קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע במהירות את הדרישות הגנטיות לפירוק חלבון לא יציב ב-Croce Visier. זה מושג על ידי מיזוג אנזים מדווח הנדרש לצמיחה בתנאים סלקטיביים ספציפיים לחלבון לא יציב מעניין. תאים מסוג בר או מוטנטיים הבאים המבטאים שניהם את חלבון ההיתוך מתורבתים על צלחות אגר בינוניות סלקטיביות.

בדיקת הציפוי מספקת אינדיקטור נוח לייצוב חלבון על בסיס צמיחת תאי שמרים על מנת לאשר ביוכימית הבדלים בשפע החלבון בעוד שסוג בתאים מוטנטיים המכילים את חלבון ההיתוך עוברים ליזה באמצעות שיטת מיצוי חלבון מהירה ולא יעילה לניתוח כתמים מערביים. התוצאות מראות כי השפע של חלבון לא יציב גדל בתאים עם מוטציה בגן הנדרש לפירוק. ההיפך הוא הנכון לגבי השפלה של זנים מסוג פרא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ניתוחי מרדף דופק ומרדף מחזורי הוא שהיא פחות אינטנסיבית וגוזלת זמן, מה שמאפשר קביעת תפוקה מהירה וגבוהה של הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דרישות הפירוק של מגוון חלבונים לא יציבים. זה יכול לשמש גם לזיהוי רגולטורים של היבטים אחרים של ביטויי גנים כגון שעתוק ותרגום.

מי שידגים את הנהלים יהיו שלדון ווטס וג'סטין קראודר. סטודנטים במעבדה שלי לפני הבדיקה הופכים פלסמיד המקודד חלבון היתוך המורכב מחלבון לא יציב ואנזים מדווח מטבולי לזן שמרים מוטנטי. חשד שיש לו פגמים גנטיים הנוגעים לוויסות פירוק החלבון כבקרה, הופך גם את אותו פלסמיד לזן שמרים מסוג בר.

חסנו את הטרנספורמנטים בחמישה מיליליטר של מדיום מינימלי הבוחר תאים, המאכלס את מולקולות הפלסמיד. הנח את המבחנה למסובב נוטה ודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למחרת. מדוד את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה, ולאחר מכן השווה את ריכוז התאים עבור כל התאים על ידי דילול כל תרבית ל-OD 600 של 0.2 עם מדיה טרייה וצינורות צנטריפוגה בודדים סטריליים של 1.5 מיליליטר.

כדי להתחיל את הבדיקה העיקרית, הגדר מטריצת סדרת דילול פי שישה על ידי העברה ראשונה של 200 מיקרוליטר מכל זן מדולל מראש, החל מ-OD 600 של 0.2 לבארות ייעודיות בעמודה הראשונה של צלחת באר סטרילית 96 כהכנה לדילולים הבאים, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 125 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות הריקות בעמודות שתיים, שלוש, וארבע. לאחר מכן, העבירו 25 מיקרוליטר שמרים מעמודה אחת לעמודה שתיים, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב את התאים באופן שווה והמשיכו להעביר 25 מיקרוליטר תאים מעמודה שתיים לעמודה שלוש. חזור על שלבי הדילול הסדרתי עד שהבארות בעמודה ארבע מעורבבות היטב כעזר חזותי לאיתור תאים.

הדפיסו תבנית רשת והדביקו אותה בחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי, החל מהעמודה הכי פחות מרוכזת במטריצת הדילול הסדרתי. העבירו ארבעה מיקרוליטר תאים מכל עמודה. על צלחת 96 הבאר על צלחת אגר בינונית מינימלית בקרה הבוחרת לתחזוקת פלסמיד תוך תאית, אתר עוד ארבעה מיקרוליטר של תאים מכל עמודה על צלחת אגר בינונית נפרדת ומינימלית שבוחרת עבור שני הפלסמיד התוך-תאי.

תחזוקה וביטוי של חלבון ההיתוך הלא יציב. הניחו לשתי הצלחות להתייבש על הספסל למשך חמש עד 10 דקות. אטמו את המכסים בפרם כדי למנוע התייבשות ודגרו את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שישה ימים.

כאשר מושבות מהתרבות הצומחת ביותר נראות לראשונה בנקודה המדוללת ביותר בצלחת נתונה, הסר את הצלחת מהחממה ותעד את היקף הצמיחה. על ידי צילום, ייתכן שיהיה צורך לצלם תמונות של צלחות שונות בימים שונים או של אותה צלחת במספר ימים. במקרה של זני שמרים שונים המציגים מגוון רחב של שיעורי גדילה, כך שאושר ביוכימית כי גן שזוהה במבחן הגידול מווסת את שפע החלבון מתחיל בהפיכת זני שמרים מסוג בר ומוטנטי עם פלסמיד המקודד את חלבון ההיתוך הנ"ל, לחסן את הטרנספורמנטים בחמישה מיליליטר של מדיום מינימלי הבוחר לתחזוקת פלסמיד תוך תאי ולדגור את הצינורות למשך הלילה במסובב נוטה של 30 מעלות צלזיוס.

למחרת, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 מכל תרבית לילה. לאחר שכל הזנים הגיעו ל-OD 600 של 0.4 ומעלה, יש לדלל את כל התרביות בחזרה ל-0.2 במדיום טרי כך שהנפח הסופי של כל זן הוא 10 מיליליטר. דגרו את התאים על שייקר פלטפורמה של 30 מעלות צלזיוס עד שכל התרביות מגיעות לגידול שלב בינוני OD 600, בין 0.8 ל-1.2.

קצור תאים על ידי העברת 2.5 יחידות OD בסך הכל של תאים לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והסר את ה-S supernatant. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מערבולת מים מזוקקים או פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את החך ולהעביר את תרחיף התא לצינור טרי של 1.5 מיליליטר.

בודד את התאים עם הצנטריפוגה השנייה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, הסר את החטיפה והשהה מחדש את התאים ב -100 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.2 נתרן הידרוקסיד מולארי לתרחיף התאים, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב ולדגור את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע ליזה תאית מוקדמת. אין לערבב את התאים.

בודד את התאים שוב עם צנטריפוגה שלישית למשך 30 שניות. בטמפרטורת החדר, הסר את הסופרנטנטים מהתאים ושחרר את התאים על ידי החייאת הגלולה ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה אחד x למבי מנטרל את כל החלבונים על ידי דגירה של התרחיף ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן מקרר את כל התא ליזאט על קרח למשך חמש דקות. לבחינת שפע החלבונים המועדים לצבירה כגון חלבונים עם מספר מקטעים טרנסממברניים קובעים באופן אמפירי את הדגירה, הטמפרטורה והזמן האופטימליים של דנטורציה על ידי התחלה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במקום 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לבסוף, בודד את השבר המסיס על ידי צנטריפוגה של הליזאט למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, העביר את החטף לצינור טרי והשליך את שבר הגלולה הבלתי מסיס. כעת ניתן לטעון את החלק המסיס ישירות על דף SDS, ג'ל או לאחסן בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס בהגדרת בדיקת פירוק חלבון מבוססת גידול שמרים. חלבון היתוך משולש לא יציב מתמזג עם אנזים מטבולי נוסף המחמיא לרקע זן שמרים חסר אותו גן מטבולי.

כאשר חלבון ההיתוך מתבטא בשמרים, הוא נוטה לאירועי טרנסלוקציה עקרים בקרום הרטיקולום האנדופלזמי. טרנסלוקציה חריגה זו גורמת לפירוק בתיווך יוביקוויטין של החלבון כולו, כולל האנזים המטבולי, ובכך מונעת התפשטות תאים. עם זאת, בזני שמרים חסרי יוביקוויטין ליגאז, חלבון ההיתוך מוגן מפני פירוק, אפילו בטרנסלוקציה ממוצעת המאפשרת לתאים להתרבות.

לכן, בנוכחות יוביקוויטין ליגאז, קיימת התאמה בין פירוק חלבונים המתרחש בתוך התאים לבין כישלון של תאי שמרים להתרבות על לוחות אגר מדוללי מטבוליטים. מצד שני, בהקשר של תאי יוביקוויטין ליגאז פגומים או נעדרים, התפשטות תאי יוביקוויטין ליגאז מצביעה על כך שחלבון ההיתוך היה מוגן מפני פירוק כדי להפחית את הרקע או צמיחה מזויפת ולהגביר את המחמירות של בדיקה זו. ניתן להוסיף מעכבים תחרותיים של האנזים המטבולי למצע הגידול כדי לאשר את התוצאות שנצפו במבחן גידול השמרים.

ניתן לברר עדות ישירה לפירוק חלבון היתוך גם עם כתם מערבי. בנוכחות או היעדר יוביקוויטין ליגאז, חלבון ההיתוך יתפרק או יינצל מהרס בהתאמה. חשוב לזכור כי נהלים אלה מדווחים באופן הישיר ביותר על שפע המצב היציב של החלבון המעניין.

לאחר ביצוע הליכים אלה, ניתן לבצע ניתוחי דופק או ציקלוהקסימיד על מנת לנתח ישירות את קינטיקה של פירוק חלבון ונוכחות מוטציות שנמצאו כמגבירות את רמות החלבון במצב המחקר.