ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת מתילציה של CPG באזורים ממוקדים של עניין מתוך DNA גנומי, מבודדים מרקמה או תאים מעניינים. זה מושג על ידי תכנון ראשון על ידי פריימרים PCR ספציפיים לסולפיט כדי להגביר אזורי עניין מ-DNA גנומי שהומר על ידי בי סולפיט. בשלב השני, אזור העניין המומר של בי סולפיט מוגבר, וספריות ריצוף או NGS של הדור הבא נוצרות מהחסרונות של האמפליקונים.

לאחר מכן, הספריות מרוצפות וקבצי FASTQ נוצרים לניתוח. בשלב האחרון, קריאות הרצף מיושרות לרצף יעד הייחוס שהומר על ידי סולפיט, וחמשת אחוזי ה-mc מחושבים בסופו של דבר על ידי ריצוף אמפליקון סולפיט או שניתן לבצע BS a s כדי לכמת בצורה מדויקת ומדויקת את מתילציה של CPG בכל אזור עניין מכל אורגניזם מודל. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ריצוף סנגר, הוא ש-BS A S מספק כימות מתילציה מדויק ומדויק של CPG בצורה מהירה וגבוהה, ומספק את ההזדמנות לבחון אזורים מרובים במספר גבוה של דגימות.

לאחר זיהוי המטרה ותכנון הפריימר, הרכיבו את התגובה לאופטימיזציה של הגברת המטרה של מגבר יחיד, ולאחר מכן אטמו לוחית PCR עם סרט אטום בחום כדי לדמיין את האמפליקונים על ידי אלקטרופורזה של דף. לאחר מכן, טען את הבארות המתאימות ב-30 מיקרוליטר של תגובות PCR או סולם, ולאחר מכן הפעל את הג'ל ב-200 וולט למשך כ-45 דקות. כאשר הצבע הראשון מגיע לסוף הג'ל, עצרו את התגובה ואז כסו את הג'ל כולו בחמישה מיקרוגרם למיליליטר של AUM ברומיד טרי שהוכן לאחרונה.

לאחר חמש דקות, דמיין את הג'ל באמצעות טרנס-לומינטור UV באורך גל עירור של 482 ננומטר. השתמש בסולם כדי לשנות את גודל ה-PCR AMPLICONS כדי לקבוע את הספציפיות של התגובה. חפש מספר רצועות מלבד גודל האמפליקון הצפוי כדי לקבוע את הגודל הממוצע של פסגות הספרייה שזוהו והערכה של המולריות.

לאחר מכן, הפעל את הספריות על שבב גודל DNA אלקטרופורזה נימי עם בדיקת DNA ברגישות גבוהה בהתאם להוראות היצרן. לכמת את הספריות על ידי QPCR. השתמש בפריימרים שתוכננו כנגד רצפי המתאמים בספריות ובתקנים שנוצרו עם ריכוז ידוע במכשיר בזמן אמת, תוך שימוש בהגדרות הכימות המוחלטות בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן השתמש בגודל הספריות ובכימות המולרי מה-QPCR כדי לחשב את הריכוזים המולאריים של הספריות. לאחר הרצף, ייבא את קבצי ה- Q המהירים הדחוסים לקו הצינור המתאים לניתוח הרצף, בחר ייבוא ולאחר מכן בחר את שיטת הרצף המשמשת ליצירת הקריאות כדי לשמור על ציוני ה- Q עבור יישומי חיתוך הקריאה. ייבא את קבצי הקריאה המהירה המהירה המתאימים ולאחר מכן, תחת אפשרויות כלליות, בטל את הבחירה בביטול ציוני איכות.

בחר מיקום עבור הקריאות המיובאות ולחץ על סיום. לאחר מכן, תחת כלי הליבה של NGS, בחר רצפי חיתוך. סמן את הקריאות שיש לקצץ, תוך שמירה רק על הקריאות המכילות יותר או שווה לתוצאות Q 30.

לאחר מכן בחר את הגימור באמצעות ציוני איכות והגדר את המגבלה ל-0.001. כדי לבחור רק את הקנים המכילים פחות או שווה לנוקלאוטיד מעורפל אחד. בחר חתוך נוקלאוטידים דו-משמעיים והגדר את המספר המרבי של אי בהירות לאחד.

לאחר מכן בחר מיקום לשמירת הקריאות החתוכות ולחץ על סיום כדי למפות את הרזולוציה החתוכה לסיליקו על ידי הפניה לגן שהומר סולפיט. תחת כלי הליבה של NGS, בחר קריאות מפה. כדי להפנות, בחר את הקריאות החתוכות למיפוי ולחץ על הבא.

לאחר מכן, תחת מיסוך הפניה, בחר את רצף ההתייחסות שהומר ובחר ללא מיסוך. לחץ על הבא ולאחר מכן הקצה ציון שלוש עבור אי-התאמות, הוספות ומחיקות. הקצה ציון של 1 עבור השבר המינימלי של מפת אורך הקריאה להפניה והקצה ציון של 0.9 עבור חלק הזהות המינימלי בין המפה, הקריאה וההפניה תחת טיפול בהתאמה לא ספציפית, בחר, התעלם ולחץ על הבא תחת אפשרויות פלט.

לאחר מכן, בחר צור מיפויי קריאה עצמאיים. לאחר מכן, תחת טיפול בתוצאות, לחץ על שמור. בחר מיקום לשמירת מיפוי הקריאה ולחץ על סיום כדי להפעיל את קריאת הגרסה בקריאות הממופות.

תחת ניתוח רצף מחדש, בחר את זיהוי המשתנה בתדר נמוך ובחר את מיפוי הקריאה לניתוח. לחץ על הבא ולאחר מכן תחת פרמטר משתנה תדירות נמוכה, הזן 0.01%ולחץ על הבא. תחת מסננים כלליים, הגדר את הכיסוי המינימלי ל- 1000 כדי להבטיח שהרצף יהיה בעומק של גדול או שווה ל- 1000 x.

לבסוף, לחץ על הבא ולאחר מכן תחת אפשרויות פלט בחר צור טבלה מבוארת ובחר מיקום לשמירת קובץ טבלת הגרסאות, לחץ על סיום והשתמש בתדרי הגרסאות באתרי ה-CPG המבוארים באזור העניין מקובץ טבלת הגרסאות כדי לחשב את תדירות מתילציה של ציטוזין בציטוזין ייחוס בהקשר CG על ידי קריאות ריצוף אמפליקון סולפיט מיושרות כראוי לרצף הייחוס שהומר ידמו לאלה המאוירים באיור. ניתן לזהות בבירור את הדינוקלאוטידים של CPG ולהעריך את מצבי המתילציה על ידי התבוננות בקריאות הבסיס באתרי ה-CPG. בקריאות הממופות, מתילציה של 0% תביא לקריאות ממופות המכילות תימין הממופות לאתרי ה-CPG.

בקרות מתילציה של 100% יביאו לקריאות ממופות המכילות ציטוזינים הממופים לאתרי CPG. בניסוי זה, RNA ו-DNA בודדו יחד מעכבר, מוח קטן ורשתית. ביטוי האופסין שהתבטא באופן סלקטיבי ברקמת הרשתית נמדד לאחר מכן באמצעות QPCR כצפוי.

ה-RNA של האופסין זוהה רק ברשתית לאחר כימות רמות המתילציה של CPG באזור מקדם האופסין על ידי ריצוף הגברה של דו סולפיט. עם זאת, רמות המתילציה המצטברות באזור המקדם היו גבוהות מ-80% במוח הקטן בהשוואה לפחות מ-15% ברשתית. כימות מתילציה של B SAS נהנה מכימות מתילציה ספציפי לאתר, ומאפשר השוואה של רמות המתילציה על בסיס ספציפי ל-CPG על פני כל אזור גנומי נתון.

ואכן, בניסוי זה, רמות המתילציה של CPG על פני מקדם האופסין נמצאו גבוהות משמעותית בדגימות המוח הקטן בהשוואה לדגימות הרשתית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת מתילציה של CPG באזורים ממוקדים של עניין מתוך DNA גנומי, מבודדים מרקמות או מתאים.