הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים
20 באפריל 2016
העור הוא ביתה של רשת תאי חיסון מורכבת. אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר, מחלקים שונים בגוף החיה, על מנת לקבל תרחיף חד-תאי ולנתח את אוכלוסיות הלויקוציטים השונות השוכנות בעור על ידי זרימה ציטומטרית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין תרחיף תא בודד מעור העכבר כדי לזהות את האוכלוסיות השונות של תאי חיסון תושבים באמצעות ניתוח ציטופלואורימטרי. לזהות ולבודד את האוכלוסייה השונה של תאי חיסון שוכני העור. באמצעות טכניקה זו החוקרים יכולים לעכל בקלות את הדגימות מאזורים שונים בעור העכבר מבלי לפגוע ביצרני פני השטח של תאי החיסון המעניינים.
כדי להשיג דגימות עור מאוזן העכבר, חתכו את החלקים חסרי השיער של האוזניים והשתמשו במלקחיים כדי להפריד את הצד הגבי והגחוני של האיברים. לאחר מכן, גרדו בעדינות את האוזן הפנימית כדי להסיר את כל הסחוס שנותר. כדי להשיג דגימות עור נתחים, גלחו את כל השיער מהחיה בעזרת זוג קוצץ, ולאחר מכן מריחת קרם אפילציה.
לאחר מספר דקות נקו את הקרם ובצעו חתך אנכי באמצע גב העכבר והמשיכו את החתך לאורך גבולות האזורים המגולחים סביב גוף העכבר. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העור במקומו תוך הפרדת הדגימה עם הקצוות הסגורים והעגולים של זוג מספריים כירורגיים או אזמל, הפרד בעדינות את העור מהצפק ושרירי הגב. לאחר מכן טבלו את העור בצלחת תרבית תאים בגודל 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל PBS קר כקרח והשתמשו במלקחיים כדי לגרד את השומן התת עורי.
כדי לקבל דגימת עור זנב, חתכו את הזנב והשתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך אנכי החל מבסיס הזנב ועד לקצה. בעזרת מלקחיים, תפסו את קצה החתך בבסיס הזנב, ואז אחזו בגוף הזנב עם זוג מלקחיים נוסף, משכו בעדינות את העור לכיוון הקצה. הסר עודפי שומן על ידי גירוד עדין של דגימת העור.
כף הרגל של העכבר נחתכת, ולאחר מכן כדי לקבל דגימת עור מכרית כף הרגל, השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את עור כף הרגל לאורך מהקרסול ועד תחילת האצבעות, תוך הקפדה להימנע מחיתוך שיער כלשהו. לאחר מכן תפסו את עצמות הקרסול במלקחיים תוך כדי אחיזת העור בשנייה ומשכו את העור לכיוון האצבעות כמו בעת הסרת כפפה. כדי לסמן את תאי העור, עבור כל דגימה בתורו להעביר את הרקמה לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה 2 מיליליטר קוקטייל עיכול טרי שהוכן מראש.
בעזרת מספריים קוצצים את הדגימה לחתיכות קטנות ומדגרים את שברי הרקמה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות עם ניעור עדין אחד עד שניים במהלך תקופת הדגירה. לאחר מכן, שפכו את רקמת העור המעוכלת על מסננת תאים של 70 מיקרון בצלחת פטרי בגודל 66 מילימטר המכילה 1 מיליליטר RPMI 1640 בתוספת FBS למנה. שוטפים את המסננת בחמישה מיליליטר של מדיום טרי ואז השתמשו בבוכנת מזרק כדי לסחוט את הדגימות דרך רשת המסננת.
שוטפים את הבוכנה, הכלי והמסננת עם 20 מיליליטר מדיום טרי ומעבירים את תמיסת הרקמות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר שכל הדגימות עובדו, יש לצנטריפוגה של התאים ולהשעות מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר לדגימה של שני מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן חוסם CD16 CD32 ב-PBS בתוספת 1% FBS. לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס יש להוסיף 100 מיקרוליטר נוגדנים כפי שמצוין בטבלה לדגימות המתאימות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור.
בתום הדגירה יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של PBS בתוספת FBS ולהשעות מחדש את הכדורים ב-300 מיקרוליטר של FBS PBS. לאחר מכן סמן את התאים ב-2 מיקרוגרם למיליליטר DAPI למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור. כדי לבודד את הלויקוציטים, תחילה שער את האוכלוסייה החיובית ל-DAPI כדי לחסל את התאים המתים.
לאחר מכן בחר את הסינגלטים באזור פיזור קדימה על ידי תרשים רוחב פיזור קדימה ושער את התאים על סמך הגודל והגרעיניות של הלויקוציטים המעניינים. לאחר מכן, בחר את התאים החיוביים CD45, ולאחר מכן עבור כל דגימה זהה את אוכלוסיות התאים הדנדריטיים של העור לפי ביטוי CD11C ו-MHC Class II שלהם. זהה את המקרופאגים לפי ביטוי CD64 ו-F480 שלהם, את תאי B לפי ביטוי CD19 ו-MHC Class 2 ואת תאי ה-T לפי ביטוי CD4 או CD8.
הבידוד של תאי מערכת החיסון של העור כפי שהודגם זה עתה מניב אוכלוסייה של יותר מ-50% תאים ברי קיימא מכל אזורי העור, בין 5,000 ל-15,000 לסנטימטר רבוע מתוכם חיוביים ל-CD45. ניתן להשיג מספר מספיק של תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי B ותאי T גם לניתוח במורד הזרם מסנטימטר מרובע אחד של עור עכבר, כפי שצוין. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לעכל רקמת עור לא דלקתית ולבודד את הלויקוציטים לניתוח פקס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מתודולוגיה להכנת תרחיף של תאים בודדים מעור של עכבר לצורך ניתוח של אוכלוסיות תאי חיסון תושבים. הטכניקה מאפשרת עיכול של דגימות עור מאזורים שונים מבלי לפגוע במר커ים על פני השטח של תאי החיסון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ציטומטריה עם זרימה
רקע
- העור מכיל רשת מגוונת של תאי מערכת החיסון.
- הבנת אוכלוסיות תאים אלו היא קריטית לחקר החסינות של העור.
- ציטומטריית זרימה היא טכניקה מרכזית לניתוח אוכלוסיות תאים.
- הכנה יעילה של הדגימה חיונית לקבלת תוצאות מדויקות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לבידוד תאי מערכת החיסון מעור של עכבר.
- הקלה על זיהוי אוכלוסיות שונות של לוקוציטים.
- שיפור הניתוח של תגובות חיסוניות בעור.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות מאזורים שונים של עור עכבר.
- שימוש בפינצטה ובטכניקות גירוד להכנת הדגימה.
- מריחת תמיסת דה-פילציה להסרת שיער.
- ניתוח בציטומטריה של זרימה לזיהוי אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של תרחיפי תאים בודדים מעור של עכבר.
- זיהוי של אוכלוסיות נבדלות של תאי חיסון תושבים.
- שימור של סמני שטח במהלך תהליך העיכול.
- הבנה משופרת של הדינמיקה של תאי החיסון בעור.
מסקנות
- המתודולוגיה המתוארת יעילה לחקר חסינות העור.
- ציטומטריה של זרימה מספקת תובנות בעלות ערך לגבי אוכלוסיות של תאי חיסון.
- ניתן ליישם גישה זו בהקשרי מחקר שונים באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנה יעילה של תרחיפי תאים בודדים מאזורי עור שונים בעכבר מאפשרת פרופיל תאי חיסון ברמת דיוק גבוהה, החיונית לגילוי מוקדם ותיקוף מטרות במחקר דרמטולוגי ואימונולוגי. מתודולוגיה זו תומכת בסריקה פנוטיפית חסונה ובניתוח כמותי של אוכלוסיות לוקוציטים השוכנים בעור, ובכך מספקת מידע ישיר להפחתת סיכונים מכניסטיים ולהגברת הביטחון החזוי בנקודות מפתח בתהליך הפיתוח. בידוד תאים אמין ושימור סמנים מקלים על ביצוע מחקרים בקנה מידה ארגוני של תגובות חיסוניות לגירויים סביבתיים ומיקרוביאליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של ההטרוגניות של תאי מערכת החיסון באזורי עור שונים לצורך תיקוף של מטרה (target validation).
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שימור ביטוי של אנטיגנים על פני השטח במהלך בידוד התאים.
- מקל על הערכה כמותית של תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון לצורך ביטחון ניבוי בתוכניות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תרחיפי תאים בודדים סטנדרטיים המתאימים לזרימה ציטומטרית (flow cytometry) ולסריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מבטיח הדירות ויכולת הרחבה (scalability) בין אתרים אנטומיים שונים, ובכך תומך בתהליכי פיתוח של בדיקות (assays).
- מספק חיוניות תאים גבוהה ושלמות של סמנים, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות או סמנים ביולוגיים (biomarkers).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין פרופיל תאי מערכת החיסון לבין מודלים של עור הרלוונטיים למחלה, לצורך מחקרי סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- שומר על רצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניטור חיסוני עקבי.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על כימות חסון של תאי מערכת החיסון.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבידוד סטנדרטי של תאי מערכת החיסון לצורך אנליזה בציטומטריית זרימה מאזורים שונים של העור.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לניתוח מפורט של תתי-אוכלוסיות של תאי חיסון.
- סריקה: מספקת תרחיפי תאים בודדים המוכנים לבדיקה עם סממנים שטח שנשמרו, לצורך תהליכי עבודה של סריקה הניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות של אוכלוסיות לוקוציטים, התומכות בניתוחים השוואתיים בין תנאים ואזורים שונים.
- מחקר תרגומי: מקלה על ההלימה עם מודלים רלוונטיים למחלה ואסטרטגיות של סממנים ביולוגיים בעת חקר חסינות העור.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול סטנדרטי הניתן לשימוש חוזר וניתן להתאמה לאזורי עור שונים ולהקשרים ניסיוניים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ואת תיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לאפיון מדויק של תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי בידוד תאים וצביעה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות ניטור חיסוני חסון.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של תוכניות דרמטולוגיות ואימוןולוגיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציית רקמות, עיכול אנזימטי ואנליזת ציטומטריה של זרימה.
- נדרשת גישה למכשירי ציטומטריה של זרימה ולפאנלים מאושרים של נוגדנים לזיהוי תאי חיסון.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של עיבוד הדגימות ואסטרטגיות הגייטינג (gating).
- ניתן להתאמה לאזורי עור שונים בעכברים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור רקמות דלקתיות או חולות.
- תנובת התאים והחיוניות עשויות להשתנות בהתאם לאתר האנטומי ויש לקבען באופן אמפירי.
