחרות כגון בקרת מחזור התא. לאחר העברת תאי גידול עם אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס, על פי פרוטוקול הטקסט בסביבה סטרילית, השתמש ב-400 מיקרוליטר של PBS כדי לשטוף בזהירות שישה שבבי חיישן ביולוגי כדי לעקר את השבבים, הסר את ה-PBS והוסף 400 מיקרוליטר של 70% אתנול דגירה למשך 20 דקות לפני השימוש ב-PBS כדי לשטוף את השבבים שלוש פעמים. מניחים שלושה צ'יפס כל אחד בכלי תרבית סטריליים, מסומנים בבקרה ויעד מעניין, ומסמנים שני צינורות של 50 מיליליטר בצורה דומה.

לאחר מכן, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים שעברו טרנספטציה לפני הוספת נפח מתאים של 0.25% טריפסין EDTA, המתן עד שהחד-שכבה תתנתק והעביר את תרחיף התא לצינור המתאים. לאחר ספירת התאים, התאם את הנפח כדי להגיע לריכוז סופי של 6.0 כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר על ידי הוספת מדיום או ריכוז התאים. הכנת קבוצה אחת בכל פעם, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת תאים לכל שבב חיישן ביולוגי.

הניחו את הכלים הסטריליים המכילים את הצ'יפס בתוך תא לחות כדי למנוע אידוי ודגרו למשך הלילה כדי לבצע מדידות חילוף חומרים בהתאם למתווה הניסוי המפורט בפרוטוקול הטקסט תווית 1450 מיליליטר צינורות והוסיפו 50 מיליליטר של צמיחה, בינונית פלוס 0.2% FBS ו-x פניצילין וסטרפטומיצין. או נ.ב. הנח שישה צינורות במערכת מדידת חילוף חומרים אחת, מתלה צינורות שש באחרת ואת הצינור הנותר במדף צינור שלישי המכיל גם צינורות עם ציספלטין. השתמש בקרום חדיר אוויר כדי לאטום את שני המדפים הראשונים כדי למנוע אידוי.

לאחר מכן, הכינו נפח מתאים של שישה ציספלטין מיקרו-מולרי בבינוני עם 0.2% FBS ו-XPS אחד. הוצא את הנפח הנדרש של המדיום לארבעה צינורות מסומנים של 50 מיליליטר, והנח אותם בחזרה לארבעת החריצים של מתלה צינור מדידת חילוף החומרים השלישי. השתמש בקרום חדיר אוויר כדי לאטום את הצינורות.

סמן שש שפופרות של 50 מיליליטר והוסף 20 מיליליטר לכל אחד מתמיסת טריטון X של 0.1% במדיום, תמיסת טריטון X תשכב את כל התאים שנותרו ותספק ערך אפס לכל שבב. הניחו את הצינורות במתלה צינור רביעי ואטמו אותם. לאחר מכן טען את השבבים למודולים הביולוגיים.

טען את שני הברקים לתוך מחזיק שני הברקים, ולאחר מכן התחל את הניסוי. לאחר הכנת עוברי תרנגולות כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט ביום השני של העברת התאים, חלקו את קבוצות העניין והביקורת לשתי צלוחיות לרכב ושתיים לציספלטין. שאפו את המדיום והשתמשו בשלושה מיליליטר טרי, בינוני או בינוני עם שישה ציספלטין מיקרומולריים לחידוש.

הצלוחיות דוגרות במשך שש שעות. לאחר הדגירה שואבים את המדיום, ואז שוטפים ומנסים להחזיר את התאים, מעבירים את תרחיף התאים לארבעה צינורות של 15 מיליליטר המסומנים כראוי לפני הסיבוב ושימוש ב-PBS כדי לשטוף שלוש פעמים Resus משהה מחדש את התאים. ולאחר מכן, לאחר הספירה, השתמש ב-PBS כדי לדלל או צנטריפוגה כדי לרכז את התאים לריכוז סופי של 1.0 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר.

העבירו את תרחיף התאים לצינורות של חמישה מיליליטר המסומנים להזרקה והניחו על קרח. לאחר מכן, הניחו בצד עוברי תרנגולות בני 24 ו-9 ימים להזרקה תחת מיקרוסקופ סטריאו ובאמצעות מחט זכוכית המחוברת לצינור גמיש המחובר למזרק מיליליטר אחד בתנועה פועמת איטית. הזרקו 1.0 פעמים 10 לתאים החמישיים בנפח של 100 מיקרוליטר למחזור הוורידי של קרום הצ'ואל טויק או פקה בעזרת ניגוב רך.

טפחו בעדינות את מקום ההזרקה כדי לעצור את זרימת הדם ולספוג כל שפיכת ספין. סמן כל מיכל עובר כראוי לאחר כל הזרקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אשר את נוכחותם והפצתם של תאים פלואורסצנטיים בכלי הדם של המצלמה.

שימו לב לכל עובר שבו מספר תאי הגידול נראה נמוך או שההתפלגות גרועה. לבסוף, הניחו את עוברי התרנגולות בתא לחות ודגרו במשך שבעה עד תשעה ימים לפני ספירת מוקדים גרורתיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כפי שמוצג כאן לאחר 24 שעות אנושיות, 5 49 תאי סרטן ריאות שטופלו ב-BRCA שניים מכוונים ל-SO וציספלטין הראו ירידה מוקדמת ובלתי הפיכה בנשימה בהשוואה לתאים שקיבלו ביקורת SO וציספלטין בלבד. הירידה של 39% בהשוואה לתאי הביקורת שטופלו החלה כ-10 שעות לפני ירידה ניתנת לזיהוי בהידבקות התאים, מה שמרמז על כך שהיא התרחשה ללא תלות בשינויים במספר התאים וכי ייתכן שמדובר באירוע מעצב שקדם למוות תאי כפי שמודגם כאן.

לא נצפה הבדל בהחמצה במהלך הניסוי בן 72 השעות, מה שמצביע על כך שלטיפול ב-BRCA 2 a SO ו-cisplatin הייתה השפעה מועטה עד אפסית על חילוף החומרים של הגלוקוז. בניסוי זה, תאי סרטן ריאה אנושיים A 5 49 טופלו בביקורת SO או BRCA 2 A SO בנוכחות או היעדר ציספלטין והוזרקו למחזור הוורידי של ה-cam. תשעה ימים לאחר מכן, תאים שטופלו ב-BRCA 2 a SO ו-cisplatin הראו שכיחות נמוכה ב-77% של מוקדים גרורתיים בהשוואה לתאים שטופלו ב-SO ביקורת ו-cisplatin או BRCA 2 A SSO בלבד, מה שמצביע על כך שלטיפול ב-BRCA 2 a SO ו-cisplatin יש פוטנציאל להפחית או למנוע עומס גרורתי בחולים עם גידולים מוצקים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות מסורתיות יותר כגון התפשטות תאים, בדיקות ומחקרי קסנוגרפט in vivo על מנת לחקור עוד יותר את התרומה של מטרה מסוימת להגברת הרגישות לתרופות.