Name: ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: למדו כיצד לכמת מתילציה של CPG באזורים גנומיים ממוקדים באמצעות ריצוף אמפליקונים בביסולפיט (BSAS). שיטה זו משלבת המרת ביסולפיט, PCR וריצוף דור הבא לדיוק גבוה בניתוח אפיגנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לקולין ואן קירק על דגימות הרשתית והמוח הקטן של העכברים, ולפיטר גרגורי על יצירת הדמויות. המחברים מודים גם לד"ר אליסון גילספי ולמעבדה לביולוגיה מולקולרית וליבת מחקר ציטומטריה על הגישה ל-MiSeq. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH DA029405, EY021716 ו-AG026607 וקרן דונלד ו. ריינולדס.

<ol><li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+separation+of+purines%2C+pyrimidines%2C+and+nucleosides+by+paper+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).</li>
<li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).</li>
<li>Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+roles+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: roles in mammalian development.</a> Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).</li>
<li>Heard, E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance%3A+myths+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms.</a> Cell. 157 (1), 95-109 (2014).</li>
<li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+gene+silencing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice.+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and gene silencing in cancer.</a> Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).</li>
<li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+epigenome%3A+its+origins%2C+contributions+to+tumorigenesis%2C+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).</li>
<li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).</li>
<li>Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+challenges+of+genomewide+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis.</a> Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).</li>
<li>Mikeska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+quantitative+MGMT+promoter+methylation+analysis+using+pyrosequencing+and+combined+bisulfite+restriction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis.</a> The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).</li>
<li>Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+powerful+and+quantitative+sequencing+technology.+Current+Protocols+In%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+%2F+edited+by+Frederick+M.+Ausubel+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In.</a> Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).</li>
<li>Dikow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+methylation+status+of+the+PWS%2FAS+imprinted+region%3A+comparison+of+two+approaches+based+on+bisulfite+sequencing+and+methylation-sensitive+MLPA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA.</a> Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).</li>
<li>Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParrish%2C+RR+%22Current+Protocols+In+Neuroscience+%2F+editorial+board%2C+Jacqueline+N.+Crawley+...+%5Bet+al.%5D%22">Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]</a>. 7 (Unit 7 24), (2012).</li>
<li>Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+uracil+and+cytosine+derivatives+with+sodium+bisulfite.+A+specific+deamination+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method.</a> Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).</li>
<li>Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addition+of+sodium+bisulfite+to+uracil+and+to+cytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine.</a> Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).</li>
<li>Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bisulfite+modification+of+5-methyldeoxycytidine+and+deoxycytidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues.</a> Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).</li>
<li>Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high+accuracy+5-methylcytosine+quantitation+with+base+resolution+by+benchtop+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing.</a> Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33(2013).</li>
<li>Caruccio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+Nextera+technology%3A+simultaneous+DNA+fragmentation+and+adaptor+tagging+by+in+vitro+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition.</a> Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tagmentation-based+whole-genome+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing.</a> Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).</li>
<li>Smallwood, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39(2011).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72(2013).</li>
<li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

BSAS מאפשר להתמקד quantitation, מתילציה DNA מדויק עם יכולות תפוקה גבוהות בשני מספר הדגימות ומספר המטרות. בנוסף, דור ספרייה זו באמצעות tagmentation תיווך transposome דורש DNA קלט פחות, הוא מהיר יותר ומכיל פחות שלבים מאשר גז מסורתי וטכניקות קשירת מתאם שלאחר מכן. שיפורים אלה על פני שיטות קיימות מאפשרים ניתוח מתילציה DNA מדויק ברמת בסיס של כל מטרה של עניין. יתר על כן, BSAS מספק שיטה חדשה לאישור של אזורים של עניין (אזורי מתילציה באופן דיפרנציאלי (DMRS), איי CPG, אזורי רגולטורים) שזוהו באמצעות הגנום כולו 22 או 23 ללכוד גישות bisulfite. תוך שימוש בגישות המאונכות אישור ויותר כמותית שיטות מדויקות משפרת את הקשיחות אנליטי של מחקרי epigenomic. עומק הקריאה הגבוה שהושג עם BSAS מאפשר quantitation מדויק במרווח ביטחון צר, מחדשsulting בquantitation המדויק 16. בנוסף, את היכולת להפעיל דגימות רבות בניסוי אחד יכולה להגדיל את גודל המדגם לאישורים של שיטות הגנום כולו, אשר יגדילו את הכח הסטטיסטי; חולשה של מחקרים רבים אפיגנטיים הנוכחיים. חשוב לציין, BSAS מספק quantitation מתילציה CPG בסיס ספציפי, המאפשר לדור של השערות הניתנות לבדיקה למחקר אפיגנטיים. השערות כגון מתילציה עלתה באלמנט תגובה ספציפי תוביל לירידה בכריכה של גורם שעתוק ספציפי. BSAS, בשילוב עם נתונים ביטוי mRNA לזווג, מספק שיטה להשגת שתי רגולציה אפיגנטיים וביטוי mRNA בתוך פיסת רקמה או אוכלוסיית תא בודדת. מדידות מותאמים של רגולציה וביטוי גם להגדיל את הקשיחות ואת ההשפעה של הממצאים המדעיים. צעדים קריטיים בפרוטוקול BSAS כוללים עיצוב פריימר, amplicon אופטימיזציה, ודור ספרייה /QC. ההטיה PCR הוא הציג אם פריימרים אינם מתוכננים כראוי ולהגביר את יעילות בשונה 8. שימוש בסטנדרטים מתילציה, כגון תקני ציטוזין 100% ו 0% שנוצרו אנזימים מפוגלים, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המידה, אם בכלל, של ההטיה quantitation מתילציה, ושליטה מתודולוגיים נכונה כאשר כימותי מתילציה 16. בדומה לכך, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע אופטימיזציה לתגובות PCR ליצירת amplicon באיכות גבוהה יחיד. אם לא amplicon נוכחת באמצעות ההנחיות הציעו מפורטות בפרוטוקול, צעדי אופטימיזציה כוללים מספר גדל והולך PCR מחזור או סכום קלט bsDNA. אם יש מוצרי PCR מרובים, כוללים פריימר-הדימרים, צעדי אופטימיזציה כוללים הפחתת כמות קלט bsDNA, הפחתת ריכוזי קלט הטוחנות פריימר PCR, עלייה בטמפרטורות חישול, או להקטין את מספר מחזור PCR. אחד או שילוב של נהלי אופטימיזציה אלה מניב תוצאות מספקות כדי ליצור HIG אחתamplicon h-איכות. לחלופין, עיצוב מחדש של פריימרים הוא גישה טובה לקבוצות פריימר שלא להניב amplicon יחידה. לאלו אזורים שבם העיצוב מחדש אינו מתאים או אפשרי, מנוון סטי פריימר כולל שניהם עלול של ציטוזין והטימין של באתרי CPG בפריימרים קדימה ואדנין של וגואנין של באתרי CPG בפריימרים הפוכים לעבוד. עם זאת, ערכות פריימר אלה צריכים אופטימיזציה נוספת כדי להבטיח שאין PCR הטיה מתרחשת, תהליך מחוץ להיקף של פרוטוקול זה. ספריות איכות הן חשובות ביותר להצלחה. ודא שאמצעי QC מתבצעים כדי לקבוע את הגודל, איכות וכמות של ספריות לפני הרצף. תגובות רצף נוטות לכישלון עם קלט של ספריות באיכות נמוכה. הטיה בquantitation מתילציה ניתן למתן על ידי הבטחה כי תדרי מתילציה נמצאים בשני קדימה לאחור רצף קורא. בנוסף, ציוני איכות של בסיסי יישור לאתרי CPG צריכים להיות ≥Q30 גבוה שיתוףnfidence בquantitation. בעוד שאחרים הראו מעט קודם לכן לשום הטיה בתגובות tagmentation של DNA המרה bisulfite 19, להבטיח את המדדים שתוארו לעיל מאפשר לאישור quantitation מתילציה ההטיה הנמוך. BSAS מודד כיום מתילציה באתרי CPG, לעומת זאת, הרחבות עתידיות של שיטה זו תאפשר מדידות מזווגות של CPG 5-HMC עם התוספת של צעדים ניסיוניים הבחנה בין 5-MC ו-5- HMC כגון החדרת perruthenate אשלגן לפני המרת bisulfite 24. זה יגביר את ההשפעה של שירות BSAS כך שהוא מאפשר למתילציה לזווג, שני 5-MC ו-5- HMC, ונתונים ביטוי על מנת לקבוע תפקידי רגולציה של ביטוי גני מתילציה DNA. הכנת ספריית תיווך Transposome של amplicons PCR אין לגרום לעומק רצף ירידה בקצוות של אזורים מוגברים. לכן, אזורים של ריבית גבוהה צריכים להיות מתוכננים לישיבה באמצע amplicons. איךאי פעם, כי BSAS יוצר רצף לקרוא מעמקי&gt; 1000 X, דיוק כמותי של 5-MC מדידות ליד הקצוות של אזורים מוגברים נותרים גבוהות.

זה כבר יותר ממחצית המאה מאז הדו&quot;ח הראשון של מתרחש באופן טבעי שינויי DNA בצורה של מתילציה ציטוזין 1. מתילציה ציטוזין היא בסיס נוקלאוטיד ציטוזין שונה בי פחמן 5 th על טבעת הבסיס יש קבוצה מתיל (5-MC), שכיחה ביותר במוטיב dinucleotide CPG בגנומים של יונקים. הנוכחות הפונקציונלית של 5-MC ביזמי גן מזוהית בדרך כלל עם דיכוי תעתיק, ואילו ההעדר קשור פעילות תעתיק 2. התקדמות עצומה נעשתה בהבנה של תפקיד המתילציה של הדנ&quot;א בפיתוח 3, התפשטות transgeneration פרופילים אפיגנטיים 4, פתוגנזה סרטן 5,6, ומספר תחומי מחקר האחרים שלנו. רבים מפיתוחים אלו הגיעו בשנים האחרונות כמתודולוגיות חדשות פותחו לפרופיל מתילציה DNA 7. עם כניסתו ופופולריזציה של טכניקות של הדור הבא רצף (NGS) יש כיום מספר השיטות לפרופיל מתילציה DNA על פני הגנום כולו או אזורים גדולים של הגנום 8. גישות אלו פותחות את האפשרות של לימודי גילוי שלכמת דפוסי מתילציה DNA והבדלים במתילציה DNA. בנוסף לגישות השערת מניבה אלה, יש צורך משמעותי לשיטות לכמת מתילציה DNA בדיקות ממוקדות / השערה. Pyrosequencing, PCR הספציפי מתילציה, וסנגר רצף ישיר של ה- DNA המרה bisulfite היה השיטות הנפוצות ביותר לניתוח של אזורים ממוקדים (כלומר, אזור אמרגן של גן יחיד או אי CPG) 9-12. כל השיטות האלה מסתמכים על המרת bisulfite, תגובה כימית שבי דיאמינציה ציטוזין unmethylated של מומרות לאורציל של, בעוד ציטוזין מפוגל של להישאר 13,14 ללא פגע. ההגברה PCR של bisulfite-תוצאות המרה DNA בהחלפת אורציל של עם תימין 15 מאפשרות מתילציה ההפרש לקרוא את דרכו כהבדל בסיס. אמנם שימושי מאוד, המגבלות לשיטות אלה כוללות דיוק נמוך כמותי, אורך קריאה קצר, ותפוקת מדגם נמוכה. כדי לתת מענה למגבלות אלה פיתחנו שיטה שכינינו Bisulfite Amplicon רצף (BSAS) 16. מטרתה של שיטה זו היא להיות מסוגלת לנתח אזורים הגנומי היעד של עניין במספר גדול של דגימות עם דיוק כמותית גבוה. BSAS משתמש באלמנטים של שיטות קיימות (המרה bisulfite והגברת PCR ספציפית לאזור) ומשלב אותם עם בנייה פשוטה של הדור הבא ספרייה (בתיווך transposome) 17 וbenchtop NGS 18 (איור 1). גישה זו מספקת לשיטת תפוקה יותר גבוהה כמותי ולבחון את מתילציה ציטוזין בכל אזור של עניין. כאן אנו מציגים אתשיטה בפירוט ותיאור גישות לפתרון בעיות ובדיקת איכות תהליך BSAS.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 ערכת ננו</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>ערכת DNA ברגישות גבוהה Agilent</td><td></td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>טייפון 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - טיהור PCR</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63880</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>ספק כוח בסיסי PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech PCR צלחת 96&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td> סרט איטום חום <td>חצאית למחצה</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>רדיד איטום חום</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>אוטם חום</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 & #956; l טיפים</td><td>אפנדורף</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 & #956; l טיפים</td><td>אפנדורף</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 & #956; l טיפים</td><td>אפנדורף</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT ערכת הכנת דגימת DNA</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Index Kit</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 indexes</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq Desktop Sequencer</a></td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">MiSeq Reagent Kit v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 מחזורים</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST ערכת qPCR אוניברסלית</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקת</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen ערכת בדיקת RNA</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex 96 בארות PCR מערכת</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA ג'ל</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10 בארות</td></tr><tr><td>Novex TBE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr> <tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 מ"ל)</td></tr> <tr><td>1 Kb Plus DNA</td><td>Ladder Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT מהיר בזמן אמת PCR מערכת</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>384 בארות בלוק</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate קורא</td><td>מכשירים מולקולריים/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי נירוסטה</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 מ"מ</td></tr><tr><td>CLC גנומיקה Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>תוכנה לצינור מתילציה</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>סיגמא</td><td>מים ללא נוקלאז</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well צלחת עם חצאית מלאה, Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR Seal</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA מתילציה-ברק ערכת</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA פולימראז</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

ממוקד dna מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

תפקידם של תהליכים אפיגנטיים בשליטה על ביטוי גנים ידוע מזה מספר שנים. מתילציה של DNA בשאריות ציטוזין מעניינת במיוחד עבור מחקרים אפיגנטיים מכיוון שהיא הוכחה כמווסתת ארוכת טווח ודינמית של ביטוי גנים. המאמצים לבחון שינויים אפיגנטיים בבריאות ובמחלות נפגעו בשל היעדר שיטות מדויקות כמותית בעלות תפוקה גבוהה. עם הופעתן והפופולריות של טכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS), כלים אלה מיושמים כעת על אפיגנומיקה בנוסף למתודולוגיות גנומיות ותעתיק קיימות. לצורך חקירות אפיגנטיות של מתילציה של ציטוזין בהן זוהו אזורים מעניינים, כגון מקדמי גנים ספציפיים או איי CpG, ויש צורך לבחון מספר משמעותי של דגימות ברמת דיוק כמותית גבוהה, פיתחנו שיטה הנקראת ריצוף אמפליקון ביסולפיט (BSAS). שיטה זו משלבת המרת ביסולפיט עם הגברה ממוקדת של אזורי עניין, בניית ספרייה בתיווך טרנספוזום ו-NGS על שולחן. BSAS מציעה שיטה מהירה ויעילה לניתוח של עד 10 קילו-בייט של אזורים ממוקדים בעד 96 דגימות בכל פעם, שיכולה להתבצע על ידי רוב קבוצות המחקר עם כישורי ביולוגיה מולקולרית בסיסיים. התוצאות מספקות כימות מוחלט של מתילציה של ציטוזין עם ספציפיות בסיס. ניתן ליישם BSAS על כל אזור גנומי מכל מקור DNA. שיטה זו שימושית למחקרי בדיקת השערות של אזורי יעד מעניינים, כמו גם לאישור אזורים שזוהו בניתוחי מתילציה ברחבי הגנום כגון ריצוף ביסולפיט גנומי שלם, ריצוף ביסולפיט ייצוג מופחת וריצוף חיסוני של DNA שעבר מתילציה.

BSAS קורא מיושר כהלכה לרצף התייחסות המומר יהיה דומה איור 5. ניתן לזהות בבירור dinucleotides CPG וניתן לאמוד במדינות מתילציה על ידי התבוננות שיחות בסיס באתרי CPG בממופה קורא. לדוגמא, עם פקדי מתילציה, 0 מתילציה% תגרום לכל קורא ממופה לאתרים המכילים CPG (איור 5 א) של טי. בקרות מתילציה 100% יגרמו לכל קורא ממופה קוראת לאתרים המכילים CPG של C (איור 5). לכמת את תדירות ציטוזין (C / C + T) באתרי CPG מניב את תדירות מתילציה במדגם המקורי. עקומה סטנדרטי נציג המופקת מבקרות כל מתילציה הגנום (n = 3 / יחס מתילציה) מראה הליניאריות של quantitation מתילציה, כמו גם דיוק בquantitation בכל יחס מתילציה (איור 6). כדוגמא לשיטה זו בסך הכל, RNA ו- DNA היו שיתוף iso<html> קשורות זו לזו מהמוח הקטן עכבר ורשתית (n = 4 / קבוצה). ביטוי רודופסין, הביע באופן סלקטיבי ברקמת רשתית, נמדד באמצעות qPCR. ביטוי זוהה רק ברשתית (איור 7 א). באמצעות BSAS, רמות מתילציה CPG היו לכמת באזור אמרגן רודופסין. רמות מתילציה מצטברות ברחבי אזור האמרגן היו&gt; 80% במוח הקטן בהשוואה ל&lt; 15% ברשתית (p &lt;0.001, t-test פרמטרית) (איור 7). יתרונות BSAS quantitation מתילציה מquantitation מתילציה ספציפי לאתר, ורמות מתילציה ניתן להשוות על בסיס CPG ספציפי על פני כל אזור גנומי נתון. רמות מתילציה CPG פני אמרגן רודופסין היו גבוהות יותר משמעותי בדגימות המוח הקטן בהשוואה לדגימות רשתית (p &lt;0.001, t-test פרמטרית בכל אתר CPG) (איור 7 ג). 1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1:. סכמטי של שיטת BSAS בשיטה זו, הדנ&quot;א הגנומי הוא bisulfite המרה לשנות cytosines unmethylation לuracils. בהמשך לכך, במהלך PCR uracils אלה השתנו לthymines. PCR הגברה מכוונת נגד אזורים של עניין ומעשירה מאוד עבור רק רצפים אלה. Amplicons PCR כתוצאה מכך הם הפכו לספריות צמודות כפולים בתהליך tagmentation פשוט. בהמשך לכך ספריות רצף ברצף הדור הבא benchtop ורצף כניסות ממופים למתילציה בסיליקון והמיר רצף התייחסות ואחוזים של ציטוזין של נקבע באופן ספציפי לבסיס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> איור 2:. בהמרת bisulfite סיליקון ושל האזור של עניין כל אזור של עניין מכל התייחסות הגנומי יכול להיות אין תמיכה בבחירהטד בהמרת bisulfite סיליקון. cytosines ללא CPG מוחלף בתימין של ברצף ההתייחסות. cytosines CPG להישאר cytosines בbisulfite המיר התייחסות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> איור 3:. פריימרים מיקום פריימר Bisulfite PCR נועדו נגד בbisulfite סיליקון והמיר רצף התייחסות. Primers הוא להיות מתוכנן כך שהם אינם חופפים dinucleotides CG או תוכנן בסמוך לdinucleotides CG. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> איור 4: דוגמאות לamplicons PCR באיכות הגבוהה ועניה וספריות רצף עקבות electropherogram נציג ותכנית ג&#39;ל () amplicon האידיאלית עבור דור ספרייה בתיווך transposome עם אחד גבוה.<html> מוצר ריכוז. הספרייה (B) שהופקה מamplicon זה מראה ריכוז גבוה ואפילו הפצת גודל. amplicons PCR (C) מאיכות ירודה, יכולה להיות נמוכה בגודל, ריכוז, ומכיל מספר רב של מוצרים ו / או הדימרים פריימר. amplicons האיכות הירודה אלה תוביל ל( D) נכשלה דור ספרייה עם ריכוז נמוך והתפלגות גודל נמוכה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> איור 5: דוגמאות לפלטי רצף מפקדי מתילציה. (א) בסיליקון והמיר רצף התייחסות עם אתרי CPG מסומן באדום. 0% שליטת מתילציה ממופות קוראת לthymines נבחר האזור מראה (שיא תאוות בצע) מיפוי באתרי CPG. שליטת מתילציה 100% (B) הממופה קוראת להראות המיפוי של ציטוזין (גולת כותרת הכחולה) באתרי CPG. together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig6highres.jpg" /> איור 6:. Quantitation מתילציה על פני מגוון של בקרות מתילציה בקרות מתילציה הגנום כולו מעורבות ביחסי מתילציה (n = 3 / יחס) בין 0% ל 100% היו לכמת באמצעות BSAS. זומם לכמת צפוי לעומת לכמת מדגים הליניאריות של quantitation שליטת מתילציה. בכל הפקדים, היה דיוק גבוה בquantitation מתילציה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> איור 7: דוגמא לניתוח מתילציה DNA וביטוי גנים לזווג מדגימות רקמה. מתילציה אמרגן הממוצעת Rhodopsin לכמת ידי BSAS בין המוח הקטן וDNA רשתית (*** p &lt;0.001, t-test פרמטרית) ביטוי mRNA היחסי Rhodopsin מהמוח קטן עכבר ורקמת רשתית (). (ב). &lt;רמות strong&gt; C ספציפי לאתר CPG) מתילציה פני אמרגן רודופסין (-244 +6, ביחס לאתר תחילת שעתוק [TSS]) במוח קטן עכבר וDNA הרשתית.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת מתילציה של CPG באזורי עניין מוגדרים מתוך DNA גנומי, שבודד מרקמות או תאים רלוונטיים. הדבר משיג תחילה על ידי תכנון פריימרים ל-PCR ספציפיים לסולפיט, להגבּרה של אזורי העניין מתוך DNA גנומי שעבר המרה של ביסולפיט. בשלב השני, אזור העניין שעבר המרת ביסולפיט מוגבר, ולאחר מכן נוצרות ספריות של רצף הדור הבא או NGS מהתוצרי ההגברה.בשלב הבא, הספריות עוברות ריצוף ונוצרים קבצי FASTQ לצורך ניתוח. בשלב הסופי, קטעי הריצוף מיושרים אל רצף המטרה הייחוס שעבר המרה על ידי ביסולפיט, ואחוז ה-5mc מחושב בסופו של דבר על ידי ריצוף אמפליקונים שעברו ביסולפיט, או שניתן לבצע BS-seq כדי לכמת באופן מדויק ונכון את מתילציה של CpG בכל אזור רלוונטי מכל אורגניזם מודל. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ריצוף סנגר, הוא ש-BS-seq מספקת כימות מדויק ונכון של מתילציית CpG באופן מהיר ובספיקת תפוקה גבוהה, מה שמאפשר לבחון מספר רב של אזורים במספר רב של דגימות.לאחר זיהוי המטרה ותכנון הפריימר, הרכיבו את התגובה לאופטימיזציה של הגברה עבור אמפליקון בודד, ולאחר מכן אטמו את פלטת ה-PCR באמצעות סרט איטום תרמי כדי להנמיך את האמפליקונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.לאחר חמש דקות, דגמו את הג'ל באמצעות טרנסלומינטור UV באורך גל עירור של 482 ננומטר. השתמשו בסולם המולקולרי כדי לקבוע את גודל ה-PCR AMPLICONS ולהעריך את ספציפיות התגובה. חפשו פסים מרובים מעבר לגודל האמפליקון הצפוי כדי לקבוע את הגודל הממוצע של שיאי הספריה שזוהו ולהעריך את המולריות.בשלב הבא, הרצו את הספריות על שבב מדידת גודל DNA באמצעות אלקטרופורזה קפילרית עם בדיקת DNA ברגישות גבוהה, בהתאם להוראות היצרן. כדי לכמת את הספריות באמצעות QPCR, השתמשו בפריימרים שתוכננו כנגד רצפי האדפטורים בספריות שהופקו ובסטנדרטים בריכוז ידוע במכשיר זמן-אמת (real-time), תוך שימוש בהגדרות כימות מוחלט בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן, השתמשו בגודל הספריות ובכמות המולרית שהתקבלה מה-QPCR כדי לחשב את הריכוזים המולריים של הספריות. לאחר הריצוף, ייבאו את קבצי ה-fast Q הדחוסים לצנרת ניתוח הריצוף המתאימה, בחרו בייבוא (import), ולאחר מכן בחרו בשיטת הריצוף ששימשה להפקת הקריאות כדי לשמר את מדדי ה-Q scores עבור יישומי קיצוץ הקריאות. ייבאו את קבצי קריאות ה-fast Q הדחוסים המתאימים, ולאחר מכן תחת אפשרויות כלליות, בטלו את הבחירה ב-"discard quality scores".בחרו מיקום לקריאות המיובאות ולחצו על finish. לאחר מכן, תחת NGS core tools, בחרו ב-trim sequences. סמנו את הקריאות לקיטום, תוך השארת הקריאות בעלות ציון Q 30 ומעלה בלבד.לאחר מכן, בחרו בסינון באמצעות מדדי איכות (trim using quality scores) והגדירו את הסף ל-0.001. כדי לבחור רק את הרצפים המכילים נוקלאוטיד ambiguously אחד או פחות, בחרו בסינון נוקלאוטידים ambiguously (trim ambiguous nucleotides) והגדירו את מספר ה-ambiguities המקסימלי לאחד.לאחר מכן, בחרו מיקום לשמירת הקריאות לאחר הקיטום ולחצו על finish כדי למפות את התוצאות המקוצצות אל רצף הייחוס של הגן שהומר in silico באמצעות סולפיט. תחת NGS core tools, בחרו ב-map reads. בשדה reference, בחרו את הקריאות המקוצצות למפוי ולחצו על next.לאחר מכן, תחת מיסוך רצפי ייחוס (reference masking), בחרו את רצף הייחוס המומר ובחרו באפשרות ללא מיסוך (no masking). לחצו על הבא (next), ולאחר מכן הקצו ציון של שלו עבור אי-התאמות (mismatches), הכנסות (insertions) ומחיקות (deletions). הקצו ציון של אחת עבור השבר המינימלי של אורך הקריאה הממופה לרצף הייחוס, והקצו ציון של 0.9 עבור השבר המינימלי של הזהות בין המיפוי, הקריאה ורצף הייחוס. תחת טיפול בהתאמות לא ספציפיות (nonspecific match handling), בחרו באפשרות התעלמות (ignore) ולחצו על הבא (Next) תחת אפשרויות פלט (output options).בשלב הבא, בחרו ב-Create standalone read mappings. לאחר מכן, תחת result handling, לחצו על save. בחרו מיקום לשמירת מיפוי הקריאות (read mapping) ולחצו על finish כדי להריץ את זיהוי הווריאנטים (variant calling) על הקריאות הממופות.במסך ניתוח ריסקוונסינג (re-sequencing analysis), בחרו באפשרות לגילוי וריאנטים בתדירות נמוכה (low frequency variant detection) ובחרו את מיפוי הקריאות (read mapping) לניתוח. לחצו על "next" ולאחר מכן, תחת הפרמטרים לווריאנטים בתדירות נמוכה, הזינו 0.01% ולחצו על "next". תחת מסננים כלליים (general filters), הגדירו את הכיסוי המינימלי ל-1000 כדי להבטיח שהרצף יהיה בעומק של 1000x או יותר.לבסוף, לחצו על next, ולאחר מכן תחת output options בחרו ב-create annotated table ובחרו מיקום לשמירת קובץ טבלת הווריאנטים, לחצו על finish והשתמשו בתדירויות הווריאנטים באתרים ה-CPG המאנוטטים באזור המבוקש מקובץ טבלת הווריאנטים כדי לחשב את תדירות מתילציה של הציטוזין בציטוזין ייחוס בהקשר של CG; קריאות ריצוף של אמפליקון סולפיט שסודרו כראוי לרצף הייחוס המומר ייראו כמו אלו המוצגות באיור. ניתן לזהות בבירור את הדינוקלאוטידים CPG ולהעריך את מצבי המתילציה על ידי התבוננות בקריאות הבסיסים (base calls) באתרים ה-CPG. בקריאות הממופות, 0% מתילציה יביאו לקריאות ממופות המכילות תימין הממופה לאתרי ה-CPG.בקרי 100% מתילציה יניבו קריאות ממופות המכילות ציטוזינים הממופים לאתרי CPG. בניסוי זה, RNA ו-DNA בודדו במקביל מהמוח הדגיאלי (cerebellum) ומהרשתית של עכבר. לאחר מכן, ביטוי האופסין, שהובע באופן סלקטיבי ברקמת הרשתית, נמדד באמצעות QPCR כצפוי.ה-RNA של האופסין זוהה רק ברשתית לאחר כימות רמות מתילציה של CPG באזור הפרומוטר של האופסין באמצעות רצף הגברה של ביסולפיט (bisulfite amplification sequencing). עם זאת, רמות המתילציה המצטברות לאורך אזור הפרומוטר היו גבוהות מ-80% בגב אלחומי, בהשוואה לפחות מ-15% ברשתית. כימות מתילציה בשיטת B SAS מפיק תועלת מכימות מתילציה ספציפי לאתר, המאפשר להשוות את רמות המתילציה על בסיס CPG ספציפי בכל אזור גנומי נתון.ואכן, בניסוי זה נמצא כי רמות מתילציוּן ה-CPG לאורך מקדם האופסין היו גבוהות משמעותית בדגימות מהמוח הקטן בהשוואה לדגימות מהרשתית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת מתילציוּן CPG באזורי עניין מוגדרים מתוך DNA גנומי, שבודד מרקמות או מתאים.

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ"א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ"א הגנומי היעד.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ"א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

ייצוג מופחת משופר ריצוף ביסולפיט הוא שיטה להכנת ספריות ריצוף לניתוח מתילציה של DNA המבוססת על עיכול אנזימי הגבלה בשילוב עם המרת ציטוזין ביסולפיט. פרוטוקול זה דורש 50 ננוגרם של חומר התחלתי ומניב נתוני רזולוציית זוגות בסיסים באזורים גנומיים עשירים ב-GC.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול רצף של methyl-cpG-bonding (MBD) של פרוטוקול רצף וציר חישובי, כדי לזהות אזורים עשירים ב- CpG באופן דיפרנציאלי בחולי לוקמיה כרונית של לימפוציטים (CLL).

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת יישומו של מתיל-Seq, פלטפורמה epigenomic, באמצעות מודל עכברוש לזיהוי שינויים epigenetic הקשורים בחשיפה מתח כרוני. תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא מסוגל זיהוי הבדלים מתילציה הנובעים מחשיפה ללחץ אצל חולדות.

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

המתואר כאן הוא השימוש בשיטה ספציפית הגברה בדיקה כדי לנתח את רמות המטלציה של האלמנטים קו 1 בתאי גזע mesenchymal שטופלו אוסטאוסרקומה נגזר שלפוחיות. בנוסף, הליך פופולרי עבור הפרדת שלפוחיות ושלפוחית של הפרה העובר סרום, הוא הפגינו גם.

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

להלן, אנו מתארים הליך לניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול. ההליך רלוונטי למחקרים החוקרים קשרים בין דפוסי מתילציה של גנים וגורמים התורמים מסרטן בסרטן מערכת העיכול.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

למדו כיצד לכמת מתילציה של CPG באזורים גנומיים ממוקדים באמצעות ריצוף אמפליקונים בביסולפיט (BSAS). שיטה זו משלבת המרת ביסולפיט, PCR וריצוף דור הבא לדיוק גבוה בניתוח אפיגנטי.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

גלה סרטונים נוספים