הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמות בזמן אמת אינטראקציות של תאים מושתלים, מבשר עצבי או NPC עם אקסונים פלואורסצנטיים בחוט השדרה של העכבר. זה מושג על ידי הסרה והטמעה בזהירות של חוט השדרה מעכברים שהושתלו ב-NPCs ל-5%aros והצמדתו לתלוש כיסוי. ניתן לשנות את כיוון חוט השדרה כדי לראות פלואורסצנטיות בכל אזור בחוט השדרה.

בשלב השני, הכנת חוט השדרה מונחת על שלב הדמיית שני הפוטונים להדמיה של NPCs ברי קיימא תוך היתוך סופר עם מדיה RPMI מחומצנת חמה למשך עד 10 שעות. מפצל קרן diic מתאים בקצה יחיד משמש להפרדת פליטות YFP ו-GFP. בסופו של דבר, הדמיית שני פוטונים מאפשרת הדמיה של האינטראקציות של ה-GFP המבטא NPCs עם ה-YFP המבטא אקסונים בחוט השדרה הפגוע בזמן אמת.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-גנרציה, כגון מהם רמזי האיתות המולקולריים והתאים הנחוצים לרמיאלינציה מושתלת של NPC של אקסונים פגומים, ומהי הקינטיקה של אירועי רמיאלינציה אלה? היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הדמיית שני פוטונים בין גאות ושפל, שניתן להשתמש בה רק להדמיית חוט השדרה הגבי, הוא ששיטה זו מאפשרת הדמיה של NPCs מושתלים שהיגרו עמוק בתוך אזור הגחון של חוט השדרה. לאחר אישור המתת חסד על ידי חתך עמוד השדרה, הרטיבו את העכבר באתנול 70%, ואז השתמשו במספריים עדינים וחדים כדי להסיר את השיער והעור מגב החיה, וחשפו את עמוד השדרה מלמינה צוואר הרחם אחת או C אחת בערך ללמינה העצה ארבע או S ארבע.

לאחר מכן, בעזרת אזמל עם להב מספר 10, בצע חתכים משמאל ומימין לעמוד השדרה כדי להפריד אותו מהשריר שמסביב ורקמת השומן גם חתכה רקמות עודפות סביב ומעל עמוד השדרה. זה יאפשר הסרה קלה יותר של החוליות. לאחר מכן, תוך כדי החזקת החלק העליון של חוליות עמוד השדרה עם מלקחיים אפורים משוננים, הכנס מספריים מעוקלים מטיטניום עם הצד המעוקל כלפי מעלה לעמוד השדרה החשוף ב-C one, תוך הקפדה לא לגעת בחוט השדרה.

החלק את המספריים עד הסוף ימינה ובצע חתך אחד קטן. יש לשמוע ולהרגיש צליל מחץ קטן כאשר המספריים חותכים את החוליות. חזור על חיתוך זה בצד השמאלי הרחוק של הכבל, הקפד לא לעבוד מהר מדי או לבצע חתך גדול מדי, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בכבל.

לאחר חיתוך דפנות החוליות, ניתן יהיה להרים את הלמיני הבודד בעזרת המלקחיים. חזור על החיתוכים השמאלי והימני עבור כל למינה עד שמגיעים ל- S ארבע. המשך להחזיק ולמשוך לאחור את חוליות חוט השדרה.

החוליות מעל ההשתלה עלולות להתנתק ברגע שעמוד השדרה שלו נחתך לאתר ההשתלה. לאחר חיתוך החוליות ל-S ארבע, הניחו את החוליות למטה כדי לעזור לדמיין היכן נמצא אתר ההשתלה וחתכו כ-20 מילימטרים למקום ההשתלה. כעת השתמש באזמל עם להב מספר 11 כדי לחתוך בזהירות את הגרעינים מימין ומשמאל לצד הגחון של חוט השדרה, החל מהקצה הרוסטרלי.

לאחר מכן הפוך והחזק את החיה כך שחוט השדרה פונה כלפי מטה והשתמש במלקחיים משוננים סגורים כדי לקלף בזהירות את חוט השדרה מקצה הקיפוד. לאחר מכן, מבלי לחתוך את חוט השדרה, חתכו בזהירות את כל הגרעינים שנותרו כדי לאפשר להרים את חוט השדרה החוצה בחתיכה אחת שלמה, והניחו את החוט במדיום על קרח כדי להכין את חוט השדרה להדמיה. העבירו את רקמת העצבים ליריעת פרם כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן פיפטה כחמישה מיליליטר של תמיסת אגרו טרייה שהוכנה 37 מעלות צלזיוס, 5% תמיסת אגרו מעל הכבל, ותנו לה להתמצק בטמפרטורת החדר. לאחר כחמש דקות, מרחו שכבה קלה של דבק רקמות על החלקת כיסוי מרובעת של 22 מילימטר והפכו את הצד הגחוני של חוט השדרה המוטבע כלפי מטה על פיסת פרפיל חדשה. הדביקו את החלקת הכיסוי לצד הגב החשוף וטבלו את כל התכשיר במדיום טרי כדי למצק את הדבק.

לאחר מכן השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את ורד האגה המוצק העודף. לאחר מכן, הכנס את הצינור המחובר למשאבת הצינורות לבקבוק מדיה, השמור באמבט מים כדי למזג סופר 37 מעלות צלזיוס. מדיה די מחוממת באמצעות באר הדמיה שנבנתה בהתאמה אישית על במת המיקרוסקופ בשלושה מיליליטר לדקה.

לאחר מכן הנח את תכשיר חוט השדרה לבאר כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה לכיוון יעד הטבילה של 25 x. כדי לדמות את חוט השדרה הגחוני על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים, השתמש בלייזר ספיר אולטרה טיטניום המכוון ל-900 ננומטר כאשר עוצמת הלייזר מוחלשת בדגימה לפחות מ-5% כדי להבטיח פוטוטוקסיות מינימלית. לאחר מכן באמצעות העינית ומקור אור שדה בהיר ממקדים את מטרת הטבילה בקצה הגחון של חוט השדרה.

לקביעת נקודת התייחסות, ודאו שמקור האור הסביבתי כבוי. לאחר מכן פתח את תריס הלייזר כדי להחליף את שני הציטוטים הפוטוניים אם זמינים. בעת חיפוש הרקמה אחר תחומי עניין, השתמש בהגדרת רזולוציה נמוכה יותר, עוצמת קול גבוהה יותר ללא זום דיגיטלי וקצב סריקה גבוה יותר מאשר בעת רכישת התמונות הסופיות.

כדי למצוא את התאים, עדיף להתמקד בדגימה תחת תאורת שדה בהירה בקצה הרקמה, באתר ההשתלה תחילה, ולאחר מכן לעבור לפלואורסצנטיות. לאחר מכן ניתן להשתמש בשדה X ו-Y גדול ברזולוציה נמוכה כדי לאפשר צפייה מהירה של אזור גדול כאשר המיקוד נע עמוק יותר לתוך הרקמה. התבונן באקסוני EYFP ליד קצה הגחון של חוט השדרה.

האות ההרמוני השני מהקולגן שנצפה כאן בכחול יהיה הבהיר ביותר בקצה רקמת חוט השדרה. כעת, השתמש בתוכנת לכידת התמונות המתאימה כדי להשיג את התמונות הסופיות ברזולוציה גבוהה יותר במישורי מוקד עוקבים במרווחים של 2.5 מיקרון כדי להרכיב ערימות Z. בייצוג זה, NPCs GFP נצפים כאשר אקסוני YFP כחולים ופגומים נצפים כצביעה פסאודו צהובה ניתן לבצע מאוחר יותר באמצעות תוכנת עריכה ולאחר מכן לבצע סריקה דו-כיוונית עם היסט ההתאמה המתאים כדי להבטיח כימות מהיר של כל אובייקטים נודדים בחוט השדרה, מה שמבטיח שקצב הפריימים האידיאלי של הרכישה לקביעת המהירות התאית בתוך חוט השדרה מוגדר לכ-1.7 פריימים לשנייה.

לבסוף, נתח חיתוך, צבע חלק ופסאודו של קבצי התמונה עם התוכנה המתאימה, והשתמש בתהליכים האוטומטיים כדי לסרוק את נפחי ההדמיה הרצופים להפקת סרטוני ה-Time lapse הסופיים. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול הדמיה זה של חוט השדרה כדי לדמיין כל פלואורסצנטיות בתוך חוט השדרה, תמונות אלה מדגימות אינטראקציות מייצגות של תאי מבשר עצביים של EGFP עם אקסונים של EYFP בערימת Z אחת בתוך חוט השדרה הגחוני. לאחר מכן ניתן להרכיב את הרכישה של Zacks עוקבים כדי להפיק סרטוני זמן-lapse לניתוח הדינמיקה התאית בזמן אמת בתוך הרקמה השלמה.

ואכן, שימוש ב-520 ננומטר דיכרואי בקצה יחיד ובמפצל קרן דיכרואי בקצה יחיד של 560 ננומטר יכול להפריד בין אותות EGFP ו-EYFP, ולאפשר צביעה פסאודו של הערוצים הבודדים בירוק וצהוב עם תוכנת ההדמיה כפי שמודגם כאן, בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להבטיח הסרה נכונה של חוט השדרה מהעכבר ללא מתיחה מוגזמת, דחיסה, או חיתוך מקרי של רקמת העצבים. עם נוהל זה, ניתן לדמות כל שילוב של תאים או אקסונים עם תווית פלואורסצנטית בזמן אמת כדי לענות על שאלות נוספות, כולל מהי הקינטיקה של הגירה או רמיאלינציה תחת טיפולים תרופתיים או תנאים שונים.