השתלת תאי שריר נורמלית וממאירים לחיסון חלש למבוגרים דג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד להכין ולהשתיל שריר תקין וממאיר. מדגי זברה מתורם טרנסגני לסמרטוט שני מקבלי דגי זברה חסרי חיסון. השתלת שריר כוללת תחילה בידוד שריר עם תווית פלואורסצנטית על ידי דיסקציה של שרירי הגב.

לאחר הומוגניזציה של דג הזברה תאי שריר מסוננים והופכים לתרחיף תא בודד. לאחר מכן מושתלים תאים תוך שרירית לתוך סמרטוט, לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי של דגי זברה מוטנטיים כדי לעקוב אחר השתלת רקמות בבעלי החיים הנמענים כבר 10 ימים לאחר ההשתלה. באופן דומה, ניתן לקצור סרקומה מיוזה עוברית ראשונית, להפוך אותה לתרחיף ולהשתיל תוך צפקית לתוך סמרטוט שני דגי זברה מוטנטיים.

לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופיה כדי לעקוב אחר השתלת הרקמה וניתן להשתמש בתאי הגידול המופצים ביישומים במורד הזרם. היתרון העיקרי בשימוש בהשתלת תאי דג זברה בפגיעה חיסונית למבוגרים הוא בכך שהיא מספקת פלטפורמה אוניברסלית להשתלת אלוגרף של מספר רקמות וסוגי גידולים. ניתן להשתיל רקמות ממגוון רקע גנטי של תורם ללא צורך בדיכוי חיסוני בדגים המקבלים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתאי גזע וביולוגיה רגנרטיבית כגון יכולת ההתחדשות העצמית של אבות. אנו יכולים גם להשתמש בשיטות אלה כדי לחרוט גידולים בסמרטוט שני דגים מוטנטיים, ואז לזהות כימיקלים חדשים אשר, למשל, גידול גידול פחמימות המדגים הכנה והשתלה נורמלית וממאירה של תאי שריר יהיו סנטר, טאנג ואנס. 10 עד שני סטודנטים מוכשרים לתארים מתקדמים במעבדת LAL מתחילים בהקרבת דגי זברה תורמים עם שריר עם תווית פלואורסצנטית. אחד.

דגים בוגרים טיפוסיים התורמים RFP מניבים בין 500,000 ל-2 מיליון תאי שריר. בניסוי לדוגמה שלנו, אנו משתמשים ב-30 דגים תורמים כדי להשתיל ב-20 דגים נמענים עם מיליון תאים כל אחד. לאחר המתת חסד של הדג התורם יש לייבש את החיה על ידי הנחתה על מגבת נייר חד פעמית.

השתמש בסכין גילוח כדי לקצור את שרירי הגב. החיתוך צריך להיעשות בזווית של 45 מעלות אחורית לאזור פי הטבעת, כולל עצמות ורקמת עור להעביר 10 קטעי שרירי גב שנקטפו לצלחת פטרי נקייה. לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מתלים צונן 0.9 XPBS 5% FBS.

לאחר מכן, טחנו את הרקמה עד לקבלת תרחיף אחיד הומוגניזציה מלאה של הרקמה באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, הוסיפו שני מיליליטר של מאגר מתלה להומוגנאט, ולאחר מכן העבירו את התרחיף דרך הפיפטה 20 פעמים. לאחר מכן, סנן את המתלה באמצעות מסננת של 40 מיקרון ואסוף תאים בצינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח. שמור על התאים קרים למשך שארית ההליך.

שוטפים את הרקמה שנותרה במסננת עם 2.5 מיליליטר מתלה, חוצץ ומסננים לתוך הצינור החרוטי של 50 מיליליטר. כעת, ספרו את המספר הכולל של תאים ברי קיימא באמצעות טריאן כחול ורכזו אותם על ידי צנטריפוגה ב-1000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-0.9 XPBS עם 5%FBS ב-333,000 תאים למיקרוליטר.

אם מספר התאים התורמים מוגבל עד 50,000 תאים מוזרקים יכולים גם להוביל להשתלה מוצלחת. התחל בהרדמה של סמרטוט בן חודשיים עד ארבעה חודשים שני דגים חסרים בטריקה. כאשר תנועות סלסול איטיות והדג עדיין מעביר את הדג למגבת לחה כשהצד השמאלי של הדג פונה כלפי מעלה.

כעת השתמש במזרק מיקרו של 10 מיקרוליטר בגודל 26 שניות שננקה מראש כדי להזריק שלושה מיקרוליטר של זריקות תרחיף תאי השריר המוכנות יש להשלים בזווית של 45 מעלות ולהזריק ישירות לשרירים הגביים של הדגים המקבלים. חשוב לציין בעת ביצוע השתלה תוך שרירית, יש להזריק נפח כולל של פחות משלושה מיקרוליטר לדג המקבל. לאחר מכן העבירו בזהירות את הדג המקבל למיכל התאוששות המכיל מים נקיים של מערכת הדגים.

המשיכו להזריק את הדגים הנותרים והניחו אותם במיכל התאוששות אחד. מאוחר יותר, העריכו את שיעורי ההשתלה ב-10, 20 ו-30 יום לאחר ההשתלה באמצעות מיקרוסקופיה ברייטפילד ואפי פלואורסצנטי. עיבוד כל גידול בנפרד.

הקריבו דג עם רבדומיוסרקומה עוברית. מניחים את הדג בצלחת פטרי נקייה ומנתחים את הגידול הרחק מהרקמות הלא ממאירות באמצעות סכין גילוח ומלקחיים עדינים, דיסקציה זהירה סביב הגידול תוביל לטוהר גבוה יותר של תרחיף התאים המתקבל עם זיהום מינימלי של רקמת השריר שמסביב. העבירו את הגידול המנותח לכלי חדש והוסיפו 100 מיקרוליטר של תרחיף FBS 0.9 XPBS 5% מקורר מראש, חיץ.

לאחר מכן טוחנים את הרקמה בעזרת סכין גילוח עד לקבלת מתלה אחיד. לאחר מכן הוסף עוד 900 מיקרוליטר של חיץ באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד ואחריו טרייר. דירוג המתלה דרך הפיפטה מספר פעמים כדי לנתק את התאים.

כעת סנן את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון. שטפו את הצלחת על ידי הוספת שניים עד ארבעה מיליליטר נוספים של מתלה, חיץ ומסנן דרך אותה מסננת תאים. רכז את התאים כמו קודם.

שמור על תאים על קרח. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר וספרו את התאים הקיימים באמצעות טריאן כחול. התאם את ריכוז תרחיף התאים ל -5,000 תאים למיקרוליטר.

לאחר מכן, הרדימו את הסמרטוט שני דגי זברה נמענים בסיכון חיסוני והניחו אותו על מגבת נייר נקייה כשצד הגחון פונה כלפי מעלה. באמצעות מחט מזרק נקייה בגודל 26 שניות. הזרקו את הנפח הרצוי לחלל הצפק של דג הזברה המקבל כאן.

25,000 תאים מוזרקים בחמישה מיקרוליטר. עם זאת, ניתן להזריק בהצלחה עד 10 מיקרוליטר. תן לדגים המוזרקים להתאושש במיכל התאוששות לפני החזרתם למערכת הראשית.

מאוחר יותר, עקוב אחר הדגים הנמענים להשתלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי וקצור את התאים למחקרים במורד הזרם. באמצעות ההליך המתואר הושתלו תאי שריר שלד מתורמים טרנסגניים של אלפא אקטין RFP לתוך סמרטוט הומוזיגוטי פגוע במערכת החיסון, שני דגי זברה מוטנטיים. רקמת שריר השלד ייצרה תרחיף תא בודד המכיל 84.3% תאים ברי קיימא כפי שהוערך על ידי אי הכללת DPI.

לאחר ניתוח ציטומטריית זרימה, תאים חיוביים ל-RFP היוו 35.3% מתרחיף תאי תורם זה. השתלת תאים לשריר השלד הגבי של RAG שני דגים מוטנטיים הומוזיגוטיים הובילה לעקביות וחזקות והשתלה. זה אושר על ידי היווצרות סיבי שריר פלואורסצנטיים מרובי גרעינים בדגים הנמענים לא הצליחו להשתיל סיבי שריר.

עם זאת, עד 10 ימים לאחר ההשתלה, תשעה מתוך 14 דגי זברה מוטנטיים הכילו סיבי שריר חיוביים ל-RFP ליד אתר ההזרקה. חשוב לציין, השריר החיובי ל-RFP המושתל נמשך לפחות 30 יום לאחר ההשתלה. באופן דומה, השתלה חזקה הושגה לאחר השתלת RAG שני דגים מוטנטיים עם רבדומיוסרקומה עוברית או ERMS.

ה-ERMS המושתל משותף מאפיינים היסטולוגיים עם ההטרוגניות הראשונית של תאי הגידול ERMS נשמרה כפי שהוערך על ידי ניתוח פלואורסצנטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע השתלת שרירים והשתלה תוך צפקית של רקמות תקינות וממאירות באמצעות נמען מבוגר פגוע במערכת החיסון. בעקבות זאת ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, ניתוח השתלת דילול מוגבל ו-PCR בזמן אמת כדי להעריך הבדלים תפקודיים ומולקולריים בין תת-אוכלוסיות גידול שונות.

בסך הכל, הגישה שלנו מאפשרת השתלה חזקה וארוכת טווח של שרירים פלואורסצנטיים ורקמות ממאירות. היתרון בגישה זו הוא שההשתלה מתרחשת בהיעדר דיכוי חיסוני קודם של הדג המקבל ואינה דורשת התאמה חיסונית של בעלי החיים התורמים והמקבלים.