Name: הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: למד הדמיה שני פוטונים של דינמיקה תאית בחוט השדרה העכבר באמצעות הכנה ex vivo ותיוג פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אינטראקציות בזמן אמת בין תאי קדם עצביים לסיבים עצביים פגועים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 GM-41514 (ל-M.D.C.), R39 GM-048071 (ל-IP) ו-R01 NS-074987 (ל-T.E.L.) ופרס המחקר של המרכז השיתופי של האגודה הלאומית לטרשת נפוצה (NMSS) CA1058-A-8 (ל-C.M.W., T.E.L. ו-M.D.C.), NMSS Grant RG4925, מענק הכשרה של NIH T32-AI-060573 (ל-M.L.G.), מלגת פוסט-דוקטורט NMSS FG 1960-A-1 (ל-J.G.W.), ומימון מקרן ג'ורג' א. יואיט למחקר רפואי (M.P.M).

הצהרת אתיקה:: הערה הפרוטוקול לטיפול בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, אירווין, פרוטוקול # 2010-2943. 1. ההסרה של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבות נייר רטובה עם ~ 100% isoflurane הנוזלי, USP בהרדמת חסד תא ולמקם את מגבות נייר יבשות על גבי. מניחים את העכבר בתא על גבי מגבות נייר יבשות כל כך העכבר לא נוגע בisoflurane ולוודא קאמרי מכוסה. חכה לפחות דקה אחת לאחר הפסקת הנשימה על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חיתוך רוחב השדרה של הצוואר כדי להבטיח את העכבר הוא מורדמים. אל תבצע נקע בצוואר הרחם כמו זה יכול לגרום נזק לחוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס העכבר עם אתנול 70% להרטיב את השיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי פיין חדים כדי להסיר את השיער והעור מהחלק האחורי של העכבר כדי לחשוף את עמוד השדרה מכ צוואר רחם lamina 1 (C1) לlamina עצם העצה 4 (S4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל עם # 10 להב, לעשות חתכים בצד השמאל וימין של עמוד השדרה כדי להפריד אותו משריר והשומן. זה יגרום להסרת של חוט השדרה הרבה יותר קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: rongeurs Luer מעוקל יכול לשמש כדי לגרוף את בשר נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את החלק העליון של חוליות עמוד השדרה עם מלקחיים גרפו משוננים, הכנס מספריים Vannas טיטניום עקומים, עם הצד המעוגל למעלה לתוך עמוד השדרה נחשף בC1, נזהר שלא לגעת בחוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק מספריים Vannas מעוקלים טיטניום כל הדרך לנכונה ולעשות חתך קטן אחד. קול מחנק קטן צריך להישמע והרגיש כמו המספריים לחתוך את החוליות. חזור על זה לחתוך בצד השמאלי של הכבל. היזהר שלא ללכת מהר מדי או להפוך גדול מדי של קיצוץ כמו זה יהיה לסכן את נזק לכבל עם המספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lamina אחד אמור להיות מסוגל להיות הרים עם המלקחיים פעם ציד החוליות נחתכים. REPEAT שלב זה עבור כל lamina עד S4, ממשיך להחזיק ולמשוך בחזרה את חוליות עמוד השדרה. הערה: החוליות מעל אתר ההשתלה צפויה לבוא מפעם אחת שהוא כרת לאתר ההשתלה. המשך ההליך מתחיל ממש מתחת לאתר ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להניח את החוליות למטה כדי לראות היכן אתר ההשתלה הוא ומידה ולחתוך ~ 20 מ&quot;מ מקורי ואת הזנב לאתר ההשתלה. הערה: כאשר השתלת NPCs יותר לא יהיה צורך כNPCs המושתל בדרך כלל אינו נודד רחוק יותר מ- 15 מ&quot;מ. הסכום של חוט השדרה הדרוש יהיה תלוי במאפייני ניסוי והגירה של סוג התא המושתל. ביצוע חתכים מקורי ואת הזנב, כי הם במרחק שווה לאתר ההשתלה יאפשר אתר ההשתלה להיות ממוקמים בקלות רבה יותר במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל עם להב # 11 לחתוך בזהירות את הגרעינים מימין ומשמאל לצד הגחון של חוט השדרה מתחיל בסוף מקורי. w זהחולה לאפשר את חוט השדרה להסרה מחוליות הגחון בקלות רבה יותר. הערה: בוצע במהירות (שלבים 1.7-1.11), חוט השדרה לא תתייבש. עם זאת, 1x PBS יכול להינתן לחוט כדי לשמור אותו לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את העכבר והחזק את העכבר עד כה חוט השדרה פונה כלפי מטה. לקלף בזהירות את חוט השדרה באמצעות מלקחיים גרפו משוננים סגורים. בלי שסחב את חוט השדרה, לחתוך בזהירות כל הגרעינים שנותרו כדי לאפשר את חוט השדרה ליוסר בחתיכה אחת שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחוט השדרה הוא בRPMI-1640 ולמקם אותו על קרח להובלה למיקרוסקופ 2P. </li></ol> 2. הכנת חוט השדרה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטבעת חוט השדרה בagarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את חוט השדרה המבודד בRPMI-1640 מקוררים על קרח לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את agarose (טמפרטורת gelling נמוכה) ולהכין פתרון 5% ב 5 מיליליטר של 1x PBS. מיקרוגל פתרון agarose 5% למשך 15 שניות כדי לפזר את agהתעורר ולתת הפתרון מגניב עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חוט השדרה על ידי הצבתו על גיליון Parafilm עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet כ 5 מיליליטר של 5% פתרון agarose על צד הגחון של חוט השדרה. בואו agarose לבסס על ידי קירור לטמפרטורת חדר. מיצוק מלא לוקח כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בשכבה דקה של דבק רקמות ל-22 מ&quot;מ להחליק את מכסה מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את חוט השדרה המשובץ, הצבת צד הגחון על Parafilm. צד הגב עכשיו יהיה כלפי מעלה. לדבוק להחליק את המכסה בצד הגב, ולהטביע את הכנת agarose מוטבעת חוט / כיסוי השדרה להחליק בRMPI כדי לחזק את הדבק. להסיר עודפי הקרושה agarose באמצעות סכין גילוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת חוט השדרה על הבמה מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל וזלין לתחתית להחליק את המכסה. זה יתייצב ההכנה במהלך זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנת חוט השדרה בהדמיה גם על הבמה מיקרוסקופ עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה לכיוון מטרת טבילת 25x. גם ההדמיה שהותקן הוא כ 20 מ&quot;מ עמוק, ארוך 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ ורוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה תוך superfusing ההכנה עם התחמם (37 ° C), מחומצן (95: 5 חמצן: דו תחמוצת-פחמן carbogen) בינונית RPMI-1640 ללא סרום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת טרום חמה עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים ולחבר אותו למשאבת צינורות על ידי החדרת הצינור לתוך בקבוק התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומר על טמפרטורת התקשורת על 37 מעלות צלזיוס מכשיר חימום בחיבור של הצינור לתא. תקשורת Superfuse דרך גם בשעה 3 מיליליטר / דקה באמצעות צינורות מחוברים למשאבת צינורות (איור 1). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P הדמיה של חוט השדרה הגחון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות מחוט שדרת Thy1-EYFP באמצעות Ti Ultra Chameleon: ספיר לייזר מכוון 900 ננומטר. להחליש כוח הלייזר בדגימה ל&lt; 5% כדי להבטיח phototoxicity המינימלי 16. לשמור על טמפרטורה על ידי מרוסס-perfused חמצן RPMI-1640 בC 37 מעלות קבועות באמצעות תנור פתרון מוטבע אחת כדי להבטיח הדמיה יציבה, וכדי למנוע סחף רקמה ונזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפריד אות ניאון eGFP וEYFP, למקם dichroic 520 ננומטר חד-קצה ומפצל קרן dichroic 560 ננומטר חד-קצה בסדרה להפריד 2P פליטה לשלושה ערוצים, בכוונה פיצול הפליטה הירוקה כדי לשפר את ראות. הערה: ערוץ אלה המכונה כחולים-ירוק (פליטה &lt;520 ננומטר), ירוק-צהוב (520-560 ננומטר), ואדום (פליטה&gt; 560 ננומטר). צינורות מכפיל לזהות נפלטו אור בכל ערוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי הדמיה איתור של עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעינית ומקור אור בשדה בהיר, להתמקד במטרה הטבילה בקצה הגחון של חוט השדרה כדי לקבוע נקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מקור אור הסביבה בטוחה כבוי וSWגירוד ל2P עירור על ידי פתיחת תריס הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זמין, בעת חיפוש רקמה לתחומי עניין, להשתמש בהגדרת רזולוציה נמוכה יותר, נפח גבוה יותר ללא זום דיגיטלי, וקצב סריקה גבוה יותר מאשר בעת רכישת תמונות סופיות. הגדרות טיפוסיות עם מערכת זו בעת חיפוש רקמה לאזור של עניין הן: רזולוציה: 256 פיקסלים; נפח: x = 600 מיקרומטר, y = 600 מיקרומטר, z = 0-300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לאקסונים EYFP ליד קצה הגחון של חוט השדרה. אות הרמונית שנייה מקולגן (כחול) תהיה בהיר בקצה רקמת חוט השדרה. אתר את האקסונים EYFP רק הגבו לאות ההרמונית השנייה מקולגן ואות EYFP היא דמיינה בערוץ הירוק-צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את אתר ההשתלה במרכז האורך של הכנת חוט השדרה 14. לעכברי יום 1 לאחר השתלת eGFP-NPC, לאתר את אתר ההשתלה, תוך התמקדות נתיב הקרן במישור z העמוקה לתוך הרקמה. Wi אתר ההשתלהll להשתנות מעט בין בעלי החיים, אבל בדרך כלל ממוקם ~ 200 מיקרומטר מקצה הגחון. שים לב לאשכולות של eGFP-NPCs בשטחי חומר הלבנים, קרוב יותר לקצות הגחון ורוחב בעכברים לאחר יום 1 לאחר השתלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונות סופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש רזולוציית תמונה של 512 פיקסלים; נפח: x = 270 מיקרומטר, y = 212 מיקרומטר, וz = 100 מיקרומטר Slidebook תוכנה באמצעות 6. לקמפל Z- ערימות על ידי רכישת מטוסי מוקד רציפים במרווחים של 2.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקה דו-כיווני עם שרג הראוי לקזז כדי להבטיח כימות מהיר של כל חפצים נודדים בחוט השדרה. ודא שמסגרת שיעור הרכישה האידיאלית כדי לקבוע מהירות הסלולר בתוך חוט השדרה הוא כ 1 מסגרת / sec. ניתן לשנות את הגדרות הדמיה להעדפות של משתמשים שונים, כגון קצב רכישת מסגרת, רזולוציה הדמיה וכרכי הדמיה: הערה. כרכי הדמיה גדולים יהיו בדרך כלל לוקחים זמן רב יותר כדי לרכוש בGIVהרזולוציה en. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח, יבול, קבצי תמונת Slidebook חלק, וpseudocolor עם תוכנת ניתוח תמונה כגון Bitplane Imaris 7.7. להפיק קטעי וידאו הזמן לשגות סופי על ידי סירוק כרכי הדמיה ברציפות באמצעות תהליך אוטומטי בSlidebook וImaris. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+model+of+MS%3A+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li>
<li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis%3A+the+role+of+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li>
<li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li>
<li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li>
<li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li>
<li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35(2013).</li>
<li>Coyle, P. K. Ch. 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoyle%2C+PK+%22Clinical+Neuroimmunology%3A+Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22">Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders</a>. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).</li>
<li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1%2C+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li>
<li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CXCL12+%28SDF-1alpha%29+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%3A+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834(2011).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca%282%2B%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826(2013).</li>
<li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22(2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033(2013).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים.

בזמן אמת 2P הדמיה של רקמות שלמות נדרשת לחקור קינטיקה NPC ואינטראקציות לאחר השתלה לתוך חוט השדרה עכבר demyelinated. ההדמיה Intravital 2P משמשת בדרך כלל כדי לקבוע דינמיקה סלולרית בצד הגבי של חוט השדרה בעכברים חיים, ונעשתה בו שימוש כדי ללמוד demyelination הגב בdemyelinating המחלה 17-19. עם זאת, מכיוון שNPCs המושתל להגר לחומר לבן הגחון, שנמצא עמוק מדי לתמונה באתר באמצעות 2P מיקרוסקופיה, הכנת vivo לשעבר היא הכרחית. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לקבוע את ...

מודלים עכבר של demyelination, כוללים Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE) וזיהום תוך-גולגולתי עם וירוס צהבת עכבר neuroadapted (MHV), הם כלים מצוינים ללמוד מסלולים מולקולריים ואינטראקציות הסלולר הקשורים במחלה. הם הובילו ולתמכו ביעילות של ה- FDA אישרה טיפולי תרופות, בעיקר מיקוד הפסקת אוטואימוניות ודלקת 1. עם זאת, ברגע שחידוש יצירת המיאלין אנדוגני נכשל, הטיפולים שאושרו כרגע לא ביעילות לתקן נגעי demyelinated במערכת העצבים המרכזית. לכן, טיפולים ממוקדי תיקון בשלב זה של מחלה הם קריטיים להקלת סימפטומים כרוניים ושיפור איכות החיים. לאחרונה, תאים עצביים מבשר (NPCs) הגיעו לחזית ככלים טיפוליים משובי פוטנציאל להתמקד באזורים של דלקת ופגיעה במיאלין. מספר מחקרים הדגישו את היכולת של NPCs כדי לגרום endogenoשלנו חידוש יצירת המיאלין ולהשתתף באופן ישיר בחידוש יצירת המיאלין 2-8. בגלל NPCs מעורב בחידוש יצירת המיאלין ישיר, זה הכרחי כדי להבין קינטיקה ויחסי הגומלין שלהם עם תאי אנדוגני לאחר השתלה. לאחר השתלה, NPCs להעביר ventrally לאזורי נזק בחומר לבן, אז rostrally וcaudally ביחס לאתר ההשתלה 5,9. קינטיקה של הגירה שונה בתגובה לרמזים סביבתיים; יש NPCs הושתלו בעמוד השדרה פגוע שאינן מהירויות גדולות יותר מNPCs הושתלו בעמוד השדרה ניזוק 6. לאחר תקופה נודדת, הועבר NPCs להתרבות בהרחבה, בשיעור גבוה יותר בהשוואת חוט השדרה פגועה לחוט השדרה שלם 6. לבסוף, רוב NPCs להתמיין oligodendrocytes וליזום 4,6,9 חידוש יצירת המיאלין ישיר. נגע demyelinated הוא מורכב ויכול לכלול אוכלוסייה מגוונת של תאים בשלבים שונים שלctivation. לדוגמא, נגע פעיל בטרשת הנפוצה (MS) עשוי לכלול אוכלוסייה משמעותית של תאים מופעלים T, מיקרוגליה M1 ומקרופאגים M1, אבל נגע MS שקט כרוני יכול להיות מורכב בעיקר של האסטרוציטים תגובה עם כמה תאים דלקתיים 10-13. בגלל המגוון של תאי מפעיל, הדמיה שני פוטונים (2P) במודלים של עכברים של demyelination היא כלי מאוד שימושי שיעזור להבין אינטראקציות הסלולר מקומיות בנגע. בטרשת נפוצה ומודלי מחקר MS שימוש נרחב רבים, רוב הנגעים נמצאים בצד הגחון של חוט השדרה, באזור שאינו נגיש להדמית 2P intravital בשל עומק נגע ותוכן שומנים הגבוה של חוט השדרה. כדי לעקוף בעיות אלה ואינטראקציות תא-תא מחקר בנגעים לאורך חוט השדרה הגחון פיתחנו לשעבר הכנת ההדמיה vivo 2P 6 פשוט. מחקר זה עוקב אחר פרסום שיטות קודם, אשר הראההליך השתלת חלבון משופר ירוק ניאון (eGFP) NPCs -expressing לחוט השדרה של עכברים הבאים מתח JHMV של demyelination המושרה MHV 14. עכברים בן חמישה בשבוע שנגועים בJHMV ומושתל עם eGFP-NPCs ברמת בית החזה 9 ביום 14 לאחר פגיעה. הפרוטוקול המובא כאן מספק את צעדים מפורטים כיצד לחלץ את חוט השדרה, לעשות הכנת vivo לשעבר agarose, ואינטראקציות eGFP-NPC תמונה מושתלת עם חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) האקסונים -expressing. עכברים להביע EYFP תחת אמרגן Thy1 העצבי ספציפית שמשו בהליך זה 15. רק חלק מהאקסונים להביע EYFP, מה שהופך אותו לשימושי הדמיה אקסונים בודדים. כאן אנו מראים מיתרי השדרה הוסרו בשעה 7 ימים לאחר השתלה; עם זאת, ניתן לחלץ מיתרי השדרה בכל נקודת זמן לאחר השתלה. אמנם אנו מציגים אינטראקציות של NPCs עם אקסונים פגועים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש בשילוב עם סמני ניאון גנטייםשל סוגי תאים אחרים כדי לחקור מספר רב של אינטראקציות הסלולר מתרחשות ברחבי חוט השדרה העכבר.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל חד #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarose, טמפרטורת ג'ל נמוכה</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (דבק רקמות)</td> <td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 מ"מ כיסוי מרובע להחליק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X מטרת טבילה, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>מחמם פתרון מוטבע יחיד</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 ננומטר מפצל קרן דיכרואי חד קצה</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 ננומטר מפצל קרן דיכרואי חד קצה</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מכפיל פוטו</td><td>Brightline Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C / L משאבת צינורות במהירות משתנה</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>מדחום דיגיטלי</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>זיקית אולטרה Ti: לייזר ספיר&nbsp;</td><td>קוהרנטי</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 תוכנה</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 תוכנה</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה שני פוטונים של dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

מיקרוסקופיה של שני פוטונים (2P) משמשת לחשיפת דינמיקה ואינטראקציות תאיות עמוק בתוך רקמות חיות ושלמות. כאן, אנו מציגים שיטה להדמיית תאים חיים בחוט השדרה של העכבר. טכניקה זו מתאימה באופן ייחודי לניתוח דינמיקה של תאי מבשר עצביים (NPC) לאחר השתלה בחוט השדרה העוברים הפרעות דמיאלינציה נוירו-דלקתיות. NPCs נודדים לאתרים של נזק אקסונלי, מתרבים, מתמיינים לאוליגודנדרוציטים ומשתתפים ברמיאלינציה ישירה. NPCs הם אפוא טיפול טיפולי מבטיח לשיפור מחלות דמיאלינטיות כרוניות. מכיוון ש-NPCs מושתלים נודדים לאזורים הפגועים בצד הגחון של חוט השדרה, הדמיית 2P תוך-חיונית מסורתית היא בלתי אפשרית, ורק מידע על אינטראקציות סטטיות היה זמין בעבר באמצעות גישות צביעה היסטוכימיות. למרות ששיטה זו נוצרה כדי לדמות NPCs מושתלים בחוט השדרה הגחוני, ניתן ליישם אותה במחקרים רבים של תאים מושתלים ואנדוגניים בכל חוט השדרה. במאמר זה, אנו מדגימים את ההכנה וההדמיה של חוט שדרה עם אקסונים מבטאים חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר ו-NPCs מושתלים משופרים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק.

<html> בעוד פרוטוקול ההדמיה חוט השדרה explanted יכול לשמש כדי לחזות כל הקרינה בתוך חוט השדרה, תוצאות הנציג שלנו להפגין אינטראקציות eGFP-NPC עם EYFP-האקסונים. ראשית, אנו מציגים את ההכנה המוטבעת הגחון בחוט השדרה באיור 1 א. בשלב הבא, אנו מציגים את תוכנית ההתקנה של 2P מיקרוסקופ ורכיבי מפתח באיור 1. איור 2 מדגים הקרינה eGFP וEYFP בz-ערימה אחת בתוך חוט השדרה הגחון. רכישת Z- ערימות רצופות ניתן להדר בהפקת סרטי זמן לשגות לנתח דינמיקה סלולרית בזמן אמת בתוך ה...

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לדמות בזמן אמת תגשויות של תאי אב עצביים (NPC) מושתלים המסומנים פלואורסצנטית עם אקסונים פלואורסצנטיים בחוט השדרה של עכבר. הדבר מושג על ידי הוצאה וקיבוע זהירים של חוט השדרה מעכברים שהושתלו בהם NPCs לתוך 5%aros והצמדתו לזכוכית כיסוי. ניתן לשנות את התמצאותו של חוט השדרה כדי לצפות בפלואורסצנציה בכל אזור של חוט השדרה.בשלב השני, דגימת חוט השדרה מונחת על במת הדמיית דו-פוטון לצורך הדמיה של NPC שרידות, תוך כדי פרפוז עם מצע RPMI מחומם ומחומצן למשך עד 10 שעות. נעשה שימוש במפריד קרניים (beam splitter) בעל קצה בודד מתאים כדי להפריד בין פליטות ה-YFP וה-GFP. בסופו של דבר, הדמיית דו-פוטון מאפשרת ויזואליזציה של האינטראקציות בין ה-NPC המבטאים GFP לבין האקסונים המבטאים YFP בחוט השדרה הפגוע בזמן אמת.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-דגנרציה, כגון מהם הרמזים של סיגנללינג מולקולרי ותאי הנחוצים לדה-מיאלינציה של אקסונים פגועים על ידי NPC מושתלים, ומהי הקינטיקה של אירועי רמיאלינציה אלו? היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימות דו-פוטוני אינטרה-טידלי, שניתן להשתמש בהו רק לדימות של חבל השדרה הגבי (dorsal), הוא ששיטה זו מאפשרת דימות של NPC מושתלים שנדדו לעומק האזור הבטני (ventral) של חבל השדרה. לאחר אישור ההמתה באמצעות חיתוך של חבל השדרה (spinal transection), הרטיבו את העכבר ב-70% ethanol, ולאחר מכן השתמשו במספריים עדינים וחדים כדי להסיר את הפרווה והעור מגב בעל החיים, כך שחוליית השדרה תהיה חשופה בקירוב מהלמינה הצווארית הראשונה או C one ועד הלמינה הסקרלית הרביעית או S four.בשלב הבא, באמצעות סקלפל עם להב מספר 10, בצעו חתכים משמאל ומימין לעמוד השדרה כדי להפריד אותו מרקמת השריר והשומן שמסביבו; כמו כן, הסירו רקמה עודפת סביב ועל גבי עמוד השדרה. פעולה זו תאפשר הסרה קלה יותר של החוליות. לאחר מכן, תוך כדי החזקת החלק העליון של חוליות השדרה באמצעות פינצטה אפורה משוננת, הכניסו מספרי ואן (van) מעוקלים מטיטניום, כאשר הצד המעוקל פונה כלפי מעלה, אל עמוד השדרה החשוף בגובה C1, תוך הקפדה שלא לגעת בחוט השדרה.הגלישו את המספריים עד קצה מימין ובצעו חתך קטן אחד. צליל פצפוץ קטן אמור להישמע ולהורגש בעת שהמספריים חותכות את החוליות. חזרו על חתך זה בצד השמאלי הרחוק של הש Rückenmark (חוט השדרה), תוך הקפדה לא לעבוד במהירות רבה מדי ולא לבצע חתך גדול מדי, שכן הדבר עלול לסכן את שלמות החוט השדרה.לאחר חיתוך דפנות החוליות, ניתן יהיה להרים את הלמינה הבודדת באמצעות הפינצטה. חזרו על החיתוכים השמאלי והימני עבור כל למינה עד להגעה ל-S four. המשיכו להחזיק ולמשוך לאחור את חוליות השרה השדרה.החוליות שמעל לאתר השבייה עשויות להסיר לאחר חיתוך עמוד השדרה עד לאתר השבייה. לאחר חיתוך החוליות עד ל-S4, השכיבו את החוליות כדי לסייע בוויזואליזציה של מיקום אתר השבייה, וחתכו כ-20 millimeters במיקום rostral ו-caudal לאתר השבייה. כעת השתמשו בסכין מנתחים עם להב מספר 11 כדי לחתוך בזהירות את הגנגליונים בצד ימין ובשמאל של הצד הוונטרלי של חוט השדרה, החל מהקצה ה-rostral.לאחר מכן, הפו והחזיקו את החיה כך שחוט השדרה פונה כלפי מטה, והשתמשו בפינצטה משוננת סגורה כדי לקלף בזהירות את חוט השדרה מהקצה הזנבי. לאחר מכן, ללא גריעה של חוט השדרה, חתכו בזהירות את כל הגנגליונים שנותרו כדי לאפשר להוציא את חוט השדרה כיחידה אחת שלמה, והניחו את חוט השדרה בתוך מדיום על קרח כדי להכינו להדמיה. העבירו את רקמת העצב למצע פאראפילם כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, העבירו בפיפטה כ-5 milliliters של תמיסת 5% agarose שהוכנה לאחרונה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius על השפיכה, והניחו לה להתמצק בטמפרטורה של החדר. לאחר כחמש דקות, מרחו שכבה דקה של דבק לרקמות על זכוכית כיסוי ריבועית בגודל 22 millimeter, והפכו את השפיכה המוטמעת כך שהצד הוונטרלי יפנה כלפי מטה אל פיסת perfil חדשה. הדביקו את זכוכית הכיסוי לצד הדורסלי החשוף ושקעו את כל הדגימה במדיום רענן כדי להקשيح את הדבק.לאחר מכן, השתמשו בלהב תער כדי להסיר את עודפי האגר שהתגבשו. כעת, הכניסו את הפיתול המחובר למשאבת הפיתולים לבקבוק מדיום, שנשמר באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C. הזרים מדיום מחומם דרך באר דימוג שנבנתה באופן מותאם על משבט המיקרוסקופ בקצב של 3 mL לדקה.לאחר מכן, מקם את דגימת חבל השדרה בתוך הבאר כאשר הצד הוונטרלי פונה כלפי מעלה לעבר עדשת הטבילה בעוצמה של 25x. כדי לדגם את חבל השדרה הוונטרלי באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים, השתמש בלייזר ספיר טיטניום-אולטרה המכוון ל-900 nanometers, כאשר הספק הלייזר המגיע לדגימה מוחלש לפחות מ-5% כדי להבטיח פוטוטוקסיות מינימלית. לאחר מכן, באמצעות העינית ומקור אור לשדה בהיר, התמק במיקוד של עדשת הטבילה על הקצה הוונטרלי של חבל השדרה.כדי לקבוע נקודת ייחוס, ודא שמקור האור הסביבתי כבוי. לאחר מכן פתח את תריס הלייזר כדי להחליף בין שני הציטוטים הפוטוניים אם הם זמינים. בעת חיפוש אזורי עניין ברקמה, השתמש בהגדרת רזולוציה נמוכה יותר, בנפח גבוה יותר ללא זום דיגיטלי ובקצב סריקה גבוה יותר מאשר בעת רכישת התמונות הסופיות.כדי למצוא את התאים, מומלץ להתמקד בדגימה תחת תאורת שדה בהיר (bright field) בקצה הרקמה, תחילה באתר השבייה, ולאחר מכן לעבור לפלואורסצנציה. ניתן להשתמש בשדה X ו-Y רחב ברזולוציה נמוכה כדי לאפשר סריקה מהירה של שטח גדול בזמן שהמיקוד נע עמוק יותר לתוך הרקמה. התבוננו באקסונים של EYFP סמוך לקצה הוונטרלי של חוט השדרה.אות ההרמוני השני מהקולגן, הנצפה כאן בכחול, יהיה בעוצמתו המרבית בקצה רקמת חוט השדרה. כעת, השתמש בתוכנת לכידת התמונות המתאימה כדי לרכוש את תמונות הרזולוציה הגבוהה הסופיות במישורי מוקד עוקבים במרווחים של 2.5 micron כדי להרכיב Z stacks. בייצוג זה, NPCs המבטאים GFP נצפים בכחול ואקסונים פגועים המבטאים YFP נצפים בצהוב; צביעה פסאודו-כרומטית תבוצע מאוחר יותר באמצעות תוכנת עריכה. לאחר מכן, בצע סריקה דו-כיוונית עם היסט interlating מתאים כדי להבטיח כימות מהיר של אובייקטים נודדים בחוט השדרה, תוך וידוא שקצב לכידת הפריים האידיאלי לקביעת המהירות התאית בתוך חוט השדרה מוגדר לכ-1.7 frames per second.לבסוף, נגזרו, החליקו וצבעו בצבעי פסאודו (pseudo color) את קבצי התמונה באמצעות התוכנה המתאימה, והשתמשו בתהליכים אוטומטיים לסריקת נפחי הדמיות עוקבים לצורך הפקת סרטוני Time lapse סופיים. בעוד שפרוטוקול הדמיה זה של חוט שדרה מושתל יכול לשמש להדמיית פלואורסצנציה כלשהי בתוך חוט השדרה, תמונות אלו מדגימות אינטראקציות מייצגות של תאי מקור עצביים המבטאים EGFP עם אקסונים המבטאים EYFP ב-Z stack בודד בתוך החלק הוונטרלי של חוט השדרה. ניתן לאסוף Zacks עוקבים ולאחריהם להרכיבם כדי להפיק סרטוני Time lapse לניתוח הדינמיקה התאית בזמן אמת בתוך הרקמה השלמה.למעשה, שימוש במפריד קרני דיכרואי בעל קצה בודד של 520 ננומטר ובמפריד קרני דיכרואי בעל קצה בודד של 560 ננומטר יכול להפריד בין אותות ה-EGFP וה-EYFP, ובכך לאפשר צביעה פסאודו-כרומטית של הערוצים הבודדים בירוק ובצהוב באמצעות תוכנת הדימיג' כפי שהודגם כאן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח את הסרתו הנכונה של חוט השדרה מהעכבר, ללא מתיחה מוגברת, דחיסה או חיתוך מקרי של רקמת העצב. באמצעות פרוצדורה זו, ניתן לדימג' כל שילוב של תאים או אקסונים המסומנים פלואורסצנטית בזמן אמת כדי לענות על שאלות נוספות, כולל מהי קינטיקת ההגירה או הרמיאלינציה תחת טיפולים תרופתיים או תנאים שונים.

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול פולשנית כדי לייצב את עמוד השדרה העכבר ולבצע...

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

בסרטון הזה, אנו מתארים הליך להשתלת חדר הדמיה אופטי כרוני על חוט השדרה הגבי של עכבר חי. קאמרי, ההליך כירורגי, וההדמיה כרונית נבדקים והפגינו.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך In vivo הדמיה של כבל עכבר השדרה

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים כדי לחקור אינטראקציות בין סוגי תאים שונים בחוט השדרה בסביבת הרקמה הטבעית שלהם בחיה כימרית של מח עצם עם פגיעת ריסוק טראומטית של חוט השדרה בעמוד הגב.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

אנחנו מציגים של ויוו הדמיה השיטה באמצעות שני צבעי פלורסנט שונים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים בעמוד השדרה כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה contusive בחולדות ספראג-Dawley למבוגרים.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

פרוטוקול זה מתאר השרשה של חלון זכוכית אל חוט השדרה של העכבר כדי להקל על ההדמיה על ידי המיקרוסקופיה.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

למד הדמיה שני פוטונים של דינמיקה תאית בחוט השדרה העכבר באמצעות הכנה ex vivo ותיוג פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר אינטראקציות בזמן אמת בין תאי קדם עצביים לסיבים עצביים פגועים.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

גלה סרטונים נוספים