השתלת תאי שריר נורמלית וממאירים לחיסון חלש למבוגרים דג הזברה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד להכין ולהשתיל שריר נורמלי ושריר ממאיר, מדגי דגי זברה תורמים טרנסגניים למקלטי דגי זברה עם Deficiency immune מסוג rag two. השתלת שריר כוללת תחילה בידוד של שריר מסומן פלואורסצנטית באמצעות דיסקציה של השרירים הגביים.

לאחר הומוגניזציה, תאי השריר של דגי הזברה מסננים ומועברים לסuspended של תאים בודדים. לאחר מכן, התאים מושתלים תוך-שרירית לתוך דגי זברה מוטנטיים מסוג rag two. מיקרוסקופיית epi fluorescence משמשת לאחר מכן למעקב אחר השתרבות הרקמה בבעלי החיים הרכיבים כבר 10 ימים לאחר ההשתלה. באופן דומה, ניתן לאסוף סרקומה רבדומיאוטיקה עוברית ראשונית (primary embryonal rhabdomyosarcoma), להעבירה לסספנציה ולהשתילה תוך-בטנית לתוך דגי זברה מוטנטיים מסוג rag two.

לאחר מכן, נעזרים במיקרוסקופיה כדי לעקוב אחר השתךת הרקמה, וניתן להשתמש בתאי הגידול שהתרבו ביישומים המשכיים. היתרון המרכזי בשימוש בהשתתת תאים בדגי זהבים בוגרים עם מערכת חיסון לקויה הוא שהיא מספקת פלטפורמה אוניברסלית להשתתלת אלוגרפט של רקמות וסוגי גידולים שונים. ניתן להשתתת רקמות ממגוון רקעים גנטיים של תורמים ללא צורך בדיכוי חיסוני בדגי המקבל.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בביולוגיה של תאי גזע וביולוגיה רגנרטיבית, כגון יכולת החדישות העצמית של תאי פרוגניטורים. ניתן להשתמש בשיטות אלו גם להחדרת גידולים לדגי rag2 מוטנטיים, ולאחר מכן לזהות חומרים כימיים חדשים אשר, למשל, מעכבים את צמיחת הגידול. הדגמת הכנה והשתלה של תאי שריר נורמליים וממאירים תבוצע על ידי chin, tang ו-anes, 10 סטודנטים לתואר שני מוכשרים במעבדת LAL. התחילו בהקרבת דגי זברה תורמים עם שריר המסומן פלואורסצנטית.

דגי תורם בוגרים טיפוסיים של alpha acting RFP מספקים בין 500,000 ל-2 מיליון תאי שריר. בניסוי לדוגמה שלנו, אנו משתמשים ב-30 דגי תורם להשת植ה ב-20 דגי מקבל, כאשר כל אחד מקבל מיליון תאים. לאחר המתנת התורמים, יש לייבש את בעל החיים על ידי הנחתו על נייר סופג חד-פעמי.

השתמשו בלהב תער כדי לקצור את השרירים הגביים. יש לבצע את החיתוך בזווית של 45 מעלות אחורית לאזור פיגס, כולל עצמות ורקמת עור. העבירו 10 חתכים של שרירים גביים שנקצרו לצלחית פטרי נקייה. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של תמיסת Buffer מסוג 0.9 XPBS 5%FBS מקוררת.

בשלב הבא, קצצו את הרקמה עד לקבלת תמיחה אחידה תוך הומוגניזציה מלאה של הרקמה באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 mL, הוסיפו 2 mL של בופר תמיחה להומוגנאט, ולאחר מכן העבירו את התמיחה הלוך ושוב דרך הפיפטה 20 פעמים. לאחר מכן, סננו את התמיחה באמצעות מסננת של 40 micron ואספו את התאים לתוך מבחנה קונית של 50 mL על קרח. שמרו על התאים קרים לאורך שאר הפרוצדורה.

שטפו את הרקמה שנותרה במסנן באמצעות 2.5 milliliters של תמיסת בופר (buffer) וסננו אותה אל תוך מבחנה קונית של 50 milliliters. כעת, ספרו את המספר הכולל של תאים חיוניים באמצעות trypan blue ורכזו אותם על ידי סנטריפוגציה במהירות של 1000 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C). לאחר מכן, השעיקו שוב את התאים ב-0.9 XPBS עם 5% FBS בריכוז של 333,000 תאים ל-microliter.

אם מספר תאי התורם מוגבל, אפילו 50,000 תאים מוזרקים יכולים להוביל להשתרה מוצלחת. התחילו בהרדמה של דגים חסרי rag2 בני חודשיים עד ארבעה חודשים ב-trica. כאשר התנועות של הסנפיר איטיות והדג אינו זז, העבירו את הדג למגבת לחה כאשר צדו השמאלי פונה כלפי מעלה.

כעת, השתמשו במזריק מיקרו של 10 µL בכיול 26 s שעבר ניקוי מוקדם כדי להזריק 3 µL מתלי suspension של תאי השריר שהוכן. יש להשלים את ההזרקות בזווית של 45 מעלות ולהזריק ישירות למערכת השרירים הדורסולטרלית (gorsolateral musculature) של הדג המקבל. חשוב לציין כי בעת ביצוע השתלה תוך-שרירית, יש להזריק לדג המקבל נפח כולל של פחות מ-3 µL. לאחר מכן, העבירו בזהירות את הדג המקבל למכל התאוששות המכיל מי מערכת דגים נקיים.

המשיכו להזריק לדגים שנותרו והעבירו אותם למכל השקום אחד. לאחר מכן, העריכו את שיעורי ההשתבצות ביומיים ה-10, 20 וה-30 לאחר ההשתלה באמצעות מיקרוסקופיה של שדה בהיר (brightfield) ופלואורסצנציית epi, תוך עיבוד של כל גידול בנפרד.

בצע השבתה של דג עם רבדומיוסרקומה עוברית. הנח את הדג בצלחת פטרי נקייה והוצא את הגידול מהרקמות שאינן ממאירות בעזרת להב תער ופינצטה עדינה. דיסקציה זהירה מסביב לגידול תוביל לדרגת טוהר גבוהה יותר של תרחיף התאים המתקבל, עם זיהום מינימלי של רקמת השריר הסובבת. העבר את הגידול שהוצא לצלחת חדשה והוסף 100 µL של תמיסת בופר 0.9 XPBS 5%FBS שהוקררה מראש.

לאחר מכן, קצצו את הרקמה באמצעות להב תער עד לקבלת תרחיף אחיד. הוסיפו 900 µL נוספים של באפר באמצעות פיפט של 1 mL, ולאחר מכן השתמשו בטריטר. העבירו את התרחיף דרך הפיפט מספר פעמים כדי להפריד את התאים.

כעת סננו את התאים דרך מסנן תאים של 40 מיקרון. שטפו את הפלטה על ידי הוספת שתיים עד ארבעה מיליליטרים נוספים של תמיסת תאים, בופר, וסננו דרך אותו מסנן תאים. רכזו את התאים כפי שנעשה קודם לכן.

שמרו את התאים על קרח. לאחר מכן, השעיכו את התאים ב-100 µL של בופר וספרו את התאים החיים באמצעות trypan blue. התאימו את ריכוז תרחיף התאים ל-5,000 תאים ל-µL.

בשלב הבא, הרדימו את דגי zebrafish המקבלים בעלי המערכת החיסונית המוחלשת והניחו אותם על נייר סופג נקי כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. בעזרת מחט מזריקה סטרילית בקוטר 26 g, הזריקו את הנפח הרצוי לחלל הפריטונאום של דגי zebrafish המקבלים כאן.

מזריקים 25,000 תאים בחמישה µL. עם זאת, ניתן להזריק בהצלחה עד 10 µL. הרשו לדגים המוזרקים להחלים במיכל התאוששות לפני החזרתם למערכת הראשית.

בהמשך, עקבו אחר הדבקת התאים בדגי דגי-הקולטן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפיגנית, וקצרו את התאים לצורך מחקרים המשכיים. באמצעות הפרוצדורה המתוארת, הועברו תאי שריר שלד מתורמים טרנסגניים של alpha actin RFP לדגי זברה הומוזיגוטים מוטנטים של rag two עם מערכת חיסונית לקויה. רקמת שריר השלד הניבה תגליה של תאים בודדים שהכילה 84.3% תאים חיוניים, כפי שנערך באמצעות בדיקת DPI exclusion.

בעקבות ניתוח בציטומטריה של זרימה, תאים חיוביים ל-RFP היוו 35.3% מתליה תאי התורם. השתלה של תאים לשריר השלד הגבי של דגי רקיפ הומוזיגוטים מוטנטיים (RAG two) הובילה להשתרה חזקה ועקבית של הש transplanted. דבר זה אושש על ידי היווצרות סיבי שריר פלורסצנטיים רב-גרעיים בדגי הרקיפ; דגי רקיפ מסוג פרא (wild type) לא הצליחו להשריש סיבי שריר.

עם זאת, עד ליום ה-10 לאחר ההשתלה, תשעה מתוך 14 דגי זברה מוטנטיים הכילו סיבי שריר חיוביים ל-RFP בסמיכות לאתר ההזרקה. באופן חשוב, השריר המושתל החיובי ל-RFP נשאר לפחות עד ליום ה-30 לאחר ההשתלה. באופן דומה, השתקעות חזקה התקבלה לאחר השתלה של דגי RAG two מוטנטיים עם רבדומיוסרקומת עוברית או ERMS.

ה-ERMS המשתבץ חלק תכונות היסטולוגיות עם גידול ה-ERMS הראשוני; ההטרוגניות של תאי הגידול נשמרה כפי שנמדד בניתוח פלואורסצנציה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן ביצוע השתלה שרירית והשתלה תוך-פריטונית של רקמות נורמליות וממאירות באמצעות דגי זהב בוגרות עם מערכת חיסון לקויה. לאחר מכן, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), ניתוח השתלה בדילול מוגבל ו-real-time PCR כדי להעריך הבדלים פונקציונליים ומולקולריים בין תתי-אוכלוסיות שונות של הגידול.

באופן כללי, הגישה שלנו מאפשרת השתלה עמידה וארוכת טווח של רקמת שריר פלואורסצנטית ושל רקמה ממאירה בתוך דגי מוטציה RAG two בעלי מערכת חיסונית לקויה. היתרון בגישה זו הוא שההשתחלה מתרחשת ללא צורך בדיכוי חיסוני מוקדם של הדג המקבל, והיא אינה דורשת התאמה חיסונית בין בעלי התורם למקבל.