לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה
6 במרץ 2015
כאן אנו מתארים טכניקה לקנולציה של צינור הלימפה המזנטרי בחולדות המאפשרת כימות של הובלת שומנים ותרופות דרך מערכת הלימפה לאחר מתן המעי. ניתן להתאים את הטכניקה להערכת ריכוזי לימפה מזנטרית ו/או הובלה של נוזלים, תאי חיסון, פפטידים, חלבונים ומולקולות ליפופיליות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את קצב והיקף ההובלה של ליפידים ותרופות אל מערכת הלימפה של המעי לאחר מתן למעי. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד וקנולציה של צינור הלימפה המזנטרי (mesenteric lymph duct) לצורך איסוף לימפה. בשלב השני, מתבצעת קנולציה של התריסריון (duodenum) כדי לאפשר עירוי למעי, ולאחר מכן מתבצעת קנולציה של העורק הגרוני (carotid artery) כדי לאפשר איסוף של דגימות דם.
בשלב הסופי, הטיפול הניסויי מועבר לתריסריון, והלימפה והדם נאספים לצורך כימות רמות ליפידים או תרופות סיסטמיות. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במודל זה כדי להעריך את הספיגה הכוללת ואת ההסעה הלימפטית המעיית של ליפידים ותרופות בעקבות מתן למעי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת קנולציה ישירה של צינור הלימפה המזנטרי ואיסוף לימפה לאורך כל תקופת הניסוי.
דבר זה מאפשר הערכה של כמות החומר המוחלטת הזורמת אל תוך ובתוך הלימפה המזנטרית. In vivo, למרות שדגם זה מאפשר הערכה in vivo של הובלת תרופות וליפידים, ניתן להשתמש בו גם למדידת ההובלה הלימפטית המעיית של כל גורם רלוונטי, וכן לבחינת השינוי בהובלה לימפטית של גורמים אלו בתגובה לאתגרים שונים או למצבים פתולוגיים.
הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן הקניולציה של צינור הלימפה המזנטרי היא מורכבת וקשה בשל העובדה שהצינור קטן ושביר בבעלי חיים בצום. את הפרוצדורה תדגים עמיתתי וחברתה לסגל כאן באוניברסיטת מונאש, ד"ר Natalie cus, ופוסט-דוקטורית בכירה בקבוצה, ד"ר LJ Hugh. ביום שלפני הניתוח, חתכו את הקניולות לאורכים המתאימים והשתמשו בלהב ניתוחי סטרילי כדי ליצור שיפוע בקצה של כל קטע פיתול. לאחר מכן, כדי להכין את הקניולה התרי-דוודנאלית, כופפו את הקניולה חזרה על עצמה וחממו אותה כדי ליצור נקודת עיגון בתוך הפיתול.
ביום הניתוח, גלחו את הפרווה מהצד הימני של הבטן, מהצוואר ומאזורי הבריח השמאליים של חולדה בוגרת תחת הרדמה, ולאחר מכן נקו את אזורי הניתוח באופן אספטי באמצעות שלושה שפשופים רצופים של תמיסת פובידון יוד ו-70% ethanol לצורך קנולציה של צינור הלימפה. הניחו את החיה כאשר צדה הימני פונה כלפי מעלה והשתמשו בלהב סקלפל סטרילי כדי לפתוח את השכבה העליונה של דופן שרירי הבטן בחתך ישר של ארבעה סנטימטרים, המשתרע מהתהליך החרבני (xiphoid process) אל השוק הימני, כשני סנטימטרים מתחת לשולי הצלעות. דחפו את המעי הדק תחת דופן הבטן השמאלית והשתמשו בשתי עד שלוש פיסות גזה סטריליות רוויות ב-normal saline כדי להחזיקו במקומו.
לאחר מכן, הגביהו את החולדה מעל מזרק פלסטיק בנפח 10 milliliter המוצב בצורה אופקית מתחת לגב החיה, בגובה הכליה הימנית. כדי לסייע בויזואליזציה של צינור הלימפה המזנטרי, אתרו את צינור הלימפה המזנטרי העליון, שקוטרו כ-0.5 עד 1 millimeter, הממוקם בניצב לכליה הימנית, ומיד במיקום rostral ובמקביל לעורק המזנטרי הפועם בצבע אדום כהה. שימו לב שבחולדות שאינן בצום, כפי שמוצג כאן, צינור הלימפה המזנטרי העליון הוא לבן, אטום וקל יותר לזיהוי מאשר בחולדות נגועות.
בשלב הבא, העבירו זוג פינצטות ישרות דרך רקמת השומן של הפרינאום (perineal fat bed) בשוליים התחתונים של הכליה הימנית, במקביל לצינור הלימפה המזנטרי העליון (superior mesenteric lymph duct), ודרך שכבות רקמת החיבור הנמצאות מיד מתחת לווריד הנבוב (vena cava). לאחר מכן, באמצעות קצה הפינצטה, משכו את קנולת הלימפה דרך רקמת השומן של הפרינאום, כך שקצה אחד יהיה סמוך לצינור הלימפה המזנטרי והקצה השני יהיה חיצוני לגוף בעובר בגובה הכליה הימנית. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ כירורגי ופינצטות עדינות (jewelers forceps), בדלו את צינור הלימפה המזנטרי מבעד לשכבות רקמת החיבור והשומן העלונות באמצעות דיסקציה קהה, החל מהקצה התחתון, תוך הקפדה שלא לפגוע בצינור הלימפה לאחר בידודו.
השתמשו בקצה של פינצטה עדינה כדי ליצור חור קטן בצינור הלימפה. לאחר שווידאתם שקנולת הלימפה מלאה לחלוטין בתמיסת נוגדי קרישה ושאין בה בועות אוויר, השתמשו בפינצטה קטנה כדי להחדיר את קנולת הלימפה לעומק של כשני עד ארבעה מילימטרים לתוך צינור הלימפה המזנטרי דרך נקודת הדקירה. אם הקניולציה הצליחה, תצפתה זרימה הדרגתית של לימפה מהמעי מהקצה החופשי של הקנולה.
כאשר הדבר קורה, יש להניח טיפה קטנה של דבק ציאנואקרילט מעל חור הכניסה לצינור הלימפה כדי לקבע את הקנולה, תוך הקפדה לא לחסום את כלי הדם בעודף דבק לצורך קנולציה של התריסריון. ראשית, אתרו את הרקמה כחלק ורוד בהיר של המעי הדק שבעזרת משיכה עדינה כלפי מטה, חושפת את הקיבה. לאחר מכן, השתמשו במחט סטרילית במידה 23 כדי ליצור חור דקירה קטן בתריסריון באזור הפילורוס, כשני סנטימטרים מתחת לחיבור שבין הקיבה לתריסריון.
בשלב הבא, הכניסו את קצה התלולית בצורת J של הקנולה הדואודנלית דרך נקודת הדקירה וקבעו את הקנולה במקומה בעזרת טיפה של דבק Sano acrylate. לאחר מכן, השתמשו בתפרים כדי לסגור את החתך בדופן שרירי הבטן. את הקנולציה של העורקיד הקרוטידי ניתן לבצע לפני או אחרי הקנולציה של צינור הלימפה המזנטרי. בדרך כלל אנו מעדיפים לבצע קנולציה לעורקיד הקרוטידי לפני הקנולציה של צינור הלימפה, כדי להפחית את הפוטנציאל להוצאת קנולת הלימפה ממקומה בעת הזזת בעל החיים. כדי לבצע קנולציה לעורקיד הקרוטידי, סמנו תחילה את קנולת העורקיד הקרוטידי במרחק של 2.5 סנטימטרים מקצה השיוף כדי לזהות את חלק הפבינה שיש להחדיר לעורקיד.
לאחר מכן, חברו את הקצה שאינו משופע של הקנולה למחט בכיליובר 25 המחוברת למזרק מלא בתמיסת נוגדי קרישה, ומלאו את הקנולה בתמיסה, תוךما וידוא שאין בתוכה בועות אוויר. לאחר מכן, בצעו חתך אורך של 1 עד 1.5 סנטימטר דרך שכבת העור מעל צד שמאל של הקנה במישור הסגיטלי, והשתמשו בפינצטה בעלת קצה קהה כדי להפריד את רקמת החיבור התת-עורית ולחשוף את שרירי הצוואר הזוגיים שמתחתיה. הסיטו את שרירי הצוואר כדי לחשוף את העורק הקרוטידי השמאלי הפועם, הנמצא כסנטימטר אחד מתחת לפני העור.
לאחר מכן, נקו את רקמת החיבור העוטפת את העורק באמצעות דיסקציה קהה, והשתמשו בפינסטות רקמה קהות כדי לבודד מקטע של כסנטימטר אחד מהעורק. בשלב הבא, השתמשו בפינסטות בעלות קצה דק כדי להשחיל שתי תפרי משי מתחת לעורק התרדמה (carotid artery), תוך מיקומן בכל אחד מקצותיו של מקטע העורק המבודד. לאחר מכן, קשרו את התפר הרחוק ביותר מלב החולדה ומהבדיקה (clavicle), והניחו זוג פינסטות ישרות בעלות קצה דק מתחת לעורק התרדמה כדי לחסום את זרימת הדם בעורק.
כעת, באמצעות מספרי איריס בעלי קצה דק, בצעו חתך קטן על פני השטח העליונים של העורק, במרחק של כשליש מהחלק העליון של האזור המבודד. הכניסו את קצה הקנולה לתוך העורק באמצעות פינצטה בעלת קצה מעוקל. לאחר ההחדרה, הסירו את הפינצטה הדקה והישרה, ובכך חסמו את זרימת הדם, והקידמו את הקנולה 2.5 centimeters לתוך העורק באמצעות שני זוגות של פינצטות.
אחד יחזיק את הקנולה בתוך העורק כדי למנוע דליפת דם חזרה, והשני יחדיר את הקנולה. לאחר מכן, השתמשו בתפסנית עורקים קטנה כדי לקבע את הקנולה בתוך העורק. מזריקו תמיסת נוגדת קרישה לתוך הקנולה, ולאחר מכן משאבים כמות קטנה של דם כדי לוודא את פתוחותו של הצינור.
לאחר מכן, שטפו את הקנולה בתמיסת נוגד קרישה ואטמו את הקצה באמצעות להבת מצית. לבסוף, השתמשו בתפרים כדי לקבע את הקנולה במקומה והסירו את ת clamp של העורק. לאחר מכן, הדקו תפר שלישי סביב העורק והקנולה, קצרו את אורך התפרים סביב העורק וסגרו את פצע הצוואר בתפרים נוספים לאחר תקופת ההחלמה; הזרקו את הפורמולציה הרלוונטית לתוך בעל החיים באמצעות קנולת התריסריון.
כפי שמוצג בגרף, לאחר מתן התרופה הליפופילית halal fanene במודל, קצב זרימת הלימפה הממוצע עבור חולדות שעברו קנולציה מוצלחת היה בין 0.4 ל-1.3 milliliters per hour. בחלק מהבעלי החיים, קצב זרימת הלימפה היה נמוך מעט במהלך השעה עד שלוש השעות הראשונות לאחר הקנולציה לפני שעלה, תופעה הנצפית לעיתים קרובות לאחר קנולציה לימפתית מוצלחת. לעומת זאת, בחולדות שעברו קנולציה לא מוצלחת, קצב הזרימה נותר נמוך משמעותית מזה שנראה בניסויים המוצלחים לאורך כל תקופת האיסוף.
באופן דומה, בניסויים מייצגים אלו, התובלה הלימפתית המצטברת של טריגליצריד ושל RIN חלאל הייתה נמוכה משמעותית בבעלי החיים שבהם הקנולציה לא הצליחה. זאת, בעוד שבקבוצות שבהן הקנולציה הצליחה, התובלה המצטברת הממוצעת של החלאל הייתה 15.1% מהמינון, והתובלה המצטברת של הטריגליצריד הייתה 61 milligrams לאורך 10 שעות. בניסוי מייצג זה של תובלת ליפידים, חלקו של מינון הליפידים האקסוגניים המסומנים רדיואקטיבית שהובלו בלימפה היה 54%. ערכים אלו לא היו שונים באופן מובהק מאלו שנצפו בעבר.
עבור פורמולציה דומה, קצב ההובלה של טריגליצרידים ותרופות למערכת הלימפה מגיע לשיאו מספר שעות לאחר מתן השומן והתרופה, ולאחר מכן חוזר לרמות הבסיס. הדבר אופייני לניסויי הובלה של שומנים ותרופות בלימפה של המעי. קצב הובלת התרופה בלימפה בכל פרק זמן משקף את התמונה של הובלת הטריגליצרידים, שכן התרופה מובלת אל תוך הלימפה.
בקשר לליפופרוטאינים העשירים בטריגליצרידים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את הקניולציה בתוך 30 דקות, בתנאי שלא נתקלו בקשיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבודד את הרכיבים בלימפה שנאספה ולהשתמש בהם לניסויים נוספים, כגון הזרעה חוזרת לבעלי חיים מקבלים כדי להעריך באופן ישיר את תפקודם, חילוף החומרים שלהם, הפינוי או דפוסי ההשכבה שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של הטכניקות לבידוד וקניולציה של צינור הלימפה המסריקאלי, העורק הגרוני והתריסריון.
באמצעות טכניקות אלו, תוכלו להעריך את ההובלה של תרופות, ליפידים וגורמים אחרים מהמעי דרך אל תוך הלימפה המזנטרית ב-Viva.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה לקנולציה של צינור הלימפה המזנטרי בחולדות, במטרה לכמת את הטרנספורט של ליפידים ותרופות דרך המערכת הלימפטית לאחר הAdministration למעי. השיטה מאפשרת להעריך חומרים שונים, כולל תאי מערכת החיסון ומולקולות ליפופיליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- פיזיולוגיה
רקע
- צינור הלימפה המזנטרי ממלא תפקיד מכריע בהובלת ליפידים ותרופות.
- הבנת ההובלה הלימפטית יכולה לספק מידע לשיטות מסירה של תרופות.
- טכניקה זו מאפשרת איסוף ישיר של לימפה לאורך זמן.
- ניתן להתאימה לתנאים ניסויים שונים.
מטרת המחקר
- להערכת שיעורי ההובלה של ליפידים ותרופות אל מערכת הלימפה במעיים.
- להערכת הספיגה של חומרים לאחר הזרקה/מתן למעיים.
- לספק מודל לחקר מנגנוני הובלה לימפטית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קנולציה של צינור הלימפה המזנטרי לאיסוף לימפה.
- קנולציה של התריסריון להזרקה למעי.
- קנולציה של העורק הקרוטידי לאיסוף דגימות דם.
- החדרה של טיפולים ניסיוניים לתריסריון.
תוצאות עיקריות
- בידוד וקנולציה מוצלחים של צינור הלימפה המזנטרי.
- השגת כימות של רמות ליפידים ותרופות סיסטמיות.
- הדגמת ההיתכנות של איסוף לימפה רציף.
- מתן תובנות לגבי מנגנוני הספיגה של ליפידים ותרופות.
מסקנות
- הטכניקה יעילה לחקר הובלה לימפטית.
- היא מאפשרת ניתוח מקיף של ספיגת ליפידים ותרופות.
- ניתן להתאים מודל זה ליישומים מחקריים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל הקניולציה של צינור הלימפה המזנטרי מאפשר כימות ישיר של הובלה לימפטית במעי של תרופות ליפופיליות וליפידים, ובכך נותן מענה לפער קריטי בחיזוי זמינות ביולוגית経 oral עבור תרכובות המשתמשות במסלולי ספיגה של ליפידים. גישה כירורגית זו מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין ספיגה לימפטית לספיגה ורידית פורטלית, מה שמסייע בגיבוש אסטרטגיות פורמולציה ומפחית את שיעור הנשירה בשלבים מאוחרים עקב שונות פריקומיקנטיקה בלתי צפויה. המודל תומך בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים (leads) באמצעות הפקת נתונים כמותיים של הובלה לימפטית המתואמים עם יעילות פרה-קלינית ומסייעים בקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוגע למנגנוני ספיגה לימפטית של מועמדים לתרופות ליפופיליות.
- ערך תפעולי: מספק הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות מדידה ישירה של חלוקת התרופה ללימפה של המעי, ובכך מבהיר את נתיבי הספיגה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות היקף ההסעה הלימפטית, המנבא חשיפה סיסטמית ומסייע בקביעת מינונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך על ידי ביסוס איסוף לימפה הניתן לשחזור לאורך פרקי זמן מוגדרים.
- פלט כמותי: מספקת שיעורי הובלה לימפתית מדידים (למשל, זרימת לימפה של 0.4–1.3 mL/h) ומדדי הובלה מצטברים (למשל, 15.1% מהמינון עבור halofantrine) לצורך השוואת תרכובות.
- תועלת הפלטפורמה: מקלה על מוכנות הסריקה והיכולת להרחבה (scalability) לצורך הערכת הובלה משותפת של ליפידים ותרופות והשפעות של פורמולציות על הספיגה הלימפתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בהערכה של שינויים בהסעה לימפטית במודלים של מחלות (למשל, מחלה דלקתית של המעי, HIV) המשפיעות על ספיגת תרופות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מדידות של הסעה לימפטית בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות למחקרי עירוי חוזר להערכת תפקוד ומנקה של מטבוליטים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריונים של קידום על ידי זיהוי תרכובות בעלות ספיגה לימפטית גבוהה שעשויות לדרוש פורמולציה מיוחדת או ניטור.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית, דרך זיהוי מובילים ועד לעבודה פרה-קלינית, ומספקת נתוני הובלה לימפתית המשלימים את פרופילי הפארמקוקינטיקה הסטנדרטיים של דם הפורטאל.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של נתיבי ספיגה לימפטית ובהפחתת סיכונים ביולוגיים של מנגנוני ספיגה עבור תרכובות ליפופיליות.
- סריקה: מספק מוכנות של הבדיקה (assay) ותוצאי הובלה לימפטית כמותיים המאפשרים הערכה אמינה של תרכובות וניתוח של קשרי מבנה-פעילות (SAR).
- אנליטיקה: מייצר מדידות של קצב זרימה לימפטית והובלת תרופות מצטברת, המאפשרות לצומי להשוות את יעילות הספיגה בין פורמולציות וסדרות כימיות שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות להשתמש ברכיבי לימפה מבודדים במחקרי עירוי חוזר (reinfusion) לצורך תיקוף תפקודי של מטבוליטים המובלים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת כירורגית הניתנת לשימוש חוזר להערכת הובלה לימפטית על פני מספר פרויקטים, ובכך מפחית פיתוח כפול של מודלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון ניבוי במנגנוני ספיגה, מפחית עמימות מכניסטית במתן תרופות דרך הפה, ומאשש מעורבות של מטרה (target engagement) דרך נתיב לימפטי.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור של איסוף לימפה באמצעות פרוטוקולי קנולציה מפורטים וקריטריונים להצלחה (למשל, אישור חזותי של זרימת לימפה).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי זיהוי מוקדם של מגבלות בספיגה לימפטית, ובכך משפר את יעילות ההון ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים המבוסס על ספי העברת לימפה, ובכך תומך בקידום של תרכובות בעלות פרופילי ספיגה נוחים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות מיקרו-כירורגיות, כולל בידוד כלי דם וקנולציה תחת מיקרוסקופ כירורגי.
- תלוי במכשור ייעודי כגון פינצטות עדינות, תפרי מיקרו וקנולות מלאות בחומר נוגד קרישה למניעת תרומבוזה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הפרוצדורות הכירורגיות ותזמון איסוף הלימפה בין צוותים שונים, כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים בין מחקרים.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני חולדות שונים, מצבי צום ומקטעים שונים של המעי, במטרה למקסם את הנראות של הצינורות ואת הצלחת הקנולציה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שיעורי כישלון טכני בקנולציה של הצינורות והצורך באימות פוסט-אופרטיבי של פתוחות זרימת הלימפה.
