ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא
24 בפברואר 2015
Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לכמת מתילציה של CPG באזורי עניין מוגדרים מתוך DNA גנומי, שבודד מרקמות או תאים רלוונטיים. הדבר משיג תחילה על ידי תכנון פריימרים ל-PCR ספציפיים לסולפיט, להגבּרה של אזורי העניין מתוך DNA גנומי שעבר המרה של ביסולפיט. בשלב השני, אזור העניין שעבר המרת ביסולפיט מוגבר, ולאחר מכן נוצרות ספריות של רצף הדור הבא או NGS מהתוצרי ההגברה.
בשלב הבא, הספריות עוברות ריצוף ונוצרים קבצי FASTQ לצורך ניתוח. בשלב הסופי, קטעי הריצוף מיושרים אל רצף המטרה הייחוס שעבר המרה על ידי ביסולפיט, ואחוז ה-5mc מחושב בסופו של דבר על ידי ריצוף אמפליקונים שעברו ביסולפיט, או שניתן לבצע BS-seq כדי לכמת באופן מדויק ונכון את מתילציה של CpG בכל אזור רלוונטי מכל אורגניזם מודל. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ריצוף סנגר, הוא ש-BS-seq מספקת כימות מדויק ונכון של מתילציית CpG באופן מהיר ובספיקת תפוקה גבוהה, מה שמאפשר לבחון מספר רב של אזורים במספר רב של דגימות.
לאחר זיהוי המטרה ותכנון הפריימר, הרכיבו את התגובה לאופטימיזציה של הגברה עבור אמפליקון בודד, ולאחר מכן אטמו את פלטת ה-PCR באמצעות סרט איטום תרמי כדי להנמיך את האמפליקונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
לאחר חמש דקות, דגמו את הג'ל באמצעות טרנסלומינטור UV באורך גל עירור של 482 ננומטר. השתמשו בסולם המולקולרי כדי לקבוע את גודל ה-PCR AMPLICONS ולהעריך את ספציפיות התגובה. חפשו פסים מרובים מעבר לגודל האמפליקון הצפוי כדי לקבוע את הגודל הממוצע של שיאי הספריה שזוהו ולהעריך את המולריות.
בשלב הבא, הרצו את הספריות על שבב מדידת גודל DNA באמצעות אלקטרופורזה קפילרית עם בדיקת DNA ברגישות גבוהה, בהתאם להוראות היצרן. כדי לכמת את הספריות באמצעות QPCR, השתמשו בפריימרים שתוכננו כנגד רצפי האדפטורים בספריות שהופקו ובסטנדרטים בריכוז ידוע במכשיר זמן-אמת (real-time), תוך שימוש בהגדרות כימות מוחלט בהתאם להוראות היצרן.
לאחר מכן, השתמשו בגודל הספריות ובכמות המולרית שהתקבלה מה-QPCR כדי לחשב את הריכוזים המולריים של הספריות. לאחר הריצוף, ייבאו את קבצי ה-fast Q הדחוסים לצנרת ניתוח הריצוף המתאימה, בחרו בייבוא (import), ולאחר מכן בחרו בשיטת הריצוף ששימשה להפקת הקריאות כדי לשמר את מדדי ה-Q scores עבור יישומי קיצוץ הקריאות. ייבאו את קבצי קריאות ה-fast Q הדחוסים המתאימים, ולאחר מכן תחת אפשרויות כלליות, בטלו את הבחירה ב-"discard quality scores".
בחרו מיקום לקריאות המיובאות ולחצו על finish. לאחר מכן, תחת NGS core tools, בחרו ב-trim sequences. סמנו את הקריאות לקיטום, תוך השארת הקריאות בעלות ציון Q 30 ומעלה בלבד.
לאחר מכן, בחרו בסינון באמצעות מדדי איכות (trim using quality scores) והגדירו את הסף ל-0.001. כדי לבחור רק את הרצפים המכילים נוקלאוטיד ambiguously אחד או פחות, בחרו בסינון נוקלאוטידים ambiguously (trim ambiguous nucleotides) והגדירו את מספר ה-ambiguities המקסימלי לאחד.
לאחר מכן, בחרו מיקום לשמירת הקריאות לאחר הקיטום ולחצו על finish כדי למפות את התוצאות המקוצצות אל רצף הייחוס של הגן שהומר in silico באמצעות סולפיט. תחת NGS core tools, בחרו ב-map reads. בשדה reference, בחרו את הקריאות המקוצצות למפוי ולחצו על next.
לאחר מכן, תחת מיסוך רצפי ייחוס (reference masking), בחרו את רצף הייחוס המומר ובחרו באפשרות ללא מיסוך (no masking). לחצו על הבא (next), ולאחר מכן הקצו ציון של שלו עבור אי-התאמות (mismatches), הכנסות (insertions) ומחיקות (deletions). הקצו ציון של אחת עבור השבר המינימלי של אורך הקריאה הממופה לרצף הייחוס, והקצו ציון של 0.9 עבור השבר המינימלי של הזהות בין המיפוי, הקריאה ורצף הייחוס. תחת טיפול בהתאמות לא ספציפיות (nonspecific match handling), בחרו באפשרות התעלמות (ignore) ולחצו על הבא (Next) תחת אפשרויות פלט (output options).
בשלב הבא, בחרו ב-Create standalone read mappings. לאחר מכן, תחת result handling, לחצו על save. בחרו מיקום לשמירת מיפוי הקריאות (read mapping) ולחצו על finish כדי להריץ את זיהוי הווריאנטים (variant calling) על הקריאות הממופות.
במסך ניתוח ריסקוונסינג (re-sequencing analysis), בחרו באפשרות לגילוי וריאנטים בתדירות נמוכה (low frequency variant detection) ובחרו את מיפוי הקריאות (read mapping) לניתוח. לחצו על "next" ולאחר מכן, תחת הפרמטרים לווריאנטים בתדירות נמוכה, הזינו 0.01% ולחצו על "next". תחת מסננים כלליים (general filters), הגדירו את הכיסוי המינימלי ל-1000 כדי להבטיח שהרצף יהיה בעומק של 1000x או יותר.
לבסוף, לחצו על next, ולאחר מכן תחת output options בחרו ב-create annotated table ובחרו מיקום לשמירת קובץ טבלת הווריאנטים, לחצו על finish והשתמשו בתדירויות הווריאנטים באתרים ה-CPG המאנוטטים באזור המבוקש מקובץ טבלת הווריאנטים כדי לחשב את תדירות מתילציה של הציטוזין בציטוזין ייחוס בהקשר של CG; קריאות ריצוף של אמפליקון סולפיט שסודרו כראוי לרצף הייחוס המומר ייראו כמו אלו המוצגות באיור. ניתן לזהות בבירור את הדינוקלאוטידים CPG ולהעריך את מצבי המתילציה על ידי התבוננות בקריאות הבסיסים (base calls) באתרים ה-CPG. בקריאות הממופות, 0% מתילציה יביאו לקריאות ממופות המכילות תימין הממופה לאתרי ה-CPG.
בקרי 100% מתילציה יניבו קריאות ממופות המכילות ציטוזינים הממופים לאתרי CPG. בניסוי זה, RNA ו-DNA בודדו במקביל מהמוח הדגיאלי (cerebellum) ומהרשתית של עכבר. לאחר מכן, ביטוי האופסין, שהובע באופן סלקטיבי ברקמת הרשתית, נמדד באמצעות QPCR כצפוי.
ה-RNA של האופסין זוהה רק ברשתית לאחר כימות רמות מתילציה של CPG באזור הפרומוטר של האופסין באמצעות רצף הגברה של ביסולפיט (bisulfite amplification sequencing). עם זאת, רמות המתילציה המצטברות לאורך אזור הפרומוטר היו גבוהות מ-80% בגב אלחומי, בהשוואה לפחות מ-15% ברשתית. כימות מתילציה בשיטת B SAS מפיק תועלת מכימות מתילציה ספציפי לאתר, המאפשר להשוות את רמות המתילציה על בסיס CPG ספציפי בכל אזור גנומי נתון.
ואכן, בניסוי זה נמצא כי רמות מתילציוּן ה-CPG לאורך מקדם האופסין היו גבוהות משמעותית בדגימות מהמוח הקטן בהשוואה לדגימות מהרשתית. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת מתילציוּן CPG באזורי עניין מוגדרים מתוך DNA גנומי, שבודד מרקמות או מתאים.
סקירה כללית
ריצוף אמפליקונים לאחר טיפול בביסולפיט (BSAS) היא טכניקה המשמשת לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ספציפיים. שיטה זו משלבת המרה בביסולפיט עם הגברה באמצעות PCR וריצוף מהדור הבא (next-generation sequencing) כדי להשיג כימות מדויק של המתילציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גנומיקה
- ביולוגיה מולקולרית
- אפיגנטיקה
רקע
- שיטת BSAS מאפשרת ניתוח של דפוסי מתילציה של DNA.
- היא שימושית במיוחד לחקר ויסות וביטוי של גנים.
- השיטה מספקת יכולות עיבוד נתונים רחב-היקף (high-throughput) עבור דגימות מרובות.
- היא מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות כמו רצף סנגר (Sanger sequencing).
מטרת המחקר
- לכימות מדויקת של מתילציה של CPG באזורים גנומיים ממוקדים.
- לשיפור ההבנה של בקרה אפיגנטית בהקשרים ביולוגיים שונים.
- להקל על ניתוח המתילציה באורגניזמי מודל שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון פריימרים ספציפיים ל-PCR עבור הגברה של מטרה.
- הגברה של DNA גנומי שעבר המרה בביסולפיט.
- יצירת ספריות NGS מאמפליקונים של PCR.
- ריצוף וניתוח של קובצי ה-FASTQ שהתקבלו.
תוצאות עיקריות
- כימות מוצלח של רמות מתילציה של CPG ברקמות שונות.
- הדגמה של הבדלים בתבניות המתילציה בין המוחיון לרשתית.
- מתן תובנות לגבי הבקרה של ביטוי אופסין בהתבסס על מצב המתילציה.
- תיקוף של הדיוק והרגישות של BSAS לניתוח מתילציה.
מסקנות
- BSAS היא שיטה חסונה לכימות מתילציה של DNA.
- הטכניקה משפרת את היכולת לחקור מודיפיקציות אפיגנטיות.
- יש לה פוטנציאל ליישומים בתחומי מחקר מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח ממוקד של מתילציה של DNA באמצעות ריצוף אמפליקונים לאחר טיפול בביסולפיט (BSAS) נותן מענה לצורך בפרופילינג אפיגנומי כמותי ובעל תפוקה גבוהה בשלבי הגילוי המוקדמים. הוא מאפשר בחינה מדויקת של בקרה אפיגנטית באזורים גנומיים הרלוונטיים למחלה, ובכך תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים. השיטה מספקת כימות מתילציה ספציפי לבסיס, המהווה בסיס לבדיקת השערות ולתיעדוף תיקי פיתוח במחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת היפותזות של מנגנונים אפיגנטיים בפרומוטורים של גנים מטרה או באיי CpG.
- ערך מדעי: מספק כימות מוחלט של מתילציה של ציטוזין עם ספציפיות לבסיס לצורך תיקוף פונקציונלי של המטרה.
- ערך תפעולי: תומך בניתוח מהיר של עד 96 דגימות ו-10 kb של אזורים מטרתיים בכל הרצה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של מתילציה המתאימים לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולהערכת שחזוריות.
- ערך תפעולי: מייצר ספריות מוכנות ל-NGS מאמפליקונים עבור סריקה אפיגנטית רב-עמודית (multiplexed) וניתנת להרחבה.
- ערך תפעולי: מסייע באישור של אזורים שזוהו במחקרי מתילציה כלל-גנומיים באמצעות תיקוף ממוקד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר ניתוח מערכתי רלוונטי למחלה על ידי השוואת דפוסי מתילציה בין רקמות שונות או מודלים של מחלות.
- ערך מדעי: תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים באמצעות כימות מתילציה ספציפי לאתרים.
- ערך תפעולי: מספק ביטחון חיזוי בהפחתת סיכונים של מנגנונים אפיגנטיים לפני זיהוי המולקולה המובילה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
BSAS משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשר שילוב של נתונים אפיגנטיים בנקודות החלטה מרכזיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת בקרה אפיגנטית בתהליכי תיקוף של מטרות.
- סריקה: מספק קריאות מתילציה כמותיות ובסביקת תפוקה גבוהה להשוואה בין תרכובות או תנאים.
- אנליזה: מייצר נתונים על שכיחות וריאנטים באתרים מסוג CpG לחישוב מדויק של רמות המתילציה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אפיגנטיקה של גילוי לרציפות פרה-קלינית באמצעות פרופיל מתילציה ספציפי לרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הניתנת לשימוש חוזר לניתוח אפיגנטי ממוקד על פני מספר פרויקטים ומערכות מודלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באישור מנגנונים אפיגנטיים וצמצום עמימות מנגנונית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) של כימות מתילציה על פני מערכי דגימות.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטאות מסוג go/no-go באמצעות הפחתת סיכונים אפיגנטיים ויעילות הון בבחירת מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על אישור אפיגנטי של מטרות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהמרה של ביסולפיט, תכנון פריימרים ל-PCR והכנת ספריות NGS.
- תלוי בגישה לרצף דור הבא שולחני (benchtop NGS) ואלקטרופורזה קפילרית לכימות הספריות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של צינורות עיבוד ביואינפורמטיים (bioinformatics pipelines) לקיטום קריאות, מיפוי וזיהוי וריאנטים.
- כולל שיקולי התאמה למקורות DNA שונים ולאזורים גנומיים רלוונטיים.
- מוגבל על ידי הצורך בידע מוקדם על אזורי המטרה לצורך תכנון פריימרים ספציפיים.
