Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl
28 בנובמבר 2014
אנו מתארים בדיקה קולורימטרית כמותית פשוטה המודדת באופן ספציפי את הפעילות הפרוטאוליטית של אדם, עכבר או חולדה Granzyme B (GzmB). ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לקביעת פעילות הפרוטאז של פרוטאזות סרין גרגירים אחרות על ידי הידרוליזה של מצעי פפטידים סינתטיים אחרים עם רצף זיהוי מתאים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד את הפעילות הפרוטאוליטית של הפרוטאזה granzyme B. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת ליזאט של התאים הרלוונטיים ולאחר מכן הוספה מהירה של מצע לדגימות. פעילות ה-granzyme B נמדדת לאחר מכן באמצעות תגובה קולורימטרית. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השסוע הספציפי מאוד של alla alla as s benzo על ידי granzyme B בהתבסס על הספציפיות הייחודית של המצע לשאריות aspart acid.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון זיהוי ביטוי של granzyme B באמצעות PCR או Western blot, הוא שהידרוליזה של בנזיל היא ספציפית ל-granzyme B ומעידה גם על כך שהפרוטאזה פעילה. להכנת ליזטים של תאים, בידדו תחילה תאי NK ראשוניים מתליות תאים בודדים של טחולים מעכברי wild type C57BL/6, או מעכברי ביקורת עם מחיקה של הגן granzyme B, באמצעות סלקציה שלילית תוך שימוש בקיטים זמינים מסחרית לפי הוראות היצרן, לאחר שהתאים הופעלו. שטפו את התרבית שלוש פעמים ב-PBS במהירות מקסימלית למשך שתיים עד שלוש שניות, ולאחר מכן השביו את המשקע, המכיל מינימום של 5 מיליון תאי NK, ב-100 µL של Nont P 40 lysis buffer על קרח למשך 20 דקות.
לאחר מכן, סבבו את הליזט במיקרו-צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-15,000 Gs והעבירו את העלייה למבחנה נקייה. לאחר קביעת ריכוז החלבון, בהתאם לפרוטוקול מסחרי מתאים, אחסנו את הדגימה בריכוז מינימלי של כ-2 mg/mL בטמפרטורה של 20°C- לצורך ביצוע בדיקת פעילות של granzyme B. לאחר מכן, דללו מינימום של 100 µg של ליזט חלבון לכל דגימה בבופר HEPES שהוכן טרי לנפח סופי של 160 µL.
לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, טענו 50 µL של דגימה לכל באר בשלוש חזרות לתוך פלטת ויניל בעלת תחתית U עם 96 בארות. תוך הקפדה על הכללת שלוש בארות ביקורת המכילות תמיסת בופר בלבד, הוסיפו 100 µL של DTNB מדולל לכל באר. לאחר מכן, הוסיפו במהירות 50 µL של סובסטרט alala asks s benzoyl שדולל טרי לכל אחת מבארות הבופר בלבד, לאחר מכן לבקרות השליליות, ובסיום לדגימות החיוביות הצפויות.
מדוד את פעילות ה-aase באמצעות הידרוליזה של alala as benzyl בקורא מיקרופלייטים בצפיפות אופטית של 405 nanometers, תוך שימוש בפרוטוקול בדיקה קינטית הכולל 25 קריאות מדי 15 שניות. לבסוף, השתמש בתוכנת קורא הפלייטים כדי לחשב את הקצב המקסימלי של פירוק הסובסטרט עבור כל באר, ולאחר מכן העבר את הנתונים הגולמיים לתוכנה המתאימה לניתוח סטטיסטי תוך שימוש בעכברים עם knockout של גן ה-granzyme. נמצא כי הסובסטרט הפפטיד הסינתטי alala as benzyl עובר הידרוליזה ספציפית על ידי granzyme B. ניתן למדוד פירוק יעיל נוסף של הסובסטרט הסינתטי בליזאטים של תאים מתאי NK ראשוניים מסוג wildtype, אך לא בתאי NK מבעלי knockout של granzyme B המשמשים כביקורת.
בניסוי זה, הפעילות הפרוטאוליטית של granzyme A, בעל ספציפיות למסלול דמוית טריפסין והנמצא בליזאטים של שני סוגי התאים, הייתה שווה כפי שנמדד על ידי הידרוליזה של BLT benzyl, כאשר I-E-P-D-P-N-A שימש באופן כללי לבדיקת פעילות של granzyme B בין מינים שונים. בניתוח זה של ניסוי מייצג, נמצא כי רצפי הטטרה-פפטיד גילו ש-granzyme B אנושי, אך לא של עכבר, מסוגל לבצע ביקוע יעיל לאחר הרצף IEPD, התואם את רצף הזיהוי הן ב-bid אנושי והן ב-bid של עכבר. לעומת זאת, הפחתת כמות ליזאט של תאי NK leukemia אנושיים מ-30 micrograms ל-10 micrograms עדיין מביאה לכמות מספקת של granzyme B כדי לבצע הידרוליזה של מצע I-E-P-D-P-N-A.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בחירת התשתית המתאימה ובקרות הניסוי עבור ניתוח in vitro של אנזים B אדום מאדם ומעכבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקה קולורימטרית כמותית למדידת הפעילות הפרוטאוליטית של Granzyme B (GzmB) בדגימות מאדם, עכבר או חולדה. ניתן להתאים את השיטה לפרוטאוזות סרין גרנולריות אחרות באמצעות שימוש בסובסטראטים של פפטידים סינתטיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פעילות פרוטאז
- ביולוגיה של התא
רקע
- Granzyme B היא פרוטאז סרין המעורב בתגובות חיסוניות.
- מדידת הפעילות שלה היא קריטית להבנת תפקידה בציטוטוקסיות ממחייית.
- שיטות קיימות, כגון PCR או Western blot, אינן מודדות באופן ישיר את פעילות הפרוטאז.
- בדיקה זו מספקת מדידה ספציפית וישירה של פעילות GzmB.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיסה פשוטה לכימות פעילות GzmB.
- אספקת שיטה שניתן להתאימה לפרוטאזות אחרות.
- שיפור טכניקות קיימות על ידי מתן ספציפיות לפעילות GzmB.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ליזאטים של תאים מתאי NK ראשוניים.
- שימוש בתגובה קולורימטרית למדידת פעילות GzmB.
- בידוד תאי NK מטחולים של עכברים מסוג בר (wild type) ועכברים חסרי הגן לגרנזים B (granzyme B gene null).
- הידרוליזה של סובסטרט להערכת פעילות פרוטאז.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מודדת בהצלחה את פעילות GzmB באמצעות פיסול סובסטרט ספציפי.
- היא מדגימה סגוליות גבוהה ל-GzmB בהשוואה לשיטות אחרות.
- התוצאות מעידות כי הפרוטאזה פעילה על בסיס הידרוליזה של הסובסטרט.
- השיטה ניתנת להתאמה עבור פרוטאזות סרין גרנולריות אחרות.
מסקנות
- הבדיקה שפותחה היא כלי מהימן למדידת פעילות GzmB.
- היא מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות על ידי הערכה ישירה של תפקוד הפרוטאז.
- גישה זו יכולה לקדם את המחקר על תגובות חיסוניות וביולוגיה של פרוטאזים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
מדידה מדויקת של הפעילות הפרוטאוטיקה של Granzyme B חיונית לתיקוף תפקודם של לימפוציטים ציטוטוקסיים בפיתוח אימונותרפיה. בדיקה קולורימטרית זו מספקת קריאה ישירה וספציפית של פעילות הפרוטאז, המאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית לגבי מעורבות המטרה ופוטנציאל פרו-אפופטוטי במודלים פרה-קליניים. התאימות שלה בין מינים שונים תומכת ברצף תרגומי ממחקרי מכרסמים ליישומים בבני אדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של נתיבי אפופטוזיס תלויים ב-Granzyme B בלימפוציטים ציטוטוקסיים.
- ערך תפעולי: מבדיל בין פרוטאז פעיל לבין ביטוי בלבד, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות באישור של מטרות.
- ערך ניבוי: תומך באישור פונקציונלי של Granzyme B כגורם מכניסטי בפינוי גידולים ממערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: שימוש בסובסטרט Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl המהלל באופן בלעדי על ידי Granzyme B במערכות של בני אדם, עכברים וחולדות.
- פלט כמותי: מדידת קצבי הידרוליזה ראשוניים באמצעות תגובה קולורימטרית המצומדת ל-DTNB באורך גל של 405 nm לצורך אנליזה קינטית.
- בקרת ספציפיות: מניעת הפרעה מצד caspase וגראנזימים אחרים הודות להעדפה ייחודית לאספרטט.
- שחזוריות: תואם לליזטים לא מופרדים ולפרוטאזות רקומביננטיות כאשר נכללים בקריים מתאימים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למודלים של פיקוח חיסוני על גידולים, זיהום נגיפי ופתולוגיה אוטואימונית שבה Granzyme B מתווך את מות תא המטרה.
- המשכיות תרגומית: מאפשר מדידה עקבית של הפעילות בין מינים שונים, ובכך תומך בהסקה של נתונים מעכברים לבני אדם.
- החלטות מותאמות לסיכון: מספק ביומרקר מבוסס פעילות לצורך תיעדוף מועמדים עם פוטנציאל ציטוטוקסי מאושר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), כאשר פעילות פרוטאז תפקודית מספקת מידע על יעילות ביולוגית ועל מנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאשר את ההשערה ש-Granzyme B מניע אפופטוזה בלימפוציטים אפקטורים באמצעות פיסול ספציפי לסובסטרט.
- סריקה: מספקת קריאות פעילות כמותיות וסטנדרטיות להשוואת תנאים או הפרעות גנטיות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים קינטיים (Vmax) המאפשרים השוואה בין דגימות והערכה סטטיסטית של היכולת הפרוטאוליטית.
- מחקר תרגומי: תומכת בתיקוף פרה-קליני על ידי אימות פעילות שמורה ב-Granzyme B של בני אדם, עכברים וחולדות.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמה הניתנת להתאמה לפרוטאזות גרנולריות אחרות באמצעות החלפת סובסטרט, מה שמגביר את התועלת לטווח ארוך.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מדידה ישירה של התפקוד הפרוטאוליטי מפחיתה את ההסתמכות על סממנים חלופיים כגון רמות mRNA או רמות חלבון.
- ערך תפעולי: פורמט פשוט מבוסס פלטה עם זמן עבודה מינימלי ותאימות לקורא מיקרו-פלטות סטנדרטי.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מסוג go/no-go על בסיס פעילות תפקודית ולא על בסיס ביטוי בלבד, ובכך משפר את רמת הביטחון החזויה.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על קידום של אימונותרפיות בהתאמה לרמת הסיכון, על ידי אישור הפוטנציאליות המכניסטית בשלב מוקדם של הפיתוח.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאי מערכת חיסון ראשוניים ובליזיס בתנאים מבוקרים כדי לשמר את פעילות הפרוטאז.
- תלוי בגישה לקורא מיקרו-פלייטים המסוגל לבצע מדידות קינטיות של OD405 ותוכנת ניתוח תואמת.
- מחייב הכללת בקרות של Granzyme B knockout כדי לאשר את ספציפיות הבדיקה, כפי שהודגם במקור.
- התאמה לפרוטאזים אחרים מחייבת תיקוף של סובסטראטים חלופיים כדי לשמור על ספציפיות וחלון אות שקולים.
- מגבלה מעשית: הבדיקה מודדת את הפעילות הכוללת של הליזיס ועשויה להצריך הפרדה לשיוך לוקליזציה תת-תאית.
