Name: הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למדו הכנת תא בודד מעור עכבר לניתוח ציטופלואורימטרי של אוכלוסיות תאי חיסון שוכני עור. שיטה זו מאפשרת בידוד תאים ללא פגיעה בסמנים פנימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 ו-NANOVAC) ו-Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

אישור לימוד: פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (רומא, איטליה) על פי Decreto legislativo 27 gennaio 1992, n. 116 &quot;Attuazione דלה Direttiva n. 86/609 / CEE ב מאטריה di protezione degli animali utilizzati פיני sperimentali o המודעה אלטרי פיני scientifici.&quot; 1. קבלת דגימות עור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אֹזֶן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלק ללא שיער של האוזניים של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגב נפרד בצד הגחון על ידי משיכת אותם לגזרים עם מלקחיים. הסר את כל סחוסים הנותרים על ידי גירוד החלק הפנימי בעדינות של אוזניים עם מלקחיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור Trunk: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את העור כולו של החיה שניהם עם סכין גילוח חשמלי ועם קרם מקריח עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את מדגם העור הרצוי (מ -2 סנטימטרים 2 עד עורות בעלי החיים השלמים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניתוק הגב כולו venעור עכבר tral, לעשות חתך אנכי באמצע העכבר בחזרה ואז לחתוך לאורך גבולות האזורים המגולחים סביב גוף העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את העור מפני הצפק ושרירי גב, לשמירת דגימת העור עדיין עם המלקחיים תוך הפרדה בין מדגם העור בקצות הטו הסגורות של מספרי כירורגיות או אזמל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת תרבית תאים 100 מ&quot;מ המכיל 10 מ&quot;ל של PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל שומן תת עורי על ידי השריית מדגם העור ב- PBS בצלחת מוכן בשלב 1.3.3 וקרצוף מדגם העור עם מלקחיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זָנָב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הזנב של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך אנכי על הזנב עם מספריים כירורגיות או אזמל כירורגי, החל מבסיס הזנב ולהגיע אל קצה הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לנתק את העור מהזנב. תפוס את הקצה לחתוך בבסיס הזנב בעדינות למשוך לכיוון הקצה תוך כדי לחיצה עלגוף של הזנב עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל עודפי שומן על ידי גירוד מדגם העור בעדינות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שׁוֹדֵד דְרָכִים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרגל העכבר כולו עם מספריים כירורגיות. הימנעות חיתוך כל עור שעיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור של כף הרגל longitudinally מן הקרסול לתחילת הספרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את עצמות קרסול עם מלקחיים או ביד בעת גרירת העור עם מלקחיים למשוך את העור כלפי הספרות כאילו הוא ממריא כפפה. </li></ol></li></ol> עיכול 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קוקטייל עיכול מפתרון המניות (שהוכן כמו רשימת חומרים) עם המתכון הבא: תערובת אנזימים (ראה רשימת חומרים עבור מפרטים) 300 מ&quot;ל / מיקרוגרם, DNAse1 50 U / ml. לדלל ב FBS 5% RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים דגימות עור עם מספריים לחתיכות קטנות לתוך צלחת פטרי 35 מ&quot;מ עם 2 מ&quot;ל של קוקטייל עיכול (לעור המטען: 2 מ&quot;ל של קוקטייל עיכול כל 2 ס&quot;מ 2 של העור, עד 3 מ&quot;ל סה&quot;כ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. נער בעדינות את צלחת פטרי 1-2 פעמים במהלך הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים דגימות עור מתעכל על מסננת 70 מיקרומטר תא 66 צלחת מ&quot;מ פטרי המכילה 1 מ&quot;ל של RPMI1640 FBS 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסננת עם 5 מ&quot;ל של RPMI 1640 5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוחט את המדגם דרך מסננת התא עם בוכנה במזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבוכנה סומק, צלחת פטרי מסננת עם 20 מ&quot;ל של RPMI1640 FBS 5%, להעביר לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. </li></ol> 3. נוגדנים תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את ההשעיה השיג פעמיים עם 5 מ&quot;ל של 1% PBS FBS (או BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל השעית התא שהושגה עם הנוגדנים הרצויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות 100 μl / מדגם של תערובת המכילה מ&quot;ל 2 מיקרוגרם / של aCD16 / CD32 (שיבוט 2.4G2) מדולל FBS 1% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C על מנת לחסום את הלא ספציפי המחייב של הנוגדנים הרצויים באמצעות קולטני Fc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הנוגדנים מצוינים בטבלה1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת דילול נוגדנים הרצוי 100 μl / מדגם של FBS 1% PBS בריכוז של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של תמהיל מוכן בשלב 3.2.3.1 לטעום כל כך בצינור, יהיו בהיקף של 200 μl של תערובת נוגדנים בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C ו לכסות מפני אור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 1 מ&quot;ל של FBS 1% PBS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 XG, וזורקים supernatant ו resuspend ב 300 μl של FBS 1% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הדגימות מתקבלות על ידי FACS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לבודד לויקוציטים, להשתמש באסטרטגיה gating הבאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית לחסל את כל תאים מתים על ידי gating על אוכלוסיית DAPI-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Singlets בחר בעלילה FSC-A לעומת FSC W כמצוין באיור 1 </strong&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער התאים המבוססים על גודל גרעיניות טיפוסי של לויקוציטים עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר CD45 + תאים בעלילה FSC-A CD45 כמצוין באיור 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבחין בין אוכלוסיות שונות של לויקוציטים ידי הביטוי של סמנים משטח כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה DCs כמו CD11c + MHC II + תאים. אלו ניתן לנתח לאחר מכן על מנת לתת ביטוי CD207 להבחין בין תאי לנגרהנס ואת CD207 + Dermal DCs מ CD207- Dermal DCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה המקרופאגים כמו CD64 + F4 / 80 + תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי B כמו CD19 + MHCII + תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי T כמו CD8 + או CD4 + תאים. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Streilein, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+and+signals+of+the+skin-associated+lymphoid+tissues+%28SALT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT).</a> Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).</li>
<li>Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skin-Resident+Immune+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+dermatology+reports%22%5BJournal%5D)">The Skin-Resident Immune Network.</a> Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+to+murine+skin+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity to murine skin commensals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).</li>
<li>Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+conventional+dendritic+cells+in+the+induction+of+peripheral+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance.</a> Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+metabolize+sunlight-induced+vitamin+D3+to%27program%27T+cell+attraction+to+the+epidermal+chemokine+CCL27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27.</a> Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).</li>
<li>Vitali, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory%2C+and+not+lymphoid-resident%2C+dendritic+cells+maintain+peripheral+self-tolerance+and+prevent+autoimmunity+via+induction+of+iTreg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells.</a> Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).</li>
<li>Azukizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady+state+migratory+RelB%2B+langerin%2B+dermal+dendritic+cells+mediate+peripheral+induction+of+antigen-specific+CD4%2B+CD25%2B+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells.</a> European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).</li>
<li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+role+of+migratory+dendritic+cells+in+peripheral+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction.</a> The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).</li>
<li>Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+role+of+tissue-resident+immune+cells+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis.</a> Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).</li>
<li>Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitasking+organ%3A+recent+insights+into+skin+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The multitasking organ: recent insights into skin immune function.</a> Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+self+antigen+imprints+regulatory+memory+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues.</a> Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLP+elicits+IL-33-independent+innate+lymphoid+cell+responses+to+promote+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation.</a> Science translational medicine. 5 (170), (2013).</li>
<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תארנו שיטה להכנת תא בודדת השעיות מאזורי עור עכבר שונים. השיטה של ​​עיכול אמצנו, לא רק נותנת תשואות גבוהות אלא גם משמרת את הביטוי של סמני משטח, שהוא יסוד לניתוח FACS הבא. שימוש קוקטייל של collagenase I ו- II ו thermolysin, מבטיח יצווה מינימום להבדלים יצוו בפעילות אנזים עושים שיטה זו מאוד לשחזור. שיטות שפורסמו אחרות מסתמכות על קוקטיילי אנזים שונים אך בידינו הם נותנים תשואות נמוכות, וחשוב יותר, הם פחות לשחזור. השיטה...

העור הוא אחד האיברים הגדולים ביותר בגוף ופני השטח הגדולים שלו חשופים באופן רציף לסביבה החיצונית. לכן העור צריך להגן על האורגניזם מפני איומים פוטנציאליים על מנת לשמור על הומאוסטזיס, הן באמצעים פיזיים והן על ידי מתן הגנה אקטיבית מפני כניסת פתוגן פוטנציאלי. בדומה לרירית המעי והריאות, העור מכיל מגוון תאי חיסון שמקיימים אינטראקציה רציפה עם האפיתל כדי לשמור על מעקב חיסוני. מערכת מורכבת זו המערבת תאים חיסוניים ולא חיסוניים של העור הוכרה עוד מימיה הראשונים של האימונולוגיה, כאשר בשנת 1978 נטבע לראשונה המונח "רקמת לימפה הקשורה לעור" (SALT) 1 כדי לתאר מורכבות כזו. 
המספר הגדול של תאי מערכת החיסון השוכנים בעור מסייע לאורגניזם לא רק להילחם בפלישות פוטנציאליות, אלא גם לתאם ריפוי פצעים ולשמור על סובלנות כלפי אנטיגנים עצמיים ומיקרוביוטת העור 2,3. 
בקרב תאי מערכת החיסון השוכנים בעור, לתאים דנדריטיים (DCs) יש תפקיד מכריע בעיצוב תגובות חיסוניות ובשמירה על הומאוסטזיס 4. תאי DCs עוריים ותאי לנגרהנס מגיבים בקלות לפלישות פתוגנים, ועם ההגירה לבלוטות הלימפה מפעילים תאי T וגורמים לביטוי של קולטני ביות עור על תאי T האפקטורים החדשים שנוצרו 5. ל-DCs יש גם תפקיד מהותי בוויסות הומאוסטזיס של העור. DCs הנודדים מהדרמיס לבלוטות הלימפה בתנאים הומאוסטטיים מעבירים אנטיגנים מבודדים בעור במטרה לגרום לסבילות לתאי T בעיקר באמצעות התמיינות של תאי T רגולטוריים (Tregs) ספציפיים לאנטיגנים של העור 6-8. 
תאי T מייצגים את האוכלוסייה הנפוצה ביותר של תאי מערכת החיסון בעור. לא רק שהם חודרים לעור במהלך זיהום, אלא שהם גם מייצגים אוכלוסייה יציבה בקרב לימפוציטים השוכנים בעור 9,10. גם תאי זיכרון תושב CD8+ וגם CD4+ שוכנים בעור, ובעקבות זיהום, יכולים להגיב הרבה לפני שתאי T אפקטורים מגויסים מהדם. בעור שוכנת גם אוכלוסייה של Tregs שוכני רקמות המסוגלים לשמור על סובלנות כלפי אנטיגנים של העור והומאוסטזיס של רקמות. תאים אלה מופעלים במהירות ובעוצמה לאחר חשיפה לאנטיגן הקוגנטי שלהם ולכן הוגדרו כ-Memory Tregs 11,12. 
יחד עם תאי DCs ותאי T, תאים חיסוניים מולדים רבים, כגון תאי NK, תאי T גמא דלתא, ILCs 13 מקבוצה 2, תאי פיטום ומקרופאגים, מאכלסים את העור ותורמים להגנה על המארח. כדי לנתח סביבה מורכבת כזו, חובה להשיג תרחיפים חד-תאיים מדגימות עור ביעילות גבוהה ובמקביל לשמור על ביטוי סמני פני השטח לניתוח או מיון ציטופלואורימטרי זרימה. 
עור העכברים מציג שכבת אפידרמיס חיצונית, המורכבת בעיקר מקרטינוציטים, תאי לנגרהנס ותאי T אפידרמיסיים דנדריטיים; ושכבת העור שמתחתיה. הדרמיס מאכלס את רוב תאי מערכת החיסון ומיוצר על-ידי מטריצה חוץ-תאית שבה סיבי הקולגן הם הנפוצים ביותר, במיוחד קולגן-I וקולגן-IV. בניגוד לעור אנושי, עור העכבר מכוסה בפרווה, ולכן מאוכלס יותר בזקיקי שיער. הוא גם דק בהרבה מעור האדם ומכיל שכבה שרירית, panniculus carnosus, המסייעת בריפוי פצעים 14. המאפיינים הללו מקשים על שיבוש יעיל של רשת הקולגן בדרמיס כדי להוציא את תאי מערכת החיסון החוצה.
במאמר זה אנו מספקים שיטה מתאימה לעיכול המטריצה החוץ-תאית המסתמכת על קוקטייל של קולגנאז 1 ו-2 בטוהר גבוה ותרמוליזין. יתר על כן, מכיוון שניתוח עור מאזורים שונים דורש הליכי ניסוי שונים, נציג שיטות שונות להשגת דגימות עור ביעילות מכרית כף הרגל, הזנב, האוזן והגזע. לאחר מכן נסמן את הדגימות על מנת להעריך את נוכחותם של תאי DC (MHCII+CD11c+CD45+), מקרופאגים (CD11b+F4/80+CD45+), CD8+ ותאי CD4+ T.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>בתוספת RPMI 1640 בינוני&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 תוסף תזונה עם L-glu, עט-סטרפטוקוקוס ללא בטא מרקפטו אתנול</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (תערובת אנזימים)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>השהיה [2.5&nbsp; מ"ג/מ"ל] ב-dH2O; אחסן את הפריטים ב -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D4263-1VL</td><td>מושהה בסרום RPMI 1640 w/o [1,000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>חומרים</חזקים></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td>כירורגיים</tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>כירורגיים</tr><tr><td>אזמל</td><td></td><td></td><td></td>כירורגי</tr><tr><td>35 מ"מ צלחות</td><td></td><td></td><td></td>פטרי</tr><tr><td>66 מ"מ צלחות</td><td></td><td></td><td></td>פטרי</tr><tr><td>100 מ"מ צלחות</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>פטרי<td>70 ומיקרו; m מסנני תאים</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><קוקטייל עיכול חזק></חזק></td><td></td><td></td><td>לדלל ב-RPMI 5%</td></tr><tr><td>FBS LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>נוגדנים</חזק></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>שיבוט</חזק></td><td><חזק>תווית</חזק></td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

העור הוא איבר מחסום המקיים אינטראקציה עם הסביבה החיצונית. בהיותם חשופים באופן רציף לפלישה מיקרוביאלית פוטנציאלית, הדרמיס והאפידרמיס מאכלסים מגוון תאים חיסוניים בתנאים הומאוסטטיים ודלקתיים כאחד. כלים להשגת שחרור תאי עור לאנליזות ציטופלואורימטריות הם אפוא שימושיים מאוד על מנת לחקור את הרשת המורכבת של תאי חיסון השוכנים בעור ואת תגובתם לגירויים מיקרוביאליים. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר להשגת תרחיפים חד-תאיים במהירות וביעילות. פרוטוקול זה מאפשר שמירה על כדאיות תא מקסימלית מבלי לפגוע בביטוי האנטיגן על פני השטח. אנו גם מתארים כיצד לקחת ולעכל דגימות עור ממיקומים אנטומיים שונים, כמו למשל האוזן, תא המטען, הזנב וכרית כף הרגל. לאחר מכן, התרחיפים המתקבלים נצבעים ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה כדי להבחין בין אוכלוסיות לויקוציטים שונות.

עור מאזור אחר של הגוף היה מתעכל פי הפרוטוקול המתואר ומוכתם נוגדנים המצוינים. אסטרטגית gating מתוארת באיור 1. ראשית בחרו תאי חיים (תאי DAPI-), אז שער על singlets (FSC-A לעומת-W FSC) ועל תאים עם מורפולוגיה הלימפוציטים (FSC-A לעומת SSC-A). כאשר הדבר מתבקש, CD45 + תאים ממקור hematopoietic נבחרים. DCs מסומנים עם אנטי CD11c, -...

העור הוא ביתה של רשת תאי חיסון מורכבת. אנו מתארים מתודולוגיה יעילה לעיכול עור עכבר, מחלקים שונים בגוף החיה, על מנת לקבל תרחיף חד-תאי ולנתח את אוכלוסיות הלויקוציטים השונות השוכנות בעור על ידי זרימה ציטומטרית.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין תרחיף של תאים בודדים מעור עכבר כדי לזהות את האוכלוסיות השונות של תאי חיסון תושבים באמצעות אנליזה ציטופלואורימטרית, ובכך לזהות ולבודד את האוכלוסיות השונות של תאי חיסון תושבי העור. באמצעות טכניקה זו, חוקרים יכולים לעכל בקלות דגימות מאזורים שונים של עור העכבר מבלי לפגוע במסמני השטח של תאי החיסון הרלוונטיים.כדי להוציא דגימות עור מאוזנו של העכבר, גזרו את החלקים חסרי השיער של האוזניים והשתמשו בפינצטה כדי להפריד בין הצד הגבי (dorsal) לצד הבטני (ventral) של האיברים. לאחר מכן, גרדו בעדינות את האוזן הפנימית כדי להסיר סחוס שנותר. כדי להוציא דגימות עור גדולות יותר, גלחו את כל השערות מגופו של בעל החיים באמצעות מכונת גילוח, ולאחר מכן מרחו תמיסת דפילציה (מסיר שיער).לאחר מספר דקות, נקה את הלשון ובצע חתך אנכי במרכז גב העכבר, והמשך את החתך לאורך גבולות האזורים שהגלחו סביב גוף העכבר. תוך כדי החזקת העור במקומו בעזרת פינצטה והפרדת הדגימה באמצעות קצוות עגולים וסגורים של מספריים כירורגיים או סקלפל, הפר בעדינות את העור מהפריטונאום ומשרירי הגב. לאחר מכן, טבול את העור בצלחת תרבית תאים של 100mm המכילה 10ml של PBS קר מאוד, והשתמש בפינצטה כדי לגרד ולהסיר את השומן התת-עורי.כדי להשיג דגימה של עור הזנב, חיתכו את הזנב והשתמשו במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך אנכי החל מבסיס הזנב ועד לקצהו. באמצעות פינצטה, תפסו את שולי החתך בבסיס הזנב, ולאחר מכן, תוך כדי אחיזת גוף הזנב עם זוג פינצטות נוסף, משכו בעדינות את העור לכיוון הקצה. הסירו שומן עודף על ידי גירוד עדין של דגימת העור.חיתוך של כף רגלו של העכבר, ולאחר מכן, כדי להשיג דגימת עור מכרית כף הרגל, השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את עור כף הרגל לאורכו מהקרסול ועד לתחילת האצבעות, תוך הקפדה להימנע מחיתוך שיער. לאחר מכן, אחז בעצמות הקרסול בעזרת פינצטה, בעודך תופס את העור עם פינצטה שנייה, ומשוך את העור לכיוון האצבעות בדומה להסרת כפפה. כדי לסמן את תאי העור, העבר בכל פעם דגימה אחת של רקמה לצחנת פטרי בנפח 35 milimeter המכילה 2 milliliters של תערובת עיכול (digestion cocktail) שהוכנה טרי.בעזרת מספריים, קצצו את הדגימה לחתיכות קטנות והדגירו את שברי הרקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך 90 דקות, תוך ביצוע נעורה עדינה פעם אחת או פעמיים במהלך תקופת ההדגרה. לאחר מכן, שפכו את רקמת העור שעברה עיכול למסנן תאים של 70 micron בתוך צלחת פטרי בקוטר 66 milimeter המכילה 1 milliliter של RPMI 1640 מועשר ב-FBS לכל צלחת. שטפו את המסנן עם 5 milliliters של מצע טרי, ולאחר מכן השתמשו בבוכנה של מזרק כדי לדחוק את הדגימות דרך רשת המסנן.שטפו את הבוחן, את הצלחת ואת המסננת ב-20 milliliters של מצע טרי והעבירו את תרחיף הרקמה למבחנה קונית של 50 milliliter. לאחר עיבוד כל הדגימות, סבבו את התאים בצנטריפוגה ושחזרו את המשקעים ב-100 microliters לדגימה של שני micrograms per milliliter של נוגדן חוסם anti CD16 CD32 ב-PBS בתוספת 1%FBS. לאחר 15 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees celsius, הוסיפו 100 microliters של נוגדן כפי שמופיע בטבלה לדגימות המתאימות למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees celsius תחת הגנה מאור.בסיום הדגירה שטפו את התאים ב-1 mL של PBS בתוספת FBS והשעיכו מחדש את המשקעים ב-300 µL של FBS PBS. לאחר מכן, סמנו את התאים עם 2 µg/mL של DAPI למשך 10 דקות ב-4 °C, תוך הגנה מפני האור. כדי לבודד את הלוקוציטים, בצעו תחילה gating לאוכלוסיית התאים החיוביים ל-DAPI כדי להסיר את התאים המתים.לאחר מכן, בחרו את הסינגלטים באזור פיזור קדימה (forward scatter) באמצעות תרשים רוחב פיזור קדימה, ובצעו gating לתאים על בסיס הגודל והגרנולריות של הלוקוציטים הרלוונטיים. בשלב הבא, בחרו את התאים החיוביים ל-CD45, ולאחר מכן, עבור כל דגימה, זהו את אוכלוסיות התאים הדנדריטיים של העור לפי ביטוי CD11C ו-MHC class two. זהו את המקרופאגים לפי ביטוי CD64 ו-F480, את תאי B לפי ביטוי CD19 ו-MHC class two, ואת תאי T לפי ביטוי CD4 או CD8.בידוד תאי מערכת החיסון של העור, כפי שהודגם, מניב אוכלוסייה של למעלה מ-50% תאים חיים מכל אזורי העור, שמהם בין 5,000 ל-15,000 לסנטימטר רבוע הם חיוביים ל-CD45. ניתן להשיג מספר מספיק של תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי B ותאי T לצורך אנליזות המשך מסנטימטר רבוע אחד של עור עכבר, כפי שצוין. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן העיכול של רקמת עור שאינה דלקתית ובידוד הלוקוציטים לצורך אנליזת FACS.

preparation-single-cell-suspensions-for-cytofluorimetric-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

סרטון זה מתאר את השיטה המהירה לבודד ולגדל את המלנוציטים והפיברובלסטים בו זמנית מעורו של גור העכבר לאחר הלידה. תאים אלה יכולים להישמר ולתפעל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי העור, ריפוי פצעים ומלנומה.

גידול מהיר של מלנוציטים ופיברובלסטים ראשוניים של מורין: בידוד מלנוציטים ופיברובלסטים מדגימת עור מורין שלם

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של תאי T תושבי עור מביופסיות עור אנושיות. פרוטוקול זה מניב מספר מספיק של לימפוציטים תושבי עור אנושי ברי קיימא לניתוח זרימה ציטומטרית ותרבית ex vivo.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

מודל אידיאלי לחקר ביולוגיה של תאי גזע בוגרים הוא זקיק שיער העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות שונות של זקיקי שיער, תאי גזע וקרטינוציטים אפידרמיסיים, תוך שימוש בעיכול אנזימטי של עור הגב של העכבר ואחריו ניתוח FACS.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

אנו מתארים פרוטוקולים להכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח זרימה ציטומטרי.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי אפיתל תימיים של עכבר וצביעה של מולקולות תוך-תאיות לניתוח ציטומטרי זרימה

פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת לבידוד תליות חד-תאיות איכותיות הן מרקמת ריאות עכברית בריאה והן מגידולים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על scRNA-seq, ניתוח ציטומטריית זרימה, ובידוד תאים ראשוניים.

הכנה אופטימלית של רקמת ריאה נושאת גידול עכברוניים שלמים לצורך ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי

למדו הכנת תא בודד מעור עכבר לניתוח ציטופלואורימטרי של אוכלוסיות תאי חיסון שוכני עור. שיטה זו מאפשרת בידוד תאים ללא פגיעה בסמנים פנימיים.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

גלה סרטונים נוספים