Name: קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: למדו לזהות דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מבחן צמיחה ואישור ביוכימי. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר של יציבות חלבונים בשרשרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי הווה ובעבר של המעבדה רובינשטיין למתן סביבת מחקר תומכת ונלהבת. אנו מודים ריאן ט גיבסון לסיוע בפרוטוקול אופטימיזציה. אנו מודים למארק Hochstrasser (אוניברסיטת ייל) ודיטר וולף (Universität שטוטגרט) לזני שמרים ופלסמידים. אנו מודים למבקרים האנונימיים שלנו לעזרתם בשיפור הבהירות והשירות של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי הפרס מחקר מהפרק סטייט הכדור של Sigma Xi לSGW, המכונים לאומי לבריאות מענק (R15 GM111713) לEMR, הפרס מחקר כדור מדינה לשאוף לאוניברסיטת EMR, וקרנות מאוניברסיטת מדינת הכדור משרד המכללה והמחלקה לביולוגיה.

1. Assay צמיחת שמרים לזיהוי מוטציות מועמד פגומים בפירוק חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך wild-type ותאי שמרים שעברו מוטציה עם קידוד פלסמיד חלבון יציב התמזגו, במסגרת, לאנזים מטבולי כתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מיליליטר של סינטטי מוגדר בינוני מינימאלי (SD) שהוא סלקטיבי לתאי חסת מולקולות פלסמיד. דגירה הלילה בשעה 30 ° C, מסתובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כל תרבות לילה. הערה: לאחר דגירה הלילה, תאים בתרבית יכולה להיות בכל שלב צמיחת לוגריתמים או נייח אבל צריך להגיע OD מינימאלי 600 של 0.2. שמרי זנים גדלים לאט מאוד עשויים לדרוש פעמים דגירה יותר מלילה אחד, או חיסון של מספר גדול יותר של תאים, כפי שנקבעו באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי שישה דילולים סדרתי של תאי שמרים הפכו בצלחת 96-היטב סטרילי, החל בתאים מדוללים לn OD 600 של 0.2. מניחים כל transformant שמרים להיות מאושרים בשורה שונה בצלחת 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל transformant, לחשב את הנפח של תרבות הלילה נדרשת לדלל תאים לOD 600 של 0.2 בנפח סופי של 200 μl. הוספת נפח זה של תרבות הלילה למתאים היטב בטור 1. הוסף את הכמות המתאימה של מים סטריליים כדי להביא את הנפח 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל שורה של שמרים, להוסיף 125 μl של מים סטריליים לבארות בעמודות 2, 3, ו -4. הערה: 96-גם צלחות סטרילי עטופות בנפרד עשויות להיות ארוזות עם מכסי סטרילי. המכסים עשויים לשמש כמאגרים למים סטריליים שמופץ בשלב זה. זה מאפשר העברה סימולטנית של מים סטריליים לכל הבארות בעמודת נתונה עם pipettor רב-ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התוכן של העמודה הראשונה (השמרים מדוללים לOD 600 של 0.2) על ידי pipetting מעלה ומטה עם pipettor רב-ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfאה 25 μl של שמרים מהטור 1 לעמודה 2, באמצעות pipettor רב-ערוצי. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. העברה 25 μl מטור 2 לטור 3, ו -25 μl מהעמודה 3 לעמודה 4 (ערבב היטב בכל שלב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כל דגימה עם pipettor רב-ערוצי. ימשיך מרוב לדלל לדלל לפחות עמודות של שמרים, פיפטה 4 μl של כל דגימה על שתי צלחות המכילות מצע סלקטיבי המתאים. השתמש בצלחת אחת עם מדיום ששומרת על בחירת פלסמיד (צלחת זה משמשת כתצפית שמרים ושליטה צמיחה). השתמש בצלחת שנייה עם מדיום שבוחר עבור תחזוקת פלסמיד וביטוי של החלבון יציב התמזג אנזים הכתב. משום שמרים להתיישב במהירות, לערבב תאים על ידי pipetting מעלה ומטה במרווחי זמן קבועים. הערה: צלחות Drier יותר בקלות תספוג נוזלים מאשר צלחות מוכנות טרי ולכן מומלצים לניסויים אלה. צלחות לחות עשויות להיות מיובשות על ידי דגירה בטמפרטורת חדר בloלחות w עבור 1-2 ימים או incubations קצר יותר בזרימה למינרית. צלחות עלולות להתייבש בצורה לא אחידה, אם את זרימת האוויר למינרית היא מקבילה לספסל. שימוש בתבנית עושה את זה קל יותר לזהות תאי שמרים במרחקים קבועים. שתי תבניות מדגם מסופקות באיור 1. אלה עשויים להיות מודפסים, לגזור, ומודבקים לחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחות לייבוש על גבי הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על C ° 30 ל2-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם כל צלחת לאחר דגירה. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> איור 1. תבניות לאיתור תאי שמרים על צלחות אגר 100 מ&quot;מ. תבניות אלו עשויות לשמש כדי להקל על איתור שמרים במרחקים קבועים עם pipettor רב-ערוצי. תבניות ניתן להדפיס, לגזור, ומודבקים לחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי. מניחים צלחת פטרי עם צמיחהמכסה בתוך בינוני עם תבנית מודבקת. תבניות מסומנות בחריץ כדי לעקוב אחר כיוון. מומלץ צלחות המשמשות במבחני צמיחה תסומן באופן דומה עם חריץ כדי לעקוב אחר כיוון. תבניות לאיתור ארבעה (א) או חמישה (B) דילולים סדרתי של תאי שמרים מסופקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה להדפסה של נתון זה עם תבניות 100 מ&quot;מ.</a> 2. אישור ביוכימית של Assay צמיחת שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחה של תאי שמרים והפקת חלבון Post-אלקליין (שונה מ -31) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך wild-type ותאי שמרים שעברו מוטציה עם פלסמיד המקודד את החלבון יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן transformants ב 5 מיליליטר של מדיום SD שהוא סלקטיבי לתאי חסת מולקולות פלסמיד. דגירה הלילה בשעה 30 ° C, מסתובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של כל מ&quot;ק לילהlture. הערה: לאחר דגירה הלילה, תאים יכולים להיות בכל שלב צמיחת לוגריתמים או נייח אבל צריך להגיע OD 600 שיאפשר דילול לOD 600 של 0.2 ב 10 מיליליטר בינוני טרי סלקטיבית (צעד 2.1.4). שמרי זנים גדלים לאט מאוד עשויים לדרוש פעמים דגירה יותר מלילה אחד, או חיסון של מספר גדול יותר של תאים, כפי שנקבעו באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאי שמרים לOD 600 של 0.2 ב 10 מיליליטר בינוני סלקטיבית טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לדגור תאים על 30 מעלות צלזיוס, מסתובב או רועד, עד תרבויות להגיע OD 600 בין 0.8 ו -1.2 (כלומר נמצאות בצמיחת אמצע לוגריתמים). הערה: אם החלבון לא יציב של עניין הוא תחת שליטתו של אמרגן ויסות, התזמון האופטימלי של אינדוקציה של ביטוי חלבון וקציר תא עשוי להשתנות בהתאם למחקרים קודמים או תצפיות אמפיריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 2.5 OD 600 יחידות של התרבות ב 15 מ&quot;ל חרוטיאל צינור על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. הערה: OD אחת 600 יחידה מוגדרת כסכום של שמרים הנוכחיים ב 1 מיליליטר של התרבות בOD 600 של 1.0. הנפח של התרבות (במ&quot;ל) נדרש למסוק 2.5 OD 600 יחידות (V) ניתן לקבוע באמצעות המשוואה הבאה: V = 2.5 OD 600 יחידות OD נמדד / 600 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 1 מיליליטר מים מזוקקים. העבר את התאים מושעים לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב6,500 XG במשך 30 שניות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 100 μl מים מזוקקים על ידי pipetting מעלה ומטה או vortexing, ולהוסיף 100 μl 0.2 M NaOH. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. דגירה דגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה (שרובם עדיין לא שוחררו חלבונים ועדיין קיימא) על ידי צנטריפוגה ב18,000 xגרם במשך 5 דקות. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה גלולה ב50-100 μl חיץ מדגם Laemmli 1x, אשר lyse תאים, על ידי pipetting מעלה ומטה או vortexing. הערה: הסרת supernatant אלקליין הבא צנטריפוגה וresuspension הבא של תאים במאגר מדגם Laemmli תמציות חלבונים בpH תואם עם ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide (SDS-PAGE) dodecyl נתרן באמצעות מערכת חיץ ריצת טריס-גליצין ומערבי סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל באופן מלא חלבונים, דגירה lysates על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הערה: חלבוני צבירה מועדים (למשל חלבונים עם כמה קטעים הטרנסממברני) עשויים להיות בלתי ניתנים לפתרון, כאשר טופחו על 95 מעלות צלזיוס. לכן, צריך להיות מודגרות lysates בטמפרטורות נמוכות יותר (למשל 37 ° C - 70 ° C) במשך 10 - 30 דקות, כאמפירי שנקבע, לניתוח של חלבונים מסוג זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates מגניב על ידי הנחת על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates צנטריפוגות ב 18,000 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה חומר מסיס. הפרד את supernatant (solubilized חלבון חילוץ) על ידי SDS-PAGE לפני ניתוח שלאחר מכן מערבי כתם (סעיף 2.2). לחלופין, lysates החנות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול מערבי סופג נציג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון נפח אמפירי נחוש של lysates בג&#39;ל SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג&#39;ל ב 200 V עד לפני לצבוע הגיע לתחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מן ג&#39;ל לפלואוריד polyvinylidene קרום (PVDF) על ידי העברה רטובה ב 20 V ל60-90 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק על ידי דוגרים ב 5% חלב דל שומן בטריס שנאגרו מלוח (TBS), נדנדה, עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין (או תג epitope ממנו) ב 1% חלב דל שומן בTBS עם 0.1% Tween-20 (TBS / T) לשעה 1 בחדר temperature, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות מתאימים ב 1% חלב דל שומן בכפות / T עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, נדנדה. הערה: מאחר fluorophores הן רגישה לאור, דילולים של נוגדני fluorophore מצומדות צריכים להיות מוכנים בחושך. בנוסף, דגירה של ממברנות בנוכחות נוגדני fluorophore מצומדות צריכה להתרחש במיכלים lightproof. זה יכול להיות מושלם על ידי עטיפת מגשי דגירה ברדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של קרום באמצעות Li-Cor אודיסיאה CLX ותוכנת Studio התמונה (או ציוד הדמיה דומה ותוכנה), על פי המלצות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה קרום, דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לעומסing חלבון שליטה ב 1% חלב דל שומן בכפות / T עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות מתאימים ב 1% חלב דל שומן בכפות / T עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג פתרון נוגדן, ולשטוף קרום דק &#39;3 x 5 עם TBS / T בטמפרטורת חדר, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה של קרום באמצעות Li-Cor אודיסיאה CLX ותוכנת Studio התמונה (או ציוד הדמיה דומה ותוכנה), על פי המלצות יצרן. </li></ol></li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת קביעה המהירה ואישור ביוכימיים של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים בתאי שמרים. ניסויים אלה מדגישים את השירות ואת כוחו של שמרי כאורגניזם מודל אוקריוטים (כמה ביקורות מצוינות של שמרי ביולוגיה וליקוטים של פרוטוקולים לטיפול, אחסון, ומניפולצית תאי שמרים (למשל 41-44) זמינים לחוקרים חדשים לאורגניזם). בקלות ניתן ליישם הטכניקות לחקור את ההשפלה ושפע של מגוון רחב של סוגי חלבונים. לדוגמא, אחרים מועסקים באסטרטגיה זו כדי לאפיין את מנגנוני השפלה של cyt...

פירוק חלבוני סלקטיבי הוא חיוני לחיים אוקריוטים, ופירוק חלבונים שינה תורם למספר מצבים רפואיים, כוללים מספר סוגים של הסרטן, מחלה ניוונית של מערכת עצבים, מחלות לב, וסיסטיק פיברוזיס 1-5. מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS), המזרז פירוק חלבונים סלקטיבית, היא יעד טיפולי המתעוררים לתנאים אלה 6-10. ligases יוביקוויטין קוולנטית לצרף פולימרים של היוביקוויטין חומצת אמינו 76-לחלבוני 11. חלבונים שסומנו עם רשתות polyubiquitin מוכרים וproteolyzed על ידי ~ 2.5 megadalton 26s פרוטאזום 12. מחקרים שיזמו באורגניזם אוקריוטים מודל Saccharomyces cerevisiae (שמרי ניצנים) היו מכוננים בהבהרת מנגנוני פירוק חלבונים בתאים אוקריוטים. המצע הפיזיולוגי הפגין הראשון של UPS היה מדכא תעתיק שמרי 13 MATα2, 14 ורכיבים שמורים ביותר, רבים של UPS זוהו לראשונה או מתאפיינים בשמרים (למשל 15-26). התגליות שנעשו באורגניזם מודל רב-תכליתי וצייתן גנטי זה, צפויות להמשיך ולספק תובנות חשובות מנגנוני שימור של השפלה בתיווך היוביקוויטין. הכרה והשפלה של רוב מצעי UPS דורשים פעולה מתואמת של חלבונים מרובים. לכן, מטרה חשובה באפיון השפלה המוסדרת של חלבון יציב נתון היא לקבוע את הדרישות הגנטיות לproteolysis. גישות קלאסיות (למשל דופק מרדף וניסויים cycloheximide-מרדף 27) לניטור פירוק חלבונים בתאי יונקים או שמרים הן מייגע וגוזל זמן. בעוד אלו סוגים של המתודולוגיה לספק אמצעי רגיש מאוד לאיתור פירוק חלבונים, שהם אינם מתאימים לניתוח מהיר של פירוק חלבונים או screeni בקנה מידה גדולהng למוטציות המונעות פירוק חלבונים. כאן, assay המבוסס על צמיחת שמרים לזיהוי המהיר של דרישות גנטיות לפירוק של חלבונים לא יציבים מוצג. בשיטה המבוססת על צמיחת שמרים לניתוח פירוק חלבונים, חלבון יציב של עניין (או אות השפלה) מותך, במסגרת, לחלבון שנדרש לשמרי צמיחה בנסיבות מסוימות. התוצאה היא מצע מלאכותי שעשויות לשמש ככלי רב עוצמה כדי לקבוע את הדרישות הגנטיות של פירוק חלבונים של החלבון יציב של עניין. נוח, זני שמרי מעבדה הנפוצים ביותר בנמל פנל של מוטציות בגני מקודדי אנזימים מעורבים בחילוף חומרי הסינתזה של חומצות אמינו מסוימות או בסיסים חנקניים (למשל 20,28-30). אנזימים אלה חיוניים לשגשוג תאי בהעדר מטבוליטים סיפקו אקסוגני בסינתזה שהאנזימים להשתתף. כזהאנזימים מטבוליים עשויים כך לתפקד ככתבים המבוסס על צמיחה לפירוק של חלבונים לא יציבים שאליו הם התמזגו. הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים אפשר לבאר בקלות, שכן מוטציות המונעות proteolysis תאפשר תאי מחסה כתב השפלה לגדול בתנאים סלקטיבית. יתרון צמיחה הוא אינדיקציה עקיפה שמוטציה מסוימת מגדילה את השפע של החלבון של עניין. עם זאת, נדרשת אנליזה ביוכימית ישירה כדי לאשר שמוטציה מאפשרת צמיחה דרך רמות חלבון מוגברות ולא באמצעות גורמים עקיפים או artifactual. ההשפעה של מוטציה בחלבון שפע עשויה להיות מאושרת על ידי ניתוח כתם המערבי של רמות חלבון במצב יציב בתאים שעושים ולא נמל מוטציה מסוימת. שיטה למיצוי המהיר ויעיל של חלבוני שמרים (דגירה רציפה של תאי שמרים עם נתרן הידרוקסידי וחיץ מדגם) בצורה מתאימהלניתוח על ידי מערבי סופג מוצג גם 31. יחד, ניסויים אלה להקל על זיהוי המהיר של רגולטורי מועמד של פירוק חלבונים.

<table><tbody><tr><td>זני שמרים רצויים, פלסמידים, מדיום סטנדרטי ורכיבי</td><td></td><td></td> חיץ <td>זני שמרים עם מוטציות רצויות עשויים להיווצר במעבדת החוקר. שמרים מסוג בר ומגוון מוטציות זמינים גם הם מסחרית (למשל מ-GE Healthcare). פלסמידים המקודדים חלבוני היתוך עשויים להיווצר במעבדת החוקר.</td></tr><tr><td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>מעכב תחרותי של אנזים His3. עשוי להיכלל במדיום כדי להגביר את המחמירות של מבחן הצמיחה באמצעות מבני מדווח His3.</td></tr><tr><td>אנדוגליקוזידאז H (צורה רקומביננטית מ-Streptomyces plicatus)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>עשוי לשמש להערכת N-גליקוזילציה של חלבונים; תואם לריכוזי SDS ובטא-מרקפטואתנול המצויים במאגר דגימת Laemmli 1x.</td></tr><tr><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-961-32</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>חממה מווסתת טמפרטורה (למשל חממת Heratherm דגם IMH180)</td> <td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק תוף להחלפה לצינורות 18 מ"מ (רולר צינור)</td> <td>ניו ברונסוויק</td><td>M1053-0450</td><td>רולר צינור מומלץ לשמירה על תרביות שמרים למשך הלילה של תאי שמרים בתרחיף. ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה או רולר צינור כדי לשמור על תרביות גדולות יותר בהשעיה.</td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק TC-7 רולר תוף 120V 50/60 H</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>M1053-4004</td><td>לשימוש עם רולר</td></tr><tr><td>צינור SmartSpec Plus ספקטרופוטומטר</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>סטרילי 96 בארות שטוח תחתון מיקרו-בדיקה צלחות עם מכסה עטוף בנפרד</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & מו; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>זמין ממגוון יצרנים &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>פיפטורים חד-ערוציים ורב-ערוציים משמשים בשלבים שונים של הפרוטוקול. בעוד שפיפטורים רב-ערוציים מפחיתים את עומס הפיפטינג במספר שלבים, ניתן להשתמש בפיפטורים חד-ערוציים לאורך כל הפרוטוקול. ניתן להשיג ממגוון יצרנים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>רוטור הנמכר עם יחידה מכיל צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 ו -2.0 מ"ל. ניתן להחליף את הרוטור באחד המכיל צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ו-50 מ"ל.</td></tr><tr><td>מערכת הדמיית צלחות (למשל מערכת Gel Doc XR+)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td> ניתן <td>להשתמש במגוון מערכות להדמיית לוחות, כולל מערכות הדמיה מתוחכמות, סורקי מחשב וטלפונים עם מצלמה.</td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה F-35-6-30 עם מכסה ומתאמים לצנטריפוגה דגם 5430/R, צינורות חרוטיים 15/50 מ"ל, 6 מקומות</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל מסך מודפס צינור מכסה בורג 17 x 20 מ"מ חרוטי, פוליפרופילן</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל flex-tube, PCR clean, צינורות מיקרוצנטריפוגה טבעיים</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>מחמם אמבטיה אנלוגי</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>אמבט מים רותחים עם פלטה חמה עשוי לשמש גם לניקוי חלבונים</td></tr> מכשירי <tr><td>הפעלה והעברה של SDS-PAGE, ספקי כוח וציוד הדמיה או חדרי חושך עבור SDS-PAGE והעברה לממברנה</td><td></td><td></td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה של Western Blot (e. סורק Li-Cor Odyssey CLx ותוכנת Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים (למשל פוספוגליצרט קינאז (Pgk1) נוגדן חד-שבטי, עכבר (שיבוט 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים (למשל Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life</td> <td>Technologies</td><td>A-21065</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr></tbody></table>

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

פירוק חלבונים מוסדר הוא חיוני עבור כמעט כל פונקציה סלולרית. הרבה ממה שידוע על המנגנונים המולקולריים וגנטיות לדרישות פירוק חלבונים האיקריוטים בתחילה הוקם בSaccharomyces cerevisiae. ניתוחים קלאסיים של פירוק חלבונים יש לסמוך על מתודולוגיות דופק מרדף וcycloheximide-מרדף ביוכימיים. בעוד טכניקות אלה מספקים אמצעים רגישים להתבוננות פירוק חלבונים, שהם, זמן רב מייגע, ונמוכה-תפוקה. גישות אלה אינן ניתנות לסינון מהיר או בקנה מידה גדולה למוטציות המונעות פירוק חלבונים. כאן, assay המבוסס על צמיחת שמרים לזיהוי הקליל של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים מתואר. ב assay זה, אנזים כתב הנדרש לצמיחה בתנאים סלקטיבית מסוימים התמזג חלבון יציב. תאים חסרי אנזים כתב אנדוגני אך המבטא את חלבון ההיתוך יכול לגדול תחת Sele גודלתנאי ctive רק כאשר חלבון ההיתוך הוא התייצב (כלומר, כאשר פירוק חלבונים נפגעת). בassay הצמיחה המתואר כאן, דילולים סידוריים של wild-type ותאי שמרי מוטציה מחסה פלסמיד קידוד חלבון היתוך הם הבחינו על מדיום סלקטיבית ולא סלקטיבי. צמיחה בתנאים סלקטיבית עולה בקנה אחד עם ליקוי השפלה ידי מוטציה נתון. שפע חלבון מוגבר צריך להיות מאושר ביוכימית. שיטה להפקת המהירה של שמרי חלבונים בצורה מתאימה לאלקטרופורזה ומערבית סופג הוא הוכיח גם. קריאה מבוססת צמיחה ליציבות חלבון, בשילוב עם פרוטוקול פשוט להפקת חלבון לאנליזה ביוכימית, מאפשרת זיהוי מהיר של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים. ניתן להתאים את הטכניקות הללו כדי לפקח השפלה של מגוון רחב של חלבונים קצרים ימים. בדוגמא המוצגת, אנזים HIS3, אשר נדרש לסינתזת היסטידין, התמזגלDeg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 מיועד לפירוק לאחר שaberrantly עוסק translocon reticulum endoplasmic. תאי מחסה Deg1 -Sec62-HIS3 היו מסוגלים לגדול בתנאים סלקטיבית כאשר החלבון התייצב.

כדי להמחיש מתודולוגיה זו, אנזים HIS3 כבר התמזג carboxy-הסופי של reticulum endoplasmic מודל השפלה -associated (ER) (ERAD) מצע, Deg1 -Sec62 (איור 2 א) כדי ליצור Deg1 -Sec62-HIS3 (איור 3) . Deg1 -Sec62 מייצג חבר מייסד של כיתת רומן של מצעי ERAD ממוקדות הבאים עמותה מתמשכת, סוטה עם translocon, הערוץ אחראי בעיקר להעברת חלבונים על פני קרום ER 32-34. חלבונים לא יציבים כגון זמניים נקראו ERAD-T (הלקשורים translocon) מצעי...

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע במהירות את הדרישות הגנטיות לפירוק חלבון לא יציב ב-Croce Visier. זה מושג על ידי מיזוג אנזים מדווח הנדרש לצמיחה בתנאים סלקטיביים ספציפיים לחלבון לא יציב מעניין. תאים מסוג בר או מוטנטיים הבאים המבטאים שניהם את חלבון ההיתוך מתורבתים על צלחות אגר בינוניות סלקטיביות.בדיקת הציפוי מספקת אינדיקטור נוח לייצוב חלבון על בסיס צמיחת תאי שמרים על מנת לאשר ביוכימית הבדלים בשפע החלבון בעוד שסוג בתאים מוטנטיים המכילים את חלבון ההיתוך עוברים ליזה באמצעות שיטת מיצוי חלבון מהירה ולא יעילה לניתוח כתמים מערביים. התוצאות מראות כי השפע של חלבון לא יציב גדל בתאים עם מוטציה בגן הנדרש לפירוק. ההיפך הוא הנכון לגבי השפלה של זנים מסוג פרא.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ניתוחי מרדף דופק ומרדף מחזורי הוא שהיא פחות אינטנסיבית וגוזלת זמן, מה שמאפשר קביעת תפוקה מהירה וגבוהה של הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי דרישות הפירוק של מגוון חלבונים לא יציבים. זה יכול לשמש גם לזיהוי רגולטורים של היבטים אחרים של ביטויי גנים כגון שעתוק ותרגום.מי שידגים את הנהלים יהיו שלדון ווטס וג'סטין קראודר. סטודנטים במעבדה שלי לפני הבדיקה הופכים פלסמיד המקודד חלבון היתוך המורכב מחלבון לא יציב ואנזים מדווח מטבולי לזן שמרים מוטנטי. חשד שיש לו פגמים גנטיים הנוגעים לוויסות פירוק החלבון כבקרה, הופך גם את אותו פלסמיד לזן שמרים מסוג בר.חסנו את הטרנספורמנטים בחמישה מיליליטר של מדיום מינימלי הבוחר תאים, המאכלס את מולקולות הפלסמיד. הנח את המבחנה למסובב נוטה ודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למחרת. מדוד את הצפיפות האופטית של תרביות הלילה, ולאחר מכן השווה את ריכוז התאים עבור כל התאים על ידי דילול כל תרבית ל-OD 600 של 0.2 עם מדיה טרייה וצינורות צנטריפוגה בודדים סטריליים של 1.5 מיליליטר.כדי להתחיל את הבדיקה העיקרית, הגדר מטריצת סדרת דילול פי שישה על ידי העברה ראשונה של 200 מיקרוליטר מכל זן מדולל מראש, החל מ-OD 600 של 0.2 לבארות ייעודיות בעמודה הראשונה של צלחת באר סטרילית 96 כהכנה לדילולים הבאים, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 125 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות הריקות בעמודות שתיים, שלוש, וארבע. לאחר מכן, העבירו 25 מיקרוליטר שמרים מעמודה אחת לעמודה שתיים, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב את התאים באופן שווה והמשיכו להעביר 25 מיקרוליטר תאים מעמודה שתיים לעמודה שלוש. חזור על שלבי הדילול הסדרתי עד שהבארות בעמודה ארבע מעורבבות היטב כעזר חזותי לאיתור תאים.הדפיסו תבנית רשת והדביקו אותה בחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי, החל מהעמודה הכי פחות מרוכזת במטריצת הדילול הסדרתי. העבירו ארבעה מיקרוליטר תאים מכל עמודה. על צלחת 96 הבאר על צלחת אגר בינונית מינימלית בקרה הבוחרת לתחזוקת פלסמיד תוך תאית, אתר עוד ארבעה מיקרוליטר של תאים מכל עמודה על צלחת אגר בינונית נפרדת ומינימלית שבוחרת עבור שני הפלסמיד התוך-תאי.תחזוקה וביטוי של חלבון ההיתוך הלא יציב. הניחו לשתי הצלחות להתייבש על הספסל למשך חמש עד 10 דקות. אטמו את המכסים בפרם כדי למנוע התייבשות ודגרו את התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שישה ימים.כאשר מושבות מהתרבות הצומחת ביותר נראות לראשונה בנקודה המדוללת ביותר בצלחת נתונה, הסר את הצלחת מהחממה ותעד את היקף הצמיחה. על ידי צילום, ייתכן שיהיה צורך לצלם תמונות של צלחות שונות בימים שונים או של אותה צלחת במספר ימים. במקרה של זני שמרים שונים המציגים מגוון רחב של שיעורי גדילה, כך שאושר ביוכימית כי גן שזוהה במבחן הגידול מווסת את שפע החלבון מתחיל בהפיכת זני שמרים מסוג בר ומוטנטי עם פלסמיד המקודד את חלבון ההיתוך הנ"ל, לחסן את הטרנספורמנטים בחמישה מיליליטר של מדיום מינימלי הבוחר לתחזוקת פלסמיד תוך תאי ולדגור את הצינורות למשך הלילה במסובב נוטה של 30 מעלות צלזיוס.למחרת, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 מכל תרבית לילה. לאחר שכל הזנים הגיעו ל-OD 600 של 0.4 ומעלה, יש לדלל את כל התרביות בחזרה ל-0.2 במדיום טרי כך שהנפח הסופי של כל זן הוא 10 מיליליטר. דגרו את התאים על שייקר פלטפורמה של 30 מעלות צלזיוס עד שכל התרביות מגיעות לגידול שלב בינוני OD 600, בין 0.8 ל-1.2.קצור תאים על ידי העברת 2.5 יחידות OD בסך הכל של תאים לצינור חרוטי טרי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות והסר את ה-S supernatant. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מערבולת מים מזוקקים או פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את החך ולהעביר את תרחיף התא לצינור טרי של 1.5 מיליליטר.בודד את התאים עם הצנטריפוגה השנייה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, הסר את החטיפה והשהה מחדש את התאים ב -100 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף 100 מיקרוליטר של 0.2 נתרן הידרוקסיד מולארי לתרחיף התאים, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב ולדגור את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע ליזה תאית מוקדמת. אין לערבב את התאים.בודד את התאים שוב עם צנטריפוגה שלישית למשך 30 שניות. בטמפרטורת החדר, הסר את הסופרנטנטים מהתאים ושחרר את התאים על ידי החייאת הגלולה ב-50 עד 100 מיקרוליטר של מאגר דגימה אחד x למבי מנטרל את כל החלבונים על ידי דגירה של התרחיף ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן מקרר את כל התא ליזאט על קרח למשך חמש דקות. לבחינת שפע החלבונים המועדים לצבירה כגון חלבונים עם מספר מקטעים טרנסממברניים קובעים באופן אמפירי את הדגירה, הטמפרטורה והזמן האופטימליים של דנטורציה על ידי התחלה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במקום 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לבסוף, בודד את השבר המסיס על ידי צנטריפוגה של הליזאט למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, העביר את החטף לצינור טרי והשליך את שבר הגלולה הבלתי מסיס. כעת ניתן לטעון את החלק המסיס ישירות על דף SDS, ג'ל או לאחסן בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס בהגדרת בדיקת פירוק חלבון מבוססת גידול שמרים. חלבון היתוך משולש לא יציב מתמזג עם אנזים מטבולי נוסף המחמיא לרקע זן שמרים חסר אותו גן מטבולי.כאשר חלבון ההיתוך מתבטא בשמרים, הוא נוטה לאירועי טרנסלוקציה עקרים בקרום הרטיקולום האנדופלזמי. טרנסלוקציה חריגה זו גורמת לפירוק בתיווך יוביקוויטין של החלבון כולו, כולל האנזים המטבולי, ובכך מונעת התפשטות תאים. עם זאת, בזני שמרים חסרי יוביקוויטין ליגאז, חלבון ההיתוך מוגן מפני פירוק, אפילו בטרנסלוקציה ממוצעת המאפשרת לתאים להתרבות.לכן, בנוכחות יוביקוויטין ליגאז, קיימת התאמה בין פירוק חלבונים המתרחש בתוך התאים לבין כישלון של תאי שמרים להתרבות על לוחות אגר מדוללי מטבוליטים. מצד שני, בהקשר של תאי יוביקוויטין ליגאז פגומים או נעדרים, התפשטות תאי יוביקוויטין ליגאז מצביעה על כך שחלבון ההיתוך היה מוגן מפני פירוק כדי להפחית את הרקע או צמיחה מזויפת ולהגביר את המחמירות של בדיקה זו. ניתן להוסיף מעכבים תחרותיים של האנזים המטבולי למצע הגידול כדי לאשר את התוצאות שנצפו במבחן גידול השמרים.ניתן לברר עדות ישירה לפירוק חלבון היתוך גם עם כתם מערבי. בנוכחות או היעדר יוביקוויטין ליגאז, חלבון ההיתוך יתפרק או יינצל מהרס בהתאמה. חשוב לזכור כי נהלים אלה מדווחים באופן הישיר ביותר על שפע המצב היציב של החלבון המעניין.לאחר ביצוע הליכים אלה, ניתן לבצע ניתוחי דופק או ציקלוהקסימיד על מנת לנתח ישירות את קינטיקה של פירוק חלבון ונוכחות מוטציות שנמצאו כמגבירות את רמות החלבון במצב המחקר.

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד...

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית להגדרת אינטראקציות כימיות-גנטיות בשמרים ניצנים. הגישה בנויה על טכניקות בסיסיות בביולוגיה מולקולרית של שמרים ומתאימה היטב לחקירה מכניסטית של אוספים קטנים עד בינוניים של כימיקלים וסביבות מדיה אחרות.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

שפע החלבונים משקף את שיעורי סינתזת החלבון ופירוק החלבון. מאמר זה מתאר את השימוש במרדף ציקלוהקסימיד ואחריו הכתמה מערבית כדי לנתח פירוק חלבון במודל האיקריוט החד-תאי, Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

למדו לזהות דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות מבחן צמיחה ואישור ביוכימי. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר של יציבות חלבונים בשרשרת.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב

גלה סרטונים נוספים