Name: ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: חקור שימוש באללים ניתנים להפעלה של טלומרז בעכברים לחקר ניוון רקמות, התחדשות וסרטן. השיטה כוללת הפעלה מחדש של טלומרז באמצעות הידרוקסי טמוקסיפן בחיות ובתרביות תאי גזע עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.H. נתמך על ידי פרס NIH K99/R00 Pathway to Independence (5K99CA172700) ופרס פיתוח הקריירה של NCI Brain Cancer SPORE (2P50CA127001).

הערה: כל הצעדים בפרוטוקול זה אושרו על ידי UT מרכז סרטן MD Anderson. 1. דור של mTERT-ER אללו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג לדפוק במיקוד וקטור המכיל את ERT2-LBD (יגנד כריכת Domain) במעלה הזרם ובמסגרת עם הרצף הגנומי mTERT (אקסון אינטרון 1 עד 2) ולקס - PGK - ניאו - בר לקס (איור 1 א) בתאי הגזע העובריים של עכבר עם electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי הגזע העובריים בנאומיצין ל6-10 ימים. בחר שיבוטים נאומיצין עמיד ולהרחיב ב -48 צלחות גם. חלץ את הדנ&quot;א הגנומי באמצעות ערכה מסחרית ולאשר את נוק-באלל על ידי כתם דרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שני קווי ES עם karyotypes הנורמלי מעל 95% לC57BL / 6 blastocysts עם ערכת מיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הפוכה. שתל blastocysts אל תוך הרחם של אמהות פונדקאיות 23. Mate תעתועים בדרגה גבוהה ממין זכר (70-90%) לC57BL / 6 Feזכרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את genotyping של בעלי החיים mTERT-ERneo הטרוזיגוטיים על ידי כתם דרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mate בעלי החיים mTERT-ERneo הטרוזיגוטיים ובעלי החיים EIIa-Cre למחוק את קלטת NeoR. Mate בעלי החיים הטרוזיגוטיים לC57BL / 6 בעלי חיים ללפחות שלוש פעמים, ובעלי חיים mTERT-ER נוספים בין-גזע הטרוזיגוטיים ליצירת homozygosity. </li></ol> 2. דור של LSL-mTERT אללו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את נוק-במיקוד וקטור המכיל LoxP - בלם משולש - ניאו - בר LoxP והרצף הגנומי mTERT (בין אקסון אינטרון 1 ו2, איור 1) בתאי הגזע העובריים של עכבר עם electroporation 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאי הגזע העובריים בנאומיצין ל6-10 ימים. בחר שיבוטים נאומיצין עמיד ולהרחיב ב -48 צלחות גם. חלץ את הדנ&quot;א הגנומי באמצעות ערכה מסחרית ולאשר את נוק-באלל על ידי כתם דרום 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Injeקווי שני ES ct עם karyotypes הנורמלי מעל 95% לC57BL blastocysts / 6 עם ערכת מיקרומניפולציה תחת מיקרוסקופ הפוכה. שתל blastocysts אל תוך הרחם של אמהות פונדקאיות 23. Mate תעתועים בדרגה גבוהה ממין זכר (70-90%) לC57BL / 6 נקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את genotyping של בעלי החיים LSL-mTERT הטרוזיגוטיים על ידי כתם דרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mate בעלי החיים הטרוזיגוטיים לC57BL / 6 בעלי חיים ללפחות שלוש פעמים, ובעלי החיים LSL-mTERT בין-גזע נוסף הטרוזיגוטיים ליצירת homozygosity. </li></ol> 3. הפעלה מחדש של הטלומרז בmTERT-ER ועכברים LSL-mTERT בVivo לmTERT-ER <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים כירורגיים לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם תא isoflurane (4% לזירוז, 2% לשמירה) ב 50% (V / V) חמצן / 50% (V / V) תערובת גז חד תחמוצת dinitrogen. או להרדים עכברים על ידי תערובת קטמין-xylazine (100 מ &#39;g / משקל גוף קילוגרם + 10 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתושג הרדמה עמוקה, להסיר את החיה המורדמת מתא האינדוקציה, ולשמור על הראש שלהם בתוך הצינור המחובר לתא isoflurane (2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את כריות כף הרגל של העכברים כדי להבטיח את החיה מורדמת עמוקה. למרוח משחה על שני העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. נגב את החלק האחורי של העכברים עם פתרון povidone- יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את גלולה 4-OHT איטי שחרור עם trochar דיוק (10 G) מתחת לעור של הגב ולדחוף את הכדור כל הדרך אל קו האמצע בין שתי כתפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החתך עם applier קליפ הפצע ולפקח על העכברים להתאוששות מן ההרדמה. הסר את הסרטונים 10 ימים לאחר מכן. חום נוסף אינו הכרחי משום שההליך יסתיים בקרוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקופת טיפול עם גלולה 4-OHT צריך להיות מותאמת לפי צורך המחקר. </li></ol> לLSL-mTERT &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמוקסיפן (10 מ&quot;ג / מיליליטר, מומס בשמן תירס) מוזרק intraperitoneally שני ימים רצופים (200 ul / 25 ג &#39;/ יום). </li></ol> 4. בידוד של תאי גזע עצביים והפעלה מחדש של הטלומרז במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מורדמים עם פחמן דו חמצני והמוח יוסרו. בצע את הפרוטוקול של ערכת ניתוק רקמה עצבית זמינה מסחרי כמו לכל יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend אבקת lyophilized בבקבוקון שכותרתו 4 פתרון עם 1 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לפתרון 4. האם לא מערבולת. פתרון זה אמור להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pre-חום התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך אנזים Mix 1: פתרון 1 (50 μl) ופתרון 2 (1,900 μl). הפוך אנזים Mix 2: פתרון 3 (20 μl) ופתרון 4 (10 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת אנזים 1,950 μl 1 עד 400 רקמות ומערבולת מ&quot;ג. טרום לחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מוח עכבר 1 היום, ולשמור forebrains על ידי הסרת נורות חוש הריח והמוח הקטן. שמור את רקמות המוח הקדמי ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות הקר מאז פינוי וחנות ב 4 מעלות צלזיוס. הקפד לעבד את הרקמה העצבית בתוך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המשקל של רקמה לוודא את מגבלת 400 מ&quot;ג לעיכול אין חריגה. מניחים את המוח על המכסה של צלחת פטרי בקוטר 35 מ&quot;מ, ולרסק את המוח באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה פיפטה 1 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר של HBSS (w / o Ca / Mg) והחלקים בחזרה לתוך צינור 15 מיליליטר פיפטה. לשטוף עם HBSS (w / o Ca / Mg). צנטריפוגה ב× גרם 300 למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1,950 μl של תערובת אנזים שחומם מראש 1 (פתרונות 1 ו -2) לרקמת מ&quot;ג עד 400. דגירה בצינור 15 מיליליטר במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ערבוב על ידי היפוך או טלטול הצינור כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת אנזים 30 μl 2 לדגימה רקמה על ידי הוספת 20 &amp; #956; l של פתרון 3-10 μl של פתרון 4. לאחר מכן להוסיף למדגם. היפוך בעדינות לתערובת. לא מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הרקמה באופן מכאני באמצעות פיפטה פסטר רחבה שקצהו, אש המלוטשת על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים לאט. הימנע מיצירת בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, צינור היפוך כל 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב 4.11 וצעד 4.12 אם הרקמות גדולות יותר מ -200 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ההשעיה התא למסננת תא 70 מיקרומטר, שהונחה על שפופרת 50 מיליליטר. החל 10 מיליליטר של PBS דרך מסננת תא. בטל מסננת תא והשעית תא צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים עם תאי גזע בינוני עד הנפח הנדרש עבור יישומים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל הטלומרז בLSL-mTERT NSCs, טיפול בתאים עם 100 מיקרומטר 4-OHT במשך יומיים. כדי להפעיל הטלומרז בmTERT-ER NSCs, לשמור על התאים במדיום תרבות עם 100 מיקרומטר 4-OHT. </li></ol> 5. FISH הטלומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכרומוזומים metaphase מהתאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לFFPE (פורמלין קבוע ופרפין Embedded) סעיפי רקמות, deparaffinize בקסילן ורעננות סדרת אתנול במשך 5 דקות כל אחד (100%, 90%, 70%, 50% אתנול) וPBS במשך 5 דקות ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן במתנול: חומצה אצטית (3: 1) במשך 1-2 שעות. מייבשים בסדרת אתנול קר למשך 5 דקות כל אחד (70%, 90%, 100% אתנול) ואוויר יבש. לשטוף ב1x PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל כרומוזומים בפורמלין 4% על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. מייבשים בסדרת אתנול קר 5 דקות כל אחד (70%, 90%, 100% אתנול) ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 12 עד 25 μl של תערובת הכלאת PNA לכל שקופית. (תערובת הכלאה: פוראמיד 70%, SSC 0.06x, BSA 0.2%, בדיקות / μl tRNA, 0.5 ng / הטלומרים או centromere μl 0.5 ng) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את תלוש לכסות בבטון גומי. preps פוסט-לפגל כרומוזומליות וחתכים רקמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 4 מ &#39;ב. להכליא בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בטמפרטורת חדר עם חיץ כביסה דקות 2 x 15. (חיץ לשטוף: פוראמיד 70%, SSC 0.06x, pH 7.2). לשטוף בטמפרטורת חדר 3 x 5 דקות עם PBST. שקופיות Counter-כתם עם DAPI או הקרינה מרחיקות אדומה לבדיקה מיקרוסקופית. </li></ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li>
<li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity%2C+stress+response%2C+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li>
<li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li>
<li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndromes+of+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li>
<li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li>
<li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%2C+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+surveys%22%5BJournal%5D)">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li>
<li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarlseder%2C+J+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 283, 1321-1325 (1999).</li>
<li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li>
<li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li>
<li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li>
<li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a%28delta2%2F3%29+cancer-prone+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li>
<li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מדווחים על הדור של שני אללים הטלומרז עכברי מושרה וכיצד להפעיל מחדש telomerase in vivo ובמבחנה. הצעד הקריטי להפעלה מחודשת של פעילות mTERT-ER הוא לשמור ריכוז מתמשך של טיפול בטמוקסיפן, ולכן אנחנו בוחרים להשתמש כדורים בזמן שחרור 4-OHT מיוצרים על ידי מחקר חדשני של אמריקה. כדורים לשמור שחרור 4OHT ברמת מצב יציבה דם של 1 ng / ml עד 60 ימים. במחקר קודם, שהראינו כי ההפעלה מחדש פעילות הטלומרז עם אסטרטגיה זו הצליחה לשפר פנוטיפים ניווניות כגון תשישות תאי גזע, ירידת ערך של תגובות פגיעה ברקמות וכשל איברים באיברים רבים שנגרמים על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים בG4 mTERT ER / ER עכברים 20. מלבד לימוד הפונקציה של הטלומרז בהזדקנות, יכולים לשמש גם שני אללים הטלומרז מושרה אלה ללמוד סרטן. מחקרים קודמים לקחויתרון של אללים אלה כדי לחקור את תפקידו של התשה הטלומרים והפעלה מחדש telomerase בעיצוב הגנום ומשפיע על הביולוגיה של לימפומה הרתי T-cell 21 וסרטן הערמונית 22. שני מחקרים אלה הראו כי תפקוד לקוי של הטלומרים בדור מאוחר G4 כספומט - / - mTERT ER / ER וG4 PB-Cre4 PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT L / עכברי L מספק מנגנון תדלוק רכישת אירועי mutagenic המוקדמים ל התחלה של גידול, עדיין מונע התפתחות של גידולים ממאירים באופן מלא. כאשר הטלומרז היה מחדש בהקשר של חוסר יציבות הנוצר על-תפקוד לקוי של הטלומרים הגנומי, מחסומי נזק ל- DNA וחוסר יציבות כרומוזומלית משתולל דוכאו, שאיפשר את ההתקדמות המלאה של גידולים ממאירים עם מאפיינים ביולוגיים חדשים כגון גרורות בעצמות של סרטן הערמונית 21 וחדירת המוח של thymiלימפומה ג 21. תופעות דומות נצפו גם בסוגי הסרטן אחרים, כוללים סרטן מעי גס וסרטן לבלב (תקשורת אישית עם בני הזוג. Haoqiang יינג, האדם Boutin ורונלד DePinho). כי חלבון טרט-ER ניתן מתג בקלות בין לסירוגין מדינות תלויים אם מטופלים בעלי החיים בטמוקסיפן או כלי רכב, ניתן יהיו לנצל את המודלים של הגידול שנוצרו על ידי אלל mTERT-ER לבדוק טיפול אנטי-הטלומרז. במחקר קודם, גידולים שנוצרו בG4 כספומט - / - בעלי חיים / ER mTERT ER שוחררו מ4-OHT; על דלדול הטלומרז, גידולים התכווצו סופו של דבר בשל החזרת מחסומים הנגרם הפרעה בתפקוד הטלומרים 21. עם זאת, חלק מהגידולים רכשו התנגדות בתגובה להטלומרז הכחדה על ידי הפעלת התארכות אלטרנטיבית של הטלומרים מנגנון (ALT). אפיון נוסף של גידולי ALT + עמיד אלה הראה כי tהיי יש שעתוק חריג של גני המעורבים בביולוגיה של המיטוכונדריה והגנה חמצוני כוללים רגולטור ראשי של הגנת סינתזה וחמצוני המיטוכונדריה PGC-1β. מציאה של PGC-1β או SOD2 (רגולטור נוסף של הגנת חמצוני) מבטלת באופן משמעותי תאי ALT + גידול בזמן לשמור על תאים הטלומרז + גידול להישאר יחסית ללא פגע 21. מגבלה אחת של שני אללים לדפוק באלה היא שהם יכולים להרשות לעצמם רק הפעלה מחדש של הטלומרז ברמת אנדוגני כי הם נמצאים במוקד יליד הגן הטלומרז. ברוב סוגי הסרטן אנושיים, הטלומרז הוא למעשה ביטוי יתר ברמה הרבה יותר גבוהה. על מנת לשפר את רמת הטלומרז, שינוי אחד אנחנו יכולים לשקול הוא להכניס את מבנה mTERT-ER עם אמרגן חזק כגון PGK אמרגן (kinase phosphoglycerate) למוקד Rosa26. לסיכום, שני אללים אלה הרומן מושרה עכבריים הטלומרז לספק ז&#39;נה חסרת תקדיםכלים ic ללמוד את הפונקציות של הטלומרז בהזדקנות והומאוסטזיס רקמה, כמו גם את התקדמות הגידול, במיוחד תחת הרקע של חוסר יציבות הנוצר על-תפקוד לקוי של הטלומרים רכש מראש הגנומי. גם אלל mTERT-ER יכול לשמש כדי ללמוד טיפול אנטי-הטלומרז על ידי חצייה לתוך מודלים עכבר גידול מועד אחרים.

הטלומרז הוא אנזים אחראי לשמירת הטלומרים. אלה הם רצפים חוזרים בקצוות של כרומוזומים שלהגן על היושרה שלהם. רכיבי הליבה של holoenzyme telomerase הם מקטע transcriptase ההפוך קטליטי (טרט) ומקטע RNA (TERC) המשמש כתבנית להוספת telomeric חוזר 1,2. בעוד מודחק בדרך כלל בתאים סומטיים מובחנים, הטלומרז מציג פעילות חזקה וממלא תפקידים חשובים בתאי נבט, תאי סרטן ותאי גזע. עכברי נוקאאוט mTERC וmTERT לספק גדולים במערכות מודל vivo ללמוד את הפונקציות של הטלומרז בשני תאי גזע וסרטן. MTERC וmTERT מפסיד יוצא, עכברים (G1) לא הראו שום פנוטיפים ברורים בשל המילואים הארוכים של הטלומרים בעכברים 3. עם זאת, באופן סדרתי intercrossing עכברי נוקאאוט mTERC וmTERT לדור מאוחר (G5-G6) הביא לשחיקה הדרגתית של הטלומרים וסופו של הדבר עוררה ניוון חמור של רקמות שגשוג מאוד 4. דור המאוחר (G5-G6) mTERC - / - עכברים עקרים בשל השיעור הגבוה של אפופטוזיס בדלדול תא אשך וניבט. G5-G6 mTERC - / - עכברים גם תערוכת פנוטיפים ניוונית ברקמות השגשוג ביותר כוללים מח עצם, מעי ועור בשל שיעור גבוה של אפופטוזיס ויכולת התחדשות עצמית פגומה בגזע רקמות / תאי תא אב 4. תאי גזע hematopoietic במח העצם של דור מאוחר mTERC - / - עכברי אובדן תערוכה של פוטנציאל שגשוג, יכולת התחדשות עצמית נפגעה, אפופטוזיס המוגבר וסופו של דבר תשישות תפקודית 5,6. בדומה לכך, גופים אפופטוטיים מוגברים בהדרגה במאורות מעי נצפו בכל דור של G1-G6 mTERC - / - עכברי 7,8. Tהוא השפעה מזיקה של הטלומרים לא מתפקדים לא נראה להיות מוגבל לרקמות תחלופה גבוהות שכן הן ההתפשטות של תאי גזע עצביים מבוגרים במבחנה וneurogenesis in vivo היו נפגעות קשה בדור מאוחר (G4-G5) mTERC - / - עכברים 9 . התפקיד של הטלומרז בתאי גזע נתמך גם על ידי הממצאים בcongenita נדיר אנושי הפרעה גנטית דיסקרטוזיס (DKC), אשר במובנים מסוימים דומה הזדקנות מוקדמת של 10,11. DKC נגרמים על ידי מוטציות בTERC, טרט, והגנים המקודדים dyskerin, מקטע הטלומרז ליבה, וdyskerin אחר חלבונים הקשורים 12. בממוצע, הטלומרים בחולי DKC הם קצרים יותר מאשר 99% בקבוצת ביקורת באותו גיל. התחלואה העיקרית של המחלה היא כתוצאה מאנמיה אפלסטית, אשר נגרמת על ידי תחזוקה לקויה של תאי גזע hematopoietic. היבטים אחרים של המחלה כגון leukoplakia האוראלי, מסמר ניוון, retardati הנפשיב, ניוון אשכים וסיבוכים ריאתי כל מציעים לקוי פונקציות של תאי רקמת גזע ותאי אב 10, ממצאים בהסכם קרוב עם אלה בדור המאוחר של עכברי נוקאאוט הטלומרז. חולי DKC נוטים תסמונת המיאלודיספלסטית ויש לי שכיחות מוגברת של שאתות ממאירות ברירית. כך, מחסור בהטלומרז בחולים אנושיים משחזר את הפגמים של פונקציות תאי גזע ונטיית גידול שנצפו בעכברי נוקאאוט הטלומרז דור מאוחר. טלומרים קצרים ופעילות גבוהה הטלומרז הם מסימני היכר של הסרטן. כתאים נורמלים או טרום לחלק, תוצאות הפעילות הטלומרז נמוכות או חסרות בסופו של הדבר לשחיקת הטלומרים והפעלת מחסומים סלולריים דומים לאלה עוררו על ידי ה- DNA גדילים כפולים הפסקות (DSBs) 13. כמו DSBs הקלאסי, תפקוד לקוי של הטלומרים הוכח לגרום p53 וקשורים תגובות הסלולר, כגון הזדקנות ו / או apoptosiזה 14,15. על איון מוטאציות של p53, רכיבה על אופניים תא והישרדות תא משופרים בתאים עם תפקוד לקוי של הטלומרים, שמספק מנגנון המוטטורי פרו-מסרטנת המאופיין בטרנסלוקציות וamplifications האזורי ומחיקות 16,17. במקביל, המשיך תפקוד לקוי של הטלומרים וחוסר יציבות כרומוזומלית משתולל קשור (אפילו בתאי null p53) מופיע להגביל התקדמות ממארת מלאה של סרטן מסוג זה. לדוגמא, G4-G5 הדור מאוחר mTERC - / - Ink4a / ארף - / - עכברים הראו שכיחות לימפומה מופחתת באופן משמעותי בהשוואה לעכברי null Ink4a / ארף עקב התשה הטלומרים. במחקר אחר, נגעי adenomatous מתקדמים יותר בG4 mTERT - / - עכברי דקות APC דוכאו באופן משמעותי בהשוואה לעכברי דקות APC בשל מעצר צמיחה משמעותי ואפופטוזיס 18,19.תצפית שהטלומרים תפקוד לקוי-induced חוסר יציבות גנומית מעכבת התקדמות גידול מבקשת הספקולציות כי ההפעלה הטלומרז עשויה לאפשר התקדמות ממארת בחלקו על ידי דיכוי חוסר יציבות גנומית לרמה תואמת ליכולת קיום של תאי הסרטן ו / או p53 תלוי נטרול או מנגנוני מחסום -independent. כדי ללמוד אם הפעלה מחדש telomerase יכולה לעצור או אפילו להפוך הזדקנות של תאי גזע, ואם הפעלה מחדש telomerase יכולה לקדם את יצירת הגידולים על רקע חוסר היציבות גנומית, אנחנו שנוצרנו שני אללים הטלומרז עכבריים מושרה. הראשון הוא 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) היתוך -inducible טרט-קולטן אסטרוגן (ER-mTERT) לדפוק באלל. בהעדר 4-OHT, עכברים הומוזיגוטים לmTERT-ER (mTERT ER / ER המיועד) הן פעילות הטלומרז לקויה ולקיים אותו פנוטיפים ציטוגנטית וסלולריים כmTERT או מ &#39;קונבנציונלייםמודל נוקאאוט TERC. על 4-OHT טיפול, פעילות חלבון טרט-ER ניתן לשחזר לרמות דומות לחלבון האם של טרט 20, 21. אלל השני הוא לדפוק באלל המכיל קלטת LoxP-בלם-LoxP אינטרוניים (LSL- טרט מושרה רומן mTERT); על Cre בתיווך הכריתה של LSL, mTERT מחדש הביע תחת מנגנוני בקרת ביטוי אנדוגני 22.

<table><tbody><tr><td>ערכת מיקרומניפולציה Leica AM6000</td><td>Leica</td><td>לפי ציטוט</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B מיקרוסקופ הפוך</td><td>Leica</td><td>לכל ציטוט</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>מערכות הרדמה וטרינרית</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>תערובת קטמין-קסילזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT אבקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT גלולה</td><td>מחקר חדשני של אמריקה</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (מד 10)</td><td>מחקר חדשני של אמריקה</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>פצע קליפ אפליקציה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>קליפ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA בדיקת טלומר</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA צנטרומר בדיקה</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>צמנט גומי</td><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ' של וולמארט</td><td></td>אלמר</tr><tr><td></td><td></td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

ניצול murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

הטלומרים תפקוד לקוי-induced אובדן שלמות הגנום ואיתות הנזק ל- DNA הקשורים אליו ותגובות מחסום נהגים ותיקים שגורמים לניוון רקמה במהלך הזדקנות. סרטן, עם שיעורי היארעות להגדיל באופן משמעותי עם גיל, מאופיין באורכי הטלומרים קצרים ופעילות הטלומרז גבוהה. כדי לחקור את התפקידים של חוסר תפקוד הטלומרים והפעלה מחדש telomerase בהזדקנות וסרטן, הפרוטוקול מראה כיצד ליצור שתי הטלומרז מושרה עכברי נוק-באללים 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible טרט-קולטן אסטרוגן (ER-mTERT) ולקס -Stopper-לקס טרט (LSL-mTERT). הפרוטוקול מתאר את הנהלים כדי לגרום לתפקוד הלקוי של הטלומרים ולהפעיל מחדש את פעילות הטלומרז בעכברי mTERT-ER וLSL-mTERT in vivo. הנתונים מראים כי הנציג מחדש של פעילות הטלומרז יכול לשפר פנוטיפים ניוונית רקמה הנגרמים על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים. בORDאה כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase ביצירת גידולים, אנחנו שנוצרנו ערמונית PB-Cre4 G4 מודל גידול PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT L / L ומודל לימפומה T-cell הרתי G4 כספומט - / - mTERT ER / ER . הנתונים מראים כי הנציג מחדש telomerase ברקע של חוסר יציבות גנומית הנגרמת על ידי הפרעה בתפקוד הטלומרים יכול לשפר באופן משמעותי היווצרות גידול ב. הפרוטוקול מתאר גם את הנהלים המשמשים לבודד תאי גזע עצבי (NSCs) מmTERT-ER וLSL-mTERT עכברים ולהפעיל מחדש את פעילות הטלומרז בNSCs במבחנה. הנתונים מראים כי הנציג מחדש של הטלומרז יכול לשפר את יכולת התחדשות העצמית וneurogenesis במבחנה. לבסוף, הפרוטוקול מתאר את הנהלים לביצוע FISH הטלומרים (Fluorescence In Situ הכלאה) על שני FFPE העכבר (פורמלין קבוע וParafרקמות סנפיר Embedded) מוח וכרומוזומים metaphase של תאים בתרבית.

האסטרטגיות ליצירת mTERT-ER העכברי וLSL-mTERT לדפוק באללים תוארו באיור 1 א ו -1 B. באופן ספציפי, LoxP - בלם משולש - ניאו - בר LoxP הוכנס בין אקסון 1 ואקסון 2 של מוקד mTERT ליצור אלל LSL-mTERT. כדי ליצור אלל mTERT-ER, תחום ERT2-LBD במסגרת עם גן mTERT היה מוכנס לתוך N-הסופי של אקסון 1. הראינו כי כאשר הטלומרז היה מחדש זמני בעכברי תפקוד לקוי של הטלומרים תוך התייחסות אליהם עם כדורי 4-OHT במשך 4 שבועות, פנוטיפ ניוונית יכולים להשתפר באיברים רבים כגון המוח (איור 2 א) ואשכים (איור 2). על מנת לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase על תאים בתרבית במבחנה, אנחנו מבודדים תאי גזע עצביים (NSCs) מG4 הדור מאוחר LSL-mTERT וG4 mTERTעכברי -er. אנחנו הראיתי שכאשר הטלומרז היה מחדש בNSCs מתפקד הטלומרים, יכולת ההתחדשות העצמית של NSCs גדלה במידה רבה (איור 3 א), ובneurogenesis המבחנה גם היה משופרת באופן משמעותי (איור 3). על מנת לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש telomerase ביצירת גידולים בהקשר של חוסר תפקוד הטלומרים, שנוצרנו PB-Cre4 PTEN L LSL-mTERT / L (מודל ערמונית גידול) / p53 L L / L L והכספומט - / - mTERT ER / ER (מודל הרתי T-cell lymphoma) קבוצות דור מאוחר. כאשר הטלומרז היה מחדש על ידי הטיפול בטמוקסיפן בעכברים אלה עם הזרקה (איור 4 א) או כדורי 4-OHT במשך 8 שבועות (איור 4), יצירת הגידולים היו מאוד משופר בשני מודל הגידול בערמונית (איור 4 א) ודגם T-cell lymphoma הרתי ( <stron<html> g&gt; איור 4). לבסוף, דיווחנו פרוטוקולים של ביצוע FISH הטלומרים ברקמות מוח עכבר FFPE (איור 5) וכרומוזומים metaphase (איור 5, הבלעה). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> איור 1: (א) mTERT-ER לדפוק באסטרטגיה. טלוויזיה, מיקוד וקטור; WT, אלל סוג בר; KI, לדפוק באלל; LA, זרועו השמאלית; RA, יד ימין; E1, אקסון 1; E2, אקסון 2; ניאו, PGK אמרגן מונע גן עמיד נאומיצין; ER, קולטן אסטרוגן שונה יגנד (ERT2) מחייב תחום; DT, dyphteria גן רעלן. אסטרטגית LSL-mTERT (B) לדפוק ב. טלוויזיה, מיקוד וקטור; WT, אלל סוג בר; KI, לדפוק באלל; LA, זרועו השמאלית; RA, יד ימין; E1, אקסון 1; E2, אקסון 2; ניאו, PGK אמרגן מונע גן עמיד נאומיצין; פקק, שלושה רצפי תחנת תעתיק חוזרים ונשנים; DT, dyphteria גן רעלן. class = &quot;jove_content&quot; fo: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> איור 2: נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase קילה פנוטיפים ניווניות של איברי נציג תמונות של מוח (משמאל). ואשכים (מימין) של עכברי G0 וG4 mTERT-ER שטופלו בפלצבו או 4-OHT במשך 4 שבועות. ברים בקנה מידה מצביעים על 50 מיקרומטר. Re-ההדפסה באישור 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> איור 3:. נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase משפר התחדשות עצמית וneurogenesis של תאי גזע עצביים במבחנה () נציג תמונות של תאי גזע עצבייםs מבודדת מG4 LSL-mTERT (פנל עליון) וG4 mTERT-ER (פנל תחתון) גדל במדיום בתאי גזע שטופל ברכב או 4-OHT. (ב) נציג תמונות של במבחנה neurogenesis (Tuj1 +) של תאי גזע עצביים המבודדים מG4 mTERT-ER תרבית בינוני בידול (עם 1% FBS) שטופלה ברכב או 4-OHT. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> איור 4:. נציגי נתונים כדי להראות מחדש telomerase משפר יצירת גידולים על רקע חוסר היציבות גנומית () נציג תמונות של גידולי ערמונית גזורים מG0 PB-Cre4 PTEN L / p53 L L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB- Cre4 PTEN L L p53 / L / L LSL-mTERT- / -, ו- L / p53 L G4 PB-Cre4 PTEN L טופל LSL-mTERT L / L / L בטמוקסיפן. להדפיס מחדש באישור 22. (ב) נציג תמונות של לימפומות T-cell הרתי גזור מG0 כספומט - / - mTERT + / ER, G4 כספומט - / - mTERT ER / ER טופל ברכב, וG4 כספומט - / - mTERT ER / ER טופל ב4- OHT במשך 8 שבועות. ברים בקנה מידה מצביעים על 1 סנטימטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> איור 5: נציג תמונות של telomeric וFISH centromeric על רקמת עכבר FFPE המוח וmetaphase (הבלעה). אדום מציין DNA, ירוק מציין מכתים הטלומרים, וציאן מציין ceצביעת ntromere. ברים בקנה מידה מצביעים על 1 מ&quot;מ.

טלומרים וטלומראז ממלאים תפקידים חיוניים בהזדקנות ובגידולים. מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד ליצור שני אללים של טלומראז הניתנים להשראת עכברים וכיצד להשתמש בהם במחקרים על ניוון/התחדשות רקמות וסרטן.

ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתפעל שני אללים הניתנים להשראה של עכברים לדפוק מייס in vivo ו-in vitro למחקרים של ניוון והתחדשות רקמות ומחקרי סרטן. זה מושג על ידי השתלת טבליות טמוקסיפן הידרוקסי בבעלי חיים כדי להפעיל מחדש את המיימס in vivo. כצעד שני, תאי גזע עצביים מבודדים מבעלי חיים שמטופלים לאחר מכן בהידרוקסי טמוקסיפן כדי להפעיל מחדש את המאסה במבחנה.הקרינה הבאה של טלומרים ב-C שתי הכלאות או דגים מבוצעת הן על תאים מתורבתים והן על רקמות מוח משובצות פרפין פורמליות וקבועות על מנת לבדוק את פעילות המאסה. התוצאות הראו כי טיפולי הידרוקסי טמוקסיפן יכולים להפעיל מחדש את פעילות המאסה, מה שיכול גם להקל על פנוטיפים מזדקנים וגם לקדם היווצרות גידול על סמך בדיקה היסטופתולוגית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי ההזדקנות והסרטן, כגון האם אנו יכולים להאט את תהליך ההזדקנות על ידי ויסות פעילות הטראומה של TH, או כיצד למקד את תומס באופן ספציפי לטיפול בסרטן.מי שידגים את ההליך הזה יהיו המדריך ד"ר טקאשי שינגו וטכנאי אפריל און מהמעבדה שלי. התחל הליך זה עם יצירת האללים של Turt ER ונעילת עצירת נעילה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, עקר את כל הכלים הכירורגיים לפני ההזרקה המשך להרדמת העכברים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הגעה להרדמה עמוקה, הסר את החיה המורדמת מתא האינדוקציה והשאיר את ראשו בתוך הצינור המחובר לתא איזו פלואור.צבטו את כריות כפות הרגליים של העכברים כדי להבטיח שהחיה מורדמת עמוק. שים גם משחה על שתי העיניים על מנת למנוע מהעיניים לצאת החוצה, נגב את גב העכברים בתמיסת יוד פובידון. לאחר מכן, הזריק כדור הידרוקסי טמוקסיפן בשחרור איטי עם טרוקר מדויק מתחת לעור הגב.ודחף את הגלולה עד לקו האמצע בין שתי כתפיים. אטמו את החתך בעזרת קליפ פצע ועקבו אחר העכברים להתאוששות. להרדמה.הוציאו את מוחות העכברים ליום אחד ושמרו על ארבעת המוחות על ידי הסרת פקעות הריח והמוח הקטן. שמור את ארבע רקמות המוח במיליליטר אחד של מדיום תרבית קרה, ואחסן בארבע מעלות צלזיוס. הקפידו לעבד את הרקמה העצבית תוך שעה.קבע את משקל הרקמה כדי לוודא שלא תחרוג ממגבלת 400 מיליגרם לעיכול. הניחו את המוח על מכסה של צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר ומחצו את המוח באמצעות אזמל. בעזרת קצה פיפטה של מיליליטר אחד, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת מלח האיזון של האנק או HBSS.לאחר מכן פיפטה את החלקים בחזרה לצינור של 15 מיליליטר לאחר שטיפה עם צנטריפוגה HBSS ב -300 פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנטנט בזהירות, הוסף 1,950 מיקרוליטר של אנזים שחומם מראש. מערבבים אחד לכל עד 400 מיליגרם רקמה.דגרו את הדגימה בצינור של 15 מיליליטר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מערבבים את הדגימה על ידי היפוך או ניעור הצינור כל חמש דקות. לאחר מכן הכינו 30 מיקרוליטר של אנזים מערבבים שניים לכל דגימת רקמה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר תמיסה, שלושה עד 10 מיקרוליטר תמיסה ארבע.לאחר מכן מוסיפים לדגימה, הופכים בעדינות כדי לערבב, מנתקים את הרקמה באופן מכני באמצעות פיפטת משחה מלוטשת אש רחבת קצה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים, הימנעות איטית מהיווצרות בועות אוויר. יש לדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולהפוך את הצינור כל שלוש דקות. לאחר מכן, החל את תרחיף התאים על מסננת תאים של 70 מיקרון המונחת על צינור של 50 מיליליטר.מרחו 10 מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט או PBS דרך מסננת התאים. לאחר מכן השליכו את מסננת התאים וצנטריפוגה את מתלה התאים ב -300 פעמים G למשך 20 דקות. קבעו את טמפרטורת החדר לאחר הצנטריפוגה שאבו לחלוטין את הסופרנטנט.השעו מחדש את התאים עם מדיום תאי גזע לנפח הנדרש ליישומים נוספים להפעלת מערך טלה במנעולים, נעילת עצירה. תאי גזע עצביים טורט. טפל בתאים עם 100 טמוקסיפן הידרוקסי מיקרו-מולרי למשך יומיים כדי להפעיל תאי גזע עצביים של emase ו-turt.שמור את התאים במדיום תרבית עם 100 טמוקסיפן הידרוקסי מיקרומולרי לביצוע דגי טלומרים. ראשית, הכינו את כרומוזומי המטאפאזה מתאים מתורבתים עבור פורמלין קבוע ופרפין משובץ רקמות או FFPE. יש לחלק את הדגימה בקסילן ולהתייבש בסדרת אתנול למשך חמש דקות כל אחת וב-PBS למשך חמש דקות.לאחר מכן קבע את החלקים ביחס של שלושה לאחד של מתנול לחומצה אצטית למשך שעה עד שעתיים. יבש את החלקים בסדרת אתנול קרה למשך חמש דקות כל אחד ושטוף יבש באוויר ב-XPBS אחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הבא בטבע, הכרומוזומים בפורמלדהיד 4% ב-37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.ייבשו את החלקים בסדרת אתנול קרה כמו קודם וייבשו באוויר לאחר הייבוש, מרחו 12 עד 25 מיקרוליטר מתערובת הכלאת חומצות הגרעין הפפטידיות על כל שקופית. אטום את החלקת הכיסוי עם מלט גומי המפרסם הכנות כרומוזומליות טבעיות וקטעי רקמות ב-80 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר מכן הכלאה בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות בתא לח.לאחר מכן, שטפו את הדגימות בטמפרטורת החדר עם מאגר כביסה למשך 15 דקות פעמיים. לאחר מכן שטפו אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם PBS וטווין 23 פעמים. לבסוף, כתם את השקופיות עם DPI או פלואורסצנציה אדומה רחוקה לבדיקה מיקרוסקופית.כאשר הטלומר הופעל מחדש באופן זמני בעכברים לא מתפקדים של טלומר, ניתן היה לשפר את הפנוטיפים הניווניים במספר איברים כמו המוח והאשכים כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש של הטלומרים על התאים. תאי גזע עצביים שגודלו במבחנה בודדו מעכברי G ארבעה מנעולי נעילה מהדור המאוחר, TURT ו-G ארבעה עכברי ER. כאשר הטלומרים הופעל מחדש בתאי גזע עצביים לא מתפקדים של טלומרים, יכולת החידוש העצמי גדלה מאוד.נוירוגנזה במבחנה שופרה באופן משמעותי גם כדי לקבוע את ההשפעה של הפעלה מחדש של מייז על גידול בהקשר של תפקוד לקוי של טלומר, הפעלה מחדש של מייז על ידי טיפול בטמוקסיפן בוצעה במודל גידול ערמונית. מודל לימפומה של תאי T אנדוטיים. הטיפול הביא לשיפור משמעותי בגידול בשני המודלים.לבסוף, דגי טלומר בוצעו על FFPE, רקמות מוח של עכבר וכרומוזומי מטפאזה. בתמונות אלה, אדום מציין DNA ירוק מציין צביעת טלומרים, וציאן מציין צביעת צנטרומר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל פעילות טראומה ב- mTOR ER ונעילת עצירה, חיות mTOR וקווי תאים, וכיצד להשתמש בהם כדי לחקור את השאלות שלך בסרטן וסוכן.

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

התערבות RNA (RNAi) הוא בעל יתרונות רבים על פני בנוקאאוט הגן נעשה שימוש נרחב ככלי במחקרים גנים תפקודיים. המצאת ה-DNA וקטור מבוססי RNAi הטכנולוגיה הפכה לטווח ארוך הגן מושרה מציאה אפשרי, גם הגדילה את הכדאיות של השתקת...

וקטור מבוסס DNA התערבות RNA ללמוד לתפקד גנים סרטן

הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד תאים חיים ותרבית ראשונית של קווי תאים מיוגניים ופיברובלסטים מרקמת שריר או עור.  מתוארת גם טכניקה לאמורטליזציה של קווי תאים אלה.  בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

כתב יד זה מספק תיאור של המתודולוגיה המשמשת להקמת מודלים של עכברי התמרה-השתלה. ניתן תיאור מפורט של טעויות טכניות שיש להימנע מהן בעת ביצוע השתלות מח עצם. יש להשיג הבנה ברורה של החשיבות של טיטר ויראלי גבוה, טרנספקציה/התמרה והקרנה.

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

אנו מציגים פרוטוקול להפגין מערכת העברת גנים סומאטית הרומן ניצול RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר כדי ללמוד את הפונקציה של גנים גרורות. העופות רטרווירוסים נמסרות intracardiacally כדי להבטיח העברה גנטית לתוך נגעים טרום ממאירים, לא פולשנית של תאי β בלבלב בעכברים בוגרים.

זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי על ידי העברה גנטית לתוך הרומן RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם מאתר

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור רירית רחם דקה אמינה וניתנת לשחזור עם שיעור תמותה נמוך מאוד והידבקויות תוך רחמיות מינימליות על ידי הזרקת 95% אתנול לרחם העכבר תוך 1-3 דקות.

הקמת מודל עכבר של רירית רחם דקה

פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבות, מניפולציה וניתוח CAFs של עכברים, כולל מבחנים פונקציונליים במבחנה/in vivo , טרנסקריפטומיקה וניתוח חישובי. יתר על כן, הוא מתאר פלטפורמה מבוססת אינטרנט שפותחה כדי לנתח את הטרנסקריפטומים הזמינים לציבור של רכיבי סטרומה ואפיתל של לכידת לייזר מאוסף של גידולי סרטן שד אנושיים.

פיברובלסטים הקשורים לסרטן מגידולי חלב של עכברים ככלים למחקרים מולקולריים וחישוביים

חקור שימוש באללים ניתנים להפעלה של טלומרז בעכברים לחקר ניוון רקמות, התחדשות וסרטן. השיטה כוללת הפעלה מחדש של טלומרז באמצעות הידרוקסי טמוקסיפן בחיות ובתרביות תאי גזע עצביים.

ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

גלה סרטונים נוספים