Name: Bioconjugation וRadiosynthesis של 89 נוגדנים שכותרתו ZR-DFO (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: למד סינתזה של נוגדנים מסומנים בזירקוניום-89 באמצעות DFO לצילום PET בחיות מודל סרטן. הפרוטוקול מכיל ביוקונג'וגציה, רדיוסינתזה וטיהור כרומטוגרפי ליישומים אונקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים פרופ &#39;תומס ריינר, ד&quot;ר יעקב Houghton, וסרג&#39; ד&quot;ר Lyaschenko לשיחות מועילות.

כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. הצמידה של DFO-NCS לJ591 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין פתרון 2-5 מ&quot;ג / מיליליטר של J591 ב 1 מיליליטר של או מלוח 1x פוספט שנאגרו (pH 7.4) או 0.5 חיץ M HEPES (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר DFO-NCS בDMSO היבש בריכוז שבין 5-10 מ&quot;מ (3.8-7.6 מ&quot;ג / מיליליטר). Sonicate או מערבולת הפתרון ביסודיות על מנת להקל פירוק מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של תמיסת J591 ל8.8-9.0-ידי הוספת aliquots הקטן (&lt;10 μl) של 0.1 M Na 2 CO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון DFO-NCS המתאים לעודף טוחנת 3-4 פי של chelator bifunctional. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחינהple, להוסיף 4-5 μl של 10 מ&quot;מ פתרון DFO-NCS (40.4 nmol DFO-NCS) (7.6 מ&quot;ג / מיליליטר) עד 1 מיליליטר של 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון נוגדני J591 (13.3 nmol J591). הסכום של DMSO בתערובת התגובה המימית הסופית לא יעלה על 2% v / v. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בבלוק חימום התססה ב 350 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעת 1 ב 37 ° C, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות טור desalting הדרת גודל חד פעמי ארוז מראש עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי באמצעות 0.5 חיץ M HEPES (pH 7.4) כeluent. צעד זה יניב פתרון 2 מיליליטר של מבנה J591-DFO הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של J591-DFO לבנות על ספקטרופוטומטר UV-Vis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גבוה יותר של המבנה הוא רצוי, לרכז את פתרון J591-DFO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון של immunoconjugate J591-DFO הושלם ב -20 ° C בחושך. </ol> 2. Radiolabeling J591-DFO עם 89 Zr זהירות: בשלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים או ביצוע כל עבודה אחרת עם חוקרי רדיואקטיביות צריכה להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. יש לנקוט את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. הערה: בריבית של שטר שמירת radiochemical הנכונה, את כמות הרדיואקטיביות במדגם יש למדוד באמצעות כיל מינון ונרשמה לפני ואחרי שלבי 2.2-2.13 בפרוטוקול בהמשך. זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical ופעילויות ספציפיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של .5-2.0 מ&quot;ג של J591-DFO ב200 μl של 0.5 חיץ M HEPES, pH 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה נפח של &lt;sup&gt; 89 פתרון Zr 4+ מניות (מסופק בדרך כלל ב1.0 M חומצה אוקסלית) מתאים 1.0-6.0 MCI (37-222 MBq) לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר פלסטיק בורג יתר. כוון את עוצמת הקול של פתרון זה בסך 300 μl באמצעות חומצה אוקסלית 1.0 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של תמיסת 89 Zr 4+ ל6.8-7.5 באמצעות 1.0 M Na 2 CO 3. בגין על ידי הוספת 250 μl של 1.0 M Na 2 CO 3 לZr 89 4+ פתרון ולאחר מכן להוסיף קטן (&lt;10 μl) aliquots של בסיס כדי להשיג את ה- pH הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הכמות הרצויה של פתרון מותאם pH 89 Zr 4+ לפתרון J591-DFO מוכן בשלב 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ה- pH של תערובת תגובת radiolabeling כדי לוודא שהוא נופל בטווח הרצוי של 6.8-7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תגובת radiolabeling במשך 60 דקות ב RT על בלוק חימום התססה ב 350 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות של דגירה, למדוד את radiolabeling תשואה של התגובה באמצעות רדיו-TLC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, במקום 1 μCi של תערובת תגובת radiolabeling על רצועת TLC-ספוג סיליקה. לאפשר aliquot לייבוש, להפעיל את TLC באמצעות eluent של 50 מ&quot;מ DTPA (pH 5.5) ולנתח את רצועת TLC באמצעות סורק הרדיו-TLC. 89 Zr 4+ חייב לבנות J591-DFO יופיע במוצא (R f &lt;0.1), ואילו קטיונים חופשיים 89 Zr 4+ יהיו chelated ידי DTPA וelute עם חזית הממס (ו R&gt; 0.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את תשואת radiolabeling של התגובה על ידי שילוב radiochromatogram, חלוקת השטח מתחת לעקומה מR f 0.0-.1 על ידי השטח הכולל מתחת לעקומה, והכפלה ב -100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תשואת radiolabeling מספיקה (בדרך כלל פעילות ספציפית תיאורטית של&gt; 2 MCI / מ&quot;ג), להרוות את התגובה עם 5 μl של 50 מ&quot;מ DTPA, pH 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את USI immunoconjugate וכתוצאה מכךng טור מראש ארז גודל חד פעמי desalting הדרה עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי באמצעות eluent של 0.9% או תמיסת מלח סטרילית עם 5 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת gentisic או 0.25 M נתרן אצטט (pH 5.5) עם 5 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת gentisic . צעד זה יניב פתרון 2 מיליליטר של radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיהור, לאמת את טוהר radiochemical של 89 ZR-DFO-J591 באמצעות רדיו-TLC כפי שמתואר בשלב 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את תשואת radiolabeling הכוללת של התגובה על ידי חלוקת הסך של פעילות בתחילה להוסיף את פתרון הנוגדן על ידי כמות הרדיואקטיביות מבודדת עם radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 המטוהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הפעילות הספציפית הסופית על ידי חלוקת הסך של פעילות מבודדת עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-J591 המטוהר 89 על ידי המסה הראשונית של DFO-J591 בתגובת radiolabeling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, להתרכז הדואר 89 פתרון ZR-DFO-J591 באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי. הערה: חומצת gentisic משמשת בשלב הטיהור הסופי היא רדיו-מגנה מועסק כדי למזער את ההשפלה של הנוגדן בשל radiolysis 46 בעוד האחסון של radioimmunoconjugate ZR-DFO-J591 89 עד 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. אפשר, זה לא מומלץ. אם radioimmunoconjugate הוא להיות מאוחסן, השתמש 0.25 M נתרן אצטט (pH 5.5) עם 5 מ&quot;ג / מיליליטר חומצת gentisic כמאגר אחסון על מנת למזער את הסיכון לradiolysis תיווך היפוכלוריט. 47 </li></ol> 3. בVivo PET הדמיה עם 89 ZR-DFO-J591 זהירות: כמו בסעיף 2 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. כל possibיש לנקוט צעדי le כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכברי זכרי athymic בעירום, שתל תת עורי 5 x 10 תאי סרטן ערמונית LNCaP 6 ולאפשר לגדול אלה לxenograft 100-150 מ&quot;מ 3 (3-4 שבועות לאחר חיסון). 44 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 לריכוז של 1.0 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של פתרון 89 ZR-DFO-J591 (200 μCi; 7.4 MBq). לוריד הזנב לרוחב של עכברי נושאי xenograft 48 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 12, 24, 48, 72, 96, או 120 שעות שלאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן, ולשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ וApplהמשחה y העיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה. 49 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סריקת סטטי עם מינימום של 40 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. 50 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה. </li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

בעוד בניית radioimmunoconjugates, הנקרא-ZR-DFO radiolabeling, וההדמיה של 89 הוא בדרך כלל הליך ולא פשוט, זה חשוב לשמור על כמה שיקולים מרכזיים במוח במהלך כל שלב של התהליך. לדוגמא, אולי הסיבה הסבירה ביותר לדאגה במהלך שלב נטיה של ההליך היא הצבירה של הנוגדן בתגובה הצמידה. בעיה זו היא לרוב תוצר של ערבוב הלקוי של תגובת נטיה לאחר התוספת של פתרון מניות DFO-NCS. 22 כאשר זה קורה, ההפצה שאינה הומוגנית של DFO-NCS יכולה לגרום לרמות גבוהות מדי של תגובה המקומית ב נוגדן, שיכו...

בשל רגישותם הראויה לציון, זיקה, וסלקטיביות, נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים לתאים סרטניים. עם זאת, היישום שלהם בטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים הדמיה (PET) כבר הקשו על ידי חוסר רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים מתאים לתיוג שלהם. 1-3 אחד השיקולים החשובים ביותר בעיצוב של radioimmunoconjugates הוא התאמת הריקבון הפיזי חצי חיים של הרדיו-איזוטופי לin vivo הפרמקוקינטיקה של הנוגדן. באופן ספציפי יותר, לעתים קרובות יש נוגדנים זמן מחצית חיים ביולוגיים ארוכים יחסית, רב היום, ולכן הוא חייב להיות מסומן עם רדיואיזוטופים עם זמן מחצית חיים פיזיים דומים. עבור יישומי הדמיה PET, נוגדנים היו radiolabeled באופן מסורתי עם 64 Cu (t 1/2 = 12.7 שעות), 86 Y (t 1/2 = 14.7 שעות), או 124 אני (t 1/2 = 4.18 ד). 4, 5 עם זאת, כל אחד מרדיואיזוטופים אלה בעל מגבלות משמעותיות שתפגענה בהתאמתם להדמיה קלינית. בעוד radioimmunoconjugates שכותרתו עם 86 Y ו- 64 Cu הוכיח מבטיח בחקירות פרה-קליניים, שני איזוטופים בעלי זמן מחצית חיים פיזיים כי הם קצרים מכדי להיות יעילים עבור הדמיה בבני אדם. 124 אני, לעומת זאת, יש לו זמן מחצית חיים פיזיים כמעט אידיאליים ל הדמיה עם נוגדנים, אבל זה יקר ויש לו מאפייני ריקבון הכי מוצלחים שיובילו לרזולוציה נמוכה יחסית תמונות קליניות. יתר על כן, 124 radioimmunoconjugates שכותרתו אני יכול להיות כפוף לdehalogenation in vivo, תהליך שיכול להוריד את יחסי פעילות גידול לרקע. 6,7 הכונן למצוא רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים להחליף 64 Cu, 86 Y, ואני 124 בradioimmunoconjugates הזין את העליות האחרונות במחקר על 89 נוגדני Zr כותרת. 8-12 Tהוא הסיבה להופעתו של 89 Zr היא פשוטה: radiometal בעל כימי כמעט אידיאליים ותכונות פיזיות לשימוש בradioimmunoconjugates PET אבחון 13 89 Zr מופק באמצעות 89 Y (p, n) 89 תגובת Zr על מאיץ חלקיקים באמצעות. זמין מסחרי ויעד Y 89 100% טבעיים בשפע. 14,15 radiometal יש תשואת פוזיטרונים של 23%, דועך עם זמן מחצית חיים של 78.4 שעות, ופולט פוזיטרונים עם האנרגיה נמוכה יחסית של 395.5 keV (איור 1). 13,16,17 זה חשוב לציין כי 89 Zr גם פולט אנרגיה גבוהה, 909 keV γ-ray עם יעילות של 99%. בעוד פליטה זה לא מפריעה במרץ עם 511 פוטונים הנפלטים keV, זה דורש שיקול נוסף בכל קשור לתחבורה, טיפול, וdosimetry. למרות אזהרה זו, מאפיינים אלה ריקבון סופו של דבר אומר שיש 89 Zr h נוח יותר לא רקalf-חיים להדמיה עם נוגדנים מ -86 Y ו- 64 Cu, אלא גם יכול לייצר תמונות ברזולוציה גבוהות יותר מאשר 124 אני, אשר פולט פוזיטרונים עם אנרגיות גבוהות של 687 ו 975 keV כמו גם מספר הפוטונים עם אנרגיות בתוך 100-150 keV של הפוטונים שנוצרו פוזיטרונים 511 קאב. 13 יתר על כן, 89 Zr הוא גם בטוח יותר לטפל, פחות יקר לייצר, וresidualizes בגידולים באופן יעיל יותר מאשר עמיתו יוד רדיואקטיבי. 18,19 אחת הגבלת פוטנציאל של 89 Zr היא שזה לא שיש לי איזוטופולוג טיפולי, למשל, 86 Y (PET) לעומת 90 Y (טיפול). זה מונע את בנייתם ​​של סוכנים זהים מבחינה כימית, פונדקאיות הדמיה שיכולה להיות מועסק כגששים מדי מינון לעמיתים הטיפוליים שלהם. שאמרו, החקירות מצביעות על כך שיש לי פוטנציאלי כממלאי מקום להדמיה 90 א- ו -177 immunoconjugates כותרת Lu 89 נוגדנים Zr שכותרתו.20,21 מבחינה כימית, כמו מתכת הקבוצה IV, 89 Zr קיים כקטיון +4 בתמיסה מימית. יון 4+ Zr טעון מאוד, (רדיוס אפקטיבי יוני = 0.84 א) גדול יחסית, ויכול להיות מסווג כקטיון &quot;קשה&quot;. ככזה, הוא מציג העדפת ligands נושאות עד שמונה תורמי חמצן קשים, אניוני. בקלות chelator הנפוץ ביותר בשימוש בradioimmunoconjugates 89 שכותרתו Zr הוא desferrioxamine (DFO),, chelator אציקליים-נגזר siderophore נושאת שלוש קבוצות hydroxamate. יגנד ביציבות מרכז את קטיון Zr 4+ במהירות ובצורה נקיה ב RT ברמות pH רלוונטיים מבחינה ביולוגית, ומורכב ZR-DFO וכתוצאה מכך נותר יציב במהלך מספר ימים במלח, בסרום דם, וכל דם. 22 מחקרים חישובית ממליצים שDFO טפסים מורכב hexacoordinate עם Zr 4+ בי מרכז המתכת מתואם לneut שלושRAL ושלושה תורמי anionic חמצן של יגנד, כמו גם שתי מולקולות מים אקסוגניים (איור 2). 23,24 ההתנהגות של radioimmunoconjugates העסקת פיגום נטיית 89 ZR-DFO in vivo באופן כללי היה מצוין. עם זאת, במקרים מסוימים, הדמיה ומחקרי biodistribution חריפים חשפו רמות גבוהות פעילות בעצמות של עכברים שהוזרקו עם 89 נוגדני Zr שכותרתו, נתונים שמצביעים על כך שosteophilic 89 Zr 4+ קטיון הוא שוחרר מchelator in vivo ולאחר מכן mineralizes בעצמות. 25 לאחרונה, מספר החקירות לתוך הפיתוח של רומן 89 chelators Zr 4+ במיוחד ligands עם שמונה תורמי חמצן הופיעו בספרות. 24,26,27 עם זאת, כיום, DFO הוא chelator המועסק באופן נרחב ביותר ב -89 ZR-כותרת radioimmunoconjugates בהפרש גדול. מגוון שונהאסטרטגיות bioconjugation להיות מועסקים לצרף DFO לנוגדנים, כוללים כימיה bioorthogonal לחץ, התגובה של DFO תיאול-reactive בונה עם cysteines בנוגדן, והתגובה של מופעל DFO נושאי אסתר בונה עם lysines בנוגדן. 4,28- 30 בקלות את האסטרטגיה הנפוצה ביותר, עם זאת, היו השימוש בנגזרי isothiocyanate נושאות של DFO, DFO-NCS (איור 2). 22 chelator bifunctional זמין מסחרי חסונה זה ובאמינות יוצרת קשרים עם lysines של יציבים, thiourea קוולנטיים נוגדן (איור 3). במהלך השנים האחרונות, במגוון רחב של 89 radioimmunoconjugates כותרת ZR-DFO דווח בספרות. חקירות פרה-קליניים היו שופעות במיוחד, הכוללות נוגדנים הנעים בין ידוע יותר cetuximab, bevacizumab, וtrastuzumab לנוגדנים אזוטריים יותר כמו T מיקוד CD105RC105 וfPSA מיקוד 5A10. 30-36 לאחרונה, מספר קטן של ניסויים קליניים בשלבים המוקדמים באמצעות 89 נוגדנים שכותרתו ZR-DFO צמחו בספרות. ניסויים באופן ספציפי, קבוצות בהולנד פרסמו העסקת 89 U36 ZR-DFO-cmAb, 89 tiuxetan ZR-DFO-ibritumomab, ו -89 ZR-DFO-trastuzumab. 21,32,37 בנוסף, מגוון רחב של ניסויים קליניים אחרים עם 89 radioimmunoconjugates כותרת ZR כרגע בעיצומו, ובכלל זה חקירות כאן בMemorial Sloan Kettering Cancer Center באמצעות 89 ZR-DFO-J591 PSMA מיקוד הדמיה סרטן הערמונית וZR-89 DFO-trastuzumab מיקוד HER2 הדמיה סרטן השד. 23, 30 בנוסף, בעוד נוגדני radiolabeled יישארו 89 הרדיואקטיביות Zr כותרת הנפוצה ביותר, radiometal גם יותר ויותר הועסק עם וקטורים אחרים, כוללים פפטידים, חלבונים, וננו. 38-43 </sup&gt; המודולריות של המתודולוגיה תיוג ZR-DFO זה 89 היא נכס אדיר. הרפרטואר של נוגדני מיקוד סמן ביולוגי הוא המתרחב, והעניין בביצוע בתחום ההדמיה PET vivo באמצעות המבנים הללו צומח במהירות. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי הפיתוח של יותר שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים יכול להועיל השדה. פרוטוקול ניסוי נכתב מצוין לנטיית DFO-NCS וradiolabeling 89 Zr כבר פורסם על ידי Vosjan, et al. 22 אנו חשים כי ההפגנה החזותית הניתנת על ידי עבודה זו יכולה לעזור לחוקרים חדשים לטכניקות אלה. בפרוטוקול ביד, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של 89 radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב,ו- (3) in vivo ההדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב 89 במודל עכברי של הסרטן. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>p-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>חנות ב-80 מעלות; C</td></tr><tr><td>[89Zr]Zr-oxalate</td><td>שונים, כולל פרקין-אלמר</td><td></td><td>זהירות: חומר רדיואקטיבי</td></tr><tr><td>PD-10 עמודי התפלה</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>לאחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>סיליקה ג'ל ספוג RadioTLC נייר</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>חתוך לרצועות ברוחב 0.5 ס"מ</td></tr></tbody></table>

bioconjugation וradiosynthesis של<sup&gt; 89</sup&gt; נוגדנים שכותרתו zr-dfo

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

הזיקה, סגוליות, והסלקטיביות יוצאות דופן של נוגדנים להפוך אותם וקטורים בצורה יוצאת דופן אטרקטיביים לרדיואקטיביות PET-ממוקד של גידול. בשל זמן מחצית החיים הביולוגיים רב-היום שלהם, נוגדנים חייבים להיות מסומנים עם radionuclides פולטות פוזיטרונים עם זמן מחצית חי ריקבון פיזי ארוכים יחסית. באופן מסורתי, איזוטופים פולטות פוזיטרונים 124 אני (t 1/2 = 4.18 ד), 86 Y (t 1/2 = 14.7 שעות), ו- 64 Cu (t 1/2 = 12.7 שעות) שימשו לתייג נוגדנים ל ההדמיה PET. לאחרונה, עם זאת, השדה יש עדים עלייה דרמטית בשימוש בradiometal 89 Zr פולטות פוזיטרונים בסוכני הדמיה PET מבוסס נוגדן. 89 Zr הוא רדיו-איזוטופי כמעט אידיאלי להדמית PET עם immunoconjugates, כפי שהיא בעל מחצית פיזית -life (t 1/2 = 78.4 שעות), כי הוא תואם את הפרמקוקינטיקה in vivo של נוגדנים ופולט ENE נמוכה יחסיתפוזיטרונים rgy שמייצר תמונות ברזולוציה גבוהות. יתר על כן, נוגדנים יכולים להיות מתויגים בצורה ישירה עם 89 Zr באמצעות desferrioxamine-נגזר siderophore chelator (DFO). בפרוטוקול זה, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של 89 Zr- radioimmunoconjugate DFO-מב, ו (3) in vivo הדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב 89 במודל עכברי של הסרטן.

הצעד הראשון בפרוטוקול זה נטיה של DFO-NCS לנוגדן הוא בדרך כלל די חזק ואמין. באופן כללי, ניתן לקבל immunoconjugate המטוהר,-שונה chelator בתשואה&gt; 90%, ובאמצעות 3 שווה טוחנת של DFO-NCS בתגובת נטיה הראשונית תניב דרגה של תיוג של chelator של כ 1.0-1.5 DFO / מב. 89 Zr צעדי radiolabeling וטיהור של ההליך הם גם פשוטים. בריכוזים המפורטים בפרוטוקול לעיל, תשואות radiolabeling של&gt; 80% ופעילויות כך ספציפיות של&gt; 2.0 MCI / מ&quot;ג אופייני לאחר 60 דקות ב RT. Chromatogram הרדיו-T...

בשל זמן מחצית החיים הרדיואקטיבי הרב-יומי שלו ותכונות הדעיכה החיוביות, הרדיו-מתכת פולטת הפוזיטרונים 89Zr מתאימה מאוד לשימוש בתרופות רדיו-פרמצבטיות מבוססות נוגדנים להדמיית PET. בפרוטוקול זה יתוארו הביו-קונגוגציה, הרדיוסינתזה והיישום הפרה-קליני של 89נוגדנים המסומנים ב-Zr.

Bioconjugation וRadiosynthesis של<sup&gt; 89</sup&gt; נוגדנים שכותרתו ZR-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסנתז רדיו-אימונוקונג'וגט מסומן ב-zirconium 89 DFO ולהעריך את ביצועיו in vivo. זאת מושגים תחילה על ידי חיבור הצ'לטור deferoxamine לנוגדן. השלב השני הוא סימון רדיואקטיבי של קונג'וגט הנוגדן DFO באמצעות zirconium 89.בשלב הבא, מטהרים את הרדיאו-אימונו-קונג'וגט באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography). השלב הסופי הוא ביצוע בדיקת טומוגרפיה פוזיטרונית (PET imaging) בבעלי חיים קטנים, במודל עכבר של סרטן. לבסוף, נעשה שימוש ב-PET imaging כדי להשיג תמונות של ההפצה in vivo של הרדיאו-אימונו-קונג'וגט המסומן ב-zirconium 89.בדרך כלל, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו עשויים להתקשות, מכיוון שכוון ה-pH של תמיסת zirconium 89 oxalate עלולה להיות מעט מורכבת. אדגים הליך זה יחד עם דליה עבדי, טכנאית במעבדה שלנו. ראשית, הכינו תמיסה בריכוז 2 עד 5 mg/mL של J 5 91 ב-1 mL של HEPs buffer 0.5 M בתוך פרועת מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 mL; המססו D-F-O-N-C-S ב-DMSO יבש בריכוז שבין 5 ל-10 mM, ובצעו סוניקציה וערבוב במערבל Vortex באופן יסודי כדי להבטיח המסה מלאה.בשלב הבא, התאימו את ה-pH של תמיסת J 5 9 1 ל-8.8 עד 9 על ידי הוספה של מנות קטנות של נתרבן קרבונט 0.1 molar. לאחר שתמיסת הנוגדן תגיע ל-pH הנכון, הוסיפו נפח של תמיסת D-F-O-N-C-S המקביל לעודף מולרי של פי שלושה עד ארבעה

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

סרטון זה מתאר את הטכניקה של רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש או PRIT, שבה חיסונים מצומדים ואחריו רדיוליגנדים ניתנים לטיפול בגידולים. רדיואימונותרפיה זו מפחיתה את מנות הקרינה לרקמות בריאות ומשתמשת ברדיונוקלידים בעלי זמן מחצית חיים נמוך מאוד שאינם תואמים לווקטורים מבוססי נוגדנים.

רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש: שיטה להעברה ממוקדת של רדיונוקלידים טיפוליים לגידולים

סרטון זה מדגים טכניקה המערבת רדיואימונוקונצ'וגייט להדמיית in vivo של גידול במודל עכבר. עם הזרקת הרדיואימונוקונצימוד, הנוגדנים של המצומד נקשרים לאנטיגן קרום ספציפי על התאים הסרטניים. הרדיוטרייסר של המצומד פולט פוזיטרונים המקיימים אינטראקציה עם אלקטרונים שכנים כדי לייצר אנרגיה, אשר מזוהה על ידי סורק טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) כדי ליצור תמונה של הגידול.

טכניקת הדמיה In Vivo PET לגילוי גידולים במודל מורין באמצעות נוגדנים בעלי תווית רדיו

הביקוש לאלקטרונים הפוכים ביואורתוגונליים Diels-Alder נרתמה ליצירת אסטרטגיית הדמיית PET יעילה ומודולרית לסרטן. בפרוטוקול זה, השלבים של מתודולוגיה זו מתוארים בהקשר של מערכת מודל המשתמשת בנוגדנים ממוקדים לסרטן המעי הגס huA33 ורדיוליגנד 64Cu.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

נוהל מפורט לסינתזה של אזיד 125 I-שכותרתו ואת radiolabeling של dibenzocyclooctyne (DBCO) -group מצומדות, 13 ננומטר בגודל ננו-חלקיקי זהב באמצעות תגובת לחץ ללא נחושת מתואר.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש<sup&gt; 125</sup&gt; שכותרתו לי אזיד תותבת קבוצה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיוג רדיו ובדיקות in vivo של נגזרות כלאט-טטרזין תלת-שיניים 99mTc(I) לכימיה מוקדמת וביו-אורתוגונלית.

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

פפטידים ויראלי-derived מצמידים נוגדן-conjugates (ACs) היא גישה צובר תאוצה בשל הפוטנציאל להעברת מטענים מולקולרית עם הצטברות תאי הגידול מוגברת. ניצול שיטות נפוצות כדי להעריך את ההטיה פפטיד, AC הצטברות תאיים המטען ואת הגידול מיקוד, פרוטוקול זה מסייע החוקרים במהלך שלבי הפיתוח מפתח.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה של אפיון טרנס- cyclooctene (TCO)-שונה נוגדן, radioligand tetrazine התווית על-ידי Lu (ט ז) 177עבור pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). בנוסף, זה מפרט את השימוש אלה בונה שני עבור ויוו biodistribution ומחקרים טיפול האורך במודל מאתר של סרטן המעי הגס.

Radioimmunotherapy pretargeted התגובה תגובת דילס-אלדר דרישה אלקטרון הופכי

ב פרוטוקול זה, נתאר את הסינתזה של התרמילים, phenyoxadiazolyl מתיל מבוססי sulfone ריאגנט של הקובץ המצורף באתר סלקטיבית של מטענים תיולים של מולקולות, במיוחד נוגדנים. בנוסף, נתאר את סינתזה ואפיון של chelator bifunctional של תרמילי מניבי, ההטיה שלה נוגדן מודל.

סינתזה, Bioconjugation של תיול-תגובתי ריאגנטים עבור הקמת האתר באופן סלקטיבי שונה Immunoconjugates

כאן מתוארת שיטה לקביעת הזיקה המחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים. KD הוא קבוע דיסוציאציית שיווי המשקל שניתן לקבוע מניסוי קשירת רוויה על ידי מדידת הקשירה הכוללת, הספציפית והלא ספציפית של נוגדן בעל תווית רדיו בריכוזים שונים לאנטיגן שלו.

קביעת זיקה מחייבת (KD) של נוגדנים בעלי תווית רדיו לאנטיגנים משותקים

מוצג כאן פרוטוקול לתאי רדיולייבל עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) רדיואיזוטופ, 89 Zr (t1/2 78.4 h), באמצעות סינתון רדיו-תיוג מוכן לשימוש, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). תיוג רדיו של תאים עם [89Zr]Zr-DBN מאפשר מעקב לא פולשני והדמיה של תאים רדיו-מסומנים בגוף עם PET עד 7 ימים לאחר מתן התרופה.

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים הדמיה של סחר בתאים: שיטה של תיוג רדיו תאים

עבודה זו מתארת ייצור אוטומטי של עד 1.7 GBq של [68Ga]Ga-FAPI-46 בסינתיסייזר iPHASE MultiSyn להדמיית PET של חלבון הפעלת פיברובלסטים.

רדיוסינתזה אוטומטית של [68Ga]Ga-FAPI-46 לשימוש קליני שגרתי

למד סינתזה של נוגדנים מסומנים בזירקוניום-89 באמצעות DFO לצילום PET בחיות מודל סרטן. הפרוטוקול מכיל ביוקונג'וגציה, רדיוסינתזה וטיהור כרומטוגרפי ליישומים אונקולוגיים.

Bioconjugation וRadiosynthesis של

גלה סרטונים נוספים