לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לעקוב אחר הנדידה והאינטראקציה של לויקוציטים במחלה דלקתית מתקדמת בכבד. להבין טוב יותר את רצף האירועים העומד בבסיס האופן שבו תאים אלה מגויסים לרקמת הכבד ואת מעורבותם הפוטנציאלית באימונופתולוגיה. זה מושג על ידי ביצוע טרכאוטומיה תחילה כדי להשיג שליטה על הנשימה של העכבר, צעד מכריע להבטחת הישרדות ארוכת טווח של בעל החיים.

כצעד שני, העכבר עובר לפרוטומיה כדי לחשוף את הכבד בניתוח, מה שנותן גישה לאיבר באמצעות מיקרוסקופ רב פוטונים. לאחר מכן, הכבד מקובע וממוקם על ידי הטמעתו בעלה כדי למזער את חפצי התנועה. ניתן לבצע הדמיה במשך מספר שעות המובילות לרצפי זמן-lapse ברזולוציה גבוהה העוקבים אחר השינויים בגיוס, מיקום ואינטראקציה של לויקוציטים בודדים.

בתהליך התפתחות דלקת בכבד, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום דלקת כבד חריפה וכרונית, כגון גיוס לויקוציטים, אינטראקציות בין תאים או מנגנונים של אימונופתולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה למיקרוסקופיה קונבנציונלית הוא שמיקרוסקופיה מולטיפוקל מאפשרת הדמיה לטווח ארוך כמעט ללא הפרעות דגימה עם הלבנת סייח נמוכה או פוטוטוקסיות, כמו גם פרוסות אופטיות עד 100 מיקרומטר לעומק הרקמה, וזאת בשל הפיזיקה הייחודית של הלייזר של אור הלייזר האדום הרחוק. ובכן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מחלות כבד.

ניתן לאמץ אותו בקלות למערכות אחרות. מאז שיטת הייצוב והקיבוע, ניתן ליישם את הרקמה כמעט על כל השאלות של מיקרוסקופיה תוך חיונית, כך שהיא יכולה בקלות לדמות איברים כמו טחול, כליות או אפילו גידולים תת עוריים באמצעות תאים קשורים שוטפים. אפשר גם לדמיין את כל תת-הקבוצות של הלויקוציטים ולשלוח פנימה את האינטראקציות שלהם ואת דלקת הכבד.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל המורכבות הקיצונית של ניתוחים בבעלי חיים קטנים. עם זאת, בשל הניסיון שלנו, זהו רק גורם מגביל לכמה שבועות ורק צריך קצת ידיים בשגרה בשל שבריריות רקמת הכבד, שלבי ההכנה קשים ללמידה, והדגמה חזותית של השיטה חיונית. לאחר הגדרת חומרי ההרדמה, מלאו את שלב הארו של העכבר ב-3%aros, ושפכו אותו פנימה בזווית של 40 מעלות.

לאחר מכן יש לוודא שאזור העבודה הניתוחי מחוטא במלואו, כמו גם כל המכשירים הנדרשים וכן הלאה. ואז להרדים את העכבר בזריקה תוך-צפקית של קוקטייל הרדמה. חמש דקות לאחר מכן, בדקו את הרפלקסים של החיה ולאחר מכן חטאו את העור ומרחו משחה עיניים על העיניים.

כעת, אבטח את העכבר לשולחן ההכנה. בעזרת סרט, מקם אותו כדי לחשוף את הצד הגחוני ולמתוח בעדינות את הצוואר. גומייה המחוברת לחותכות יכולה להשיג זאת.

כעת, בצע את החתך הראשוני מתחת לסנטר באורך של כ-0.5 עד סנטימטר אחד. לאחר מכן נתחו בזהירות את רקמת החיבור בין בלוטות הרוק ומצאו את צינור השרירים המקיף את קנה הנשימה. קרע בעדינות את השריר כדי לחשוף את קנה הנשימה.

משוך חוט מתחת לקנה הנשימה, ואז פתח את קנה הנשימה בעזרת מספריים מיקרו באמצעות חתך בצורת T לתוך החתך. הכנס את צינור האוורור כחצי סנטימטר. קדם את הצינור באמצעות מלקחיים אנטומיים קטנים.

ואז אבטח את הצינור בעזרת תפרים. לאחר מכן, ליתר ביטחון, תפר את הצינור לעור, אטום את החתך בעור באמצעות ציאנואקרילט והדק את הצינור לראש החיה. בעזרת סרט דבק יש לשמור על ההרדמה באמצעות זרימה רציפה של 2% איזו פלואור.

לאחר הכנת העכבר לניתוח, בצע חתך עור קטן מתחת לעצם החזה והאריך את החתך לרוחב מתחת לצלעות משני הצדדים. צרבו את כל כלי הדם החשופים בתהליך זה. כדי למזער דימום, בצע חתך ראשוני קטן במרפק הליניארי כדי לקבל גישה לחלל הבטן.

הרחב את החתך אופקית, אטום את כל כלי הדם ומתן גישה לכבד. כעת, העבירו את העכבר לשלב האגרו וערמו שקופיות משני צידי החיה כדי לעזור לשמור אותו במקומו. ערימות אלו צריכות להתאים לגובה העכבר כך שהבמה לכבד, שתוצב בהמשך, לא תפעיל לחץ מוגזם על הבטן.

כעת, בעזרת תפרים בעצם החזה, משוך את הצלעות. ארבעה תפרים אפס יספיקו לאחר החזרת הצלעות, חתכו את הרצועות המחברות את הכבד והסרעפת חתכו כל הדרך עד אבי העורקים, אך עבדו בזהירות יתרה כדי לא לקרוע או לחתוך את הכלי. חתכו גם את הרצועה המחברת בין הכבד למערכת העיכול.

סובב את העכבר 45 מעלות כדי לשפר את הגישה לאונה הכבד הגדולה יותר. קח תלוש כיסוי רגיל והדביק אותו לאורך קצוותיו כך שלא יהיה חד. הניחו אותו מעל חלל הבטן.

זה ישמש כשלב לכבד למקם את הכבד על הבמה. החלק בזהירות בדיקה של חרט כדורי כפול, או מרית מרופדת מתחת לכבד והחזק את החלק העליון של האיבר. שימוש ברקמות לחות לחץ מכני יפגע באופן מיידי ברקמת הכבד ולכן חיוני לטפל באיבר בזהירות.

לאחר מכן הרם את האונה על המגלשה ומשוך אותה בעדינות למקומה. האונה בדרך כלל תסתיים כפופה או מקופלת בעדינות, נסה לפרוש את הקצוות על ידי הרמת הרקמה בעזרת מרית דקה או רקמה לחה. לאחר מכן, הוסף תומכים רוחביים בצורה של החלקות כיסוי או שקופיות.

ערמו את החלקות הכיסוי כך שיהיו באותו גובה כמו אונת הכבד. השלב והקיבוע של הכבד הוא השלב המכריע ביותר בפרוטוקול. כל מתח מכני, פיתול או לחץ יובילו לנזק מיידי לרקמות או לפחות לפגיעה בזרימת הדם בכלי הסינוסואידים.

כעת, הניחו תלוש כיסוי גדול עם קצוות מודבקים מעל אונת הכבד הנתמכת על ידי התומכים הרוחביים. מקם את החלקת הכיסוי הזו ברמה ככל האפשר. זה לא אמור לסחוט את הכבד.

רקמה לבנה מצביעה על פגיעה בזרימת הדם אלא אם כן ההדמיה תעבור במהירות. כעת יש צורך להחדיר שני צנתרים תוך-צפקיים עצמאיים כדי לספק הרדמה לטווח ארוך וליישם G 5. אלה מורכבים ממחטים בגודל 27 וצינורות סיליקון גמישים.

ואז התחל את זרימתם באמצעות משאבות מזרק. הכנס את הצנתרים לבטן התחתונה ליד הגפיים האחוריות. לאחר חיבור צגים חיוניים לעכבר, הכינו 100 מיליליטר של 3% ב-XPBS אחד.

כאשר הארוס התקרר ל-41 מעלות צלזיוס, הטמיעו בו את הכבד באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר עם מחט בגודל 18. לאחר שהאירוס התקרר, השתמש במרית היידמן כדי להסיר את העודפים ולחשוף שדה ראייה גדול מספיק כדי לסרוק את הכבד. לאחר מכן המשך בסריקה.

לאחר הכנת שדה הראייה, הזז את העכבר מתחת למיקרוסקופ כדי לבחור אזורי סריקה מתאימים להדמיית זמן-lapse. רקמת הכבד נסרקת בעין באמצעות מקור אור לבן חיצוני המזהה שדות מייצגים עם זרימת דם מספקת והפרעה מינימלית בדגימה CXCR שישה עכברים הטרוזיגוטיים GFP נחשפו להדמיית T-P-L-S-M תוך-חיונית כניסוי. חלקם קיבלו זריקה תוך-צפקית של טטרכלוריד כדי לגרום לנזק חריף לכבד.

תאים מודאליים המבטאים GFP היו במעקב על ידי וידאו והמסלולים שלהם הונחו על גבי זה כדי לקבל תמונת מצב של ניידות סלולרית. לאחר מכן העקבות נורמלו. לכבדים רגילים היו תאים עם דפוסי נדידה אקראיים.

כבדים שהוזרקו עם CCI 4 הראו פגיעה בנדידת התאים. במדידת התזוזה הכוללת ממקורם, היה ברור שהייתה לכידת תאים 36 שעות לאחר טיפול CCI 4 באתר הנזק לכבד. ניתן להראות נדידה לקויה על ידי נזק לכבד גם על ידי התוויית מהירות הנדידה של תאים בודדים לאורך זמן, המראה עצירה חלקית לאחר 18 שעות ועצירת נדידה מלאה לאחר 36 שעות.

היה להראות את הירידה במהירות התאים הנודדים כמובהקת סטטיסטית כאשר השוו את התאים לאוכלוסיות. לפיכך, גישה זו מתאימה למעקב אחר שינויים בנדידת תאים ומיקום במחלת כבד מתפתחת. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את הכבד של עכבר למיקרוסקופיה רב-צילומית תוך-חיונית.

השיטה שאנו מספקים כאן מאפשרת לנו לייצב את בעל החיים להישרדות לטווח ארוך כמו גם למזער חפצי תנועה בשל שיטת הקיבוע העדינה שאנו מספקים. לאחר המסכה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי במהלך הליך זה, חשוב לשלוט בפרמטרים החיוניים של בעלי החיים המייצבים את הטמפרטורה, הדופק, החמצן ורמות ה-CO2. ניתן להשיג זאת על ידי התאמת עומק הנמק והנשימה בעקבות טכניקה זו.

ניתן לבצע הליכים אחרים כמו ניתוח ציטומטריית זרימה או לכידת לייזר מיקרו דיסקציה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הפנוטיפ של תאי החיסון החודרים או מתווכים המופרשים על ידי רקמה או תאים חודרים לאחר התפתחותו. טכניקות אלה אפשרו לחוקרים לקבל תובנה לגבי הדינמיקה של תנועת לויקוציטים ואינטראקציות תאיות בכבד, מה שמאפשר לנתח את רצף האירועים המובילים למחלות כבד דלקתיות. אנא עקוב אחר הנחיות אבטחת הלייזר ביצוע הדמיה עם לייזר אינפרא אדום דופק באנרגיה גבוהה המשמש למיקרוסקופיה מרובת תמונות.

ודא ששום השתקפות של קרינת לייזר לא עלולה לגרום לסכנה לעיניים ולעור שלך בזמן ביצוע ניסוי זה.