לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter
24 במרץ 2015
הדמיה תוך-חיונית יציבה ברזולוציה גבוהה של תאי חיסון בכבד היא מאתגרת. כאן אנו מספקים שיטה רגישה ואמינה ביותר לחקר נדידה ואינטראקציות תאים-תאים של תאים חיסוניים בכבד עכבר לאורך תקופות ארוכות (כ-6 שעות) על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר רב-פוטוני תוך-חיוני בשילוב עם ניטור טיפול נמרץ.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לעקוב אחר נדירה ואינטראקציה של לוקוציטים במחלה דלקתית מתקדמת של הכבד. זאת כדי להבין טוב יותר את רצף האירועים העומד בבסיס גיוס תאים אלו לרקמת הכבד ומעורבותם הפוטנציאלית באימונופתולוגיה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ביצוע טרכיאוטומיה כדי להשיג שליטה על נשימת העכבר, שלב מכריע להבטחת הישרדותו ארוכת הטווח של בעל החיים.
כשלב שני, העכבר עובר לפרוטומיה כדי לחשוף את הכבד בניתוח, ובכך לאפשר גישה לאיבר באמצעות מיקרוסקופ מולטי-פוטון. לאחר מכן, הכבד מקובע וממוקם על ידי השקעתו ברוז (agarose) כדי למזער ארטיפקטים של תנועה. ניתן לבצע הדמיה לאורך מספר שעות, מה שמוביל לרצפי time-lapse ברזולוציה גבוהה העוקבים אחר שינויים בגיוס, במיקום ובאינטראקציה של לוקוציטים בודדים.
במהלך התפתחות דלקת של הכבד, שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום דלקות כבד חריפות וכרוניות, כגון גיוס לוקוציטים, אינטראקציות בין תאים או מנגנונים של אימונופתולוגיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה למיקרוסקופיה קונבנציונלית הוא שמיקרוסקופיה מולטיפוקלית מאפשרת דימוי לטווח ארוך עם הפרעה מזערית לדגימה, פHוטוריסס (bleaching) נמוך או רעילות פוטוית נמוכה, וכן חיתוכים אופטיים בעומק של עד 100 מיקרומטר בתוך הרקמה, וזאת הודות לפיזיקה הייחודית של קרן הלייזר באורך גל של אור אדום רחוק. לפיכך, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחלות כבד.
ניתן להתאימו בקלות למערכות אחרות. בזכות שיטת הייצוב והקיבוע, ניתן להחיל את הרקמה על כמעט כל השאלות של מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy), כך שניתן לדגם בקלות איברים כגון טחול, כליה, או אפילו גידולים תת-עוריים תוך שימוש בתאים קשריים זורמים. כמו כן, ניתן להמחיש את כל תתי-האוכלוסיות של הלויקוציטים ולבחון את האינטראקציות ביניהן ואת דלקת הכבד.
בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקשיים בשל המורכבות הרבה של ניתוחים בבעלי חיים קטנים. עם זאת, על פי ניסיוננו, זהו גורם מגביל למשך מספר שבועות בלבד ודורש תרגול מעשי. בשל השבריריות של רקמת הכבד, שלבי ההכנה קשים ללמידה, והדגמה חזותית של השיטה היא חיונית. לאחר הגדרת ההרדמה, מלאו את במת העכבר ב-3%aros, תוך끔 מזיגה בזווית של 40 מעלות.
לאחר מכן, ודאו ששטח העבודה הכירורגי חומא באופן מלא, וכך גם כל המכשירים הדרושים וכולם. לאחר מכן, הרדימו את העכבר באמצעות זריקה תוך-פריטונית (intraperitoneal) של תערובת הרדמה. חמש דקות לאחר מכן, בדקו את הרפלקסים של בעל החיים, חטאו את העור ומרחו משחה עינית בעיניים.
כעת, קבעו את העכבר לשולחן ההכנה. השתמשו בסרט הדבקה כדי למקם אותו כך שהצד הבטני יהיה חשוף, תוך מתיחה עדינה של הצוואר. ניתן להשיג זאת באמצעות גומייה המושחלת על שיני החיתוך.
כעת, בצעו את החתך הראשוני מתחת לסנטר באורך של כ-0.5 עד לסנטימטר אחד. לאחר מכן, בצעו דיסקציה זהירה של הרקמה החיברית בין בלוטות הרוק ואתרו את השפופרת השרירית המקיפה את הקנה. קרעו בעדינות את השריר כדי לחשוף את הקנה.
השחילו חוט מתחת לקנה הנשימה, ולאחר מכן פתחו את קנה הנשימה באמצעות מיקרו-מספריים באמצעות חתך בצורת T לתוך הפצע. הכניסו את צינור ההנשמה למשך כחצי סנטימטר. קידמו את הצינור באמצעות פינצטה אנטומית קטנה.
לאחר מכן, קבעו את הצינור באמצעות תפרים. להגבהה נוספת של רמת הביטחון, תחרו את הצינור לעור, אטמו את החתך בעור באמצעות cyanoacrylate וקבעו את הצינור לראש החיה. בעזרת סרט דבק, שמרו על ההרדמה באמצעות זרימה רציפה של 2% iso fluorine.
לאחר הכנת העכבר לניתוח, בצעו חתך עורי קטן מתחת לעצם הסטרנום והרחיבו את החתך לצדדים מתחת לצלעות משני הצדדים. צלעו את כל כלי הדם שנחשפו בתהליך זה. כדי למזער דימומים, בצעו חתך ראשוני קטן בקו המרכז כדי להשיג גישה לחלל הבטן.
הרחיבו את החתך אופקית, תוך איטום כל כלי הדם ויצירת גישה לכבד. כעת, העבירו את העכבר לבמת האגרו (agro stage) והניחו ערימות של שקופיות משני צדי החיה כדי לסייע בקיבוע שלה. ערימות אלו צריכות להתאים לגובה העכבר, כדי שבמה שתוצב מאוחר יותר עבור הכבד לא תפעיל לחץ מופרז על הבטן.
כעת, באמצעות תפריר בסטרנום (עצם החזה), הרחיקו את הצלעות. תפריר 4-0 יספיק. לאחר הרחקת הצלעות, גזרו את הרצועות המחברות בין הכבד לדיאפרגמה (סרעפת); גזרו עד לאורטה, אך פעלו בזהירות יתרה כדי לא לקרוע או לחתוך את כלי הדם. גזרו גם את הרצועה המחברת בין הכבד למערכת העיכול.
סובב את העכבר ב-45 מעלות כדי לשפר את הגישה לאונה הגדולה יותר של הכבד. קח זכוכית כיסוי סטנדרטית והדבק סרט לאורך קצוותיה כדי שלא תהיה חדה. הנח אותה מעל חלל הבטן.
זה ישמש כבמה להצבת הכבד עליה. החליקו בזהירות גשוש עם ראש כדור כפול, או שפכטל מרופד, מתחת לכבד והחזיקו את החלק העליון של האיבר. שימוש ברקמה לחה יגרום ללחץ מכני שיפגע באופן מיידי ברקמת הכבד, ולכן חיוני לטפל באיבר בזהירות.
לאחר מכן, הרימו את האונה אל על העשייה והניחו אותה בעדינות במקומה. האונה תהיה בדרך כלל כפופה או מקופלת; נסו לפרוס בעדינות את הקצוות על ידי הרמת הרקמה באמצעות שפכטל דק או נייר סופג לח. לאחר מכן, הוסיפו תמיכות צדיות בצורת זכוכית כיסוי או תזריתיות.
ערמו את לביבות הzכסייה כך שיהיו באותו גובה של אונה של הכבד. מיקום וקיבוע הכבד הם השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. כל מאמץ מכני, פיתול או לחץ יובילו לנזק מיידי לרקמה או לפחות להפרעה בזרימת הדם בכלי הדם הסינוסואידליים.
כעת, הניחו כיסוי זכוכית (cover slip) גדול עם שוליים מודבקים בסרט מעל לאונה של הכבד הנתמכת על ידי התומכים הצדיים. מקמו את כיסוי הזכוכית בצורה מאוזנת ככל האפשר. הוא לא אמור למעוך את הכבד.
רקמה לבנה מעידה על זרימת דם לקויה, אלא אם כן הדימות יתבצע במהירות. כעת יש להחדיר שני קתטרים תו-peritoneum עצמאיים כדי לספק הרדמה ארוכת טווח ולהגיש G five. אלו מורכבים ממחטים בכיל 27 ומצינורות סיליקון גמישות.
לאחר מכן, התחילו את זרימתם באמצעות משאבות מזרקים. הכניסו את הקטטרים לבטן התחתונה בקרבת הגפיים האחוריות. לאחר חיבור מדדי סימנים חיוניים לעכבר, הכינו 100 milliliters של 3%aros ב-one XPBS.
כאשר ה-aros התקרר ל-41 °C, הטמיעו את הכבד בתוכו באמצעות מזרק של 5 mL עם מחט במידה 18 G. לאחר שה-aeros התקרר, השתמשו במרית היידמן (heideman spatula) כדי להסיר את העודפים ולחשוף שדה ראייה רחב מספיק לסריקת הכבד. לאחר מכן, המשיכו בסריקה.
לאחר הכנת שדה הראייה, העבירו את העכבר מתחת למיקרוסקופ כדי לבחור אזורי סריקה מתאימים עבור הדמיית time lapse. רקמת הכבד נסרקת בעין באמצעות מקור אור לבן חיצוני כדי לזהות שדות מייצגים עם זרימת דם מספקת והפרעה מינימלית לדגימה. עכברים עם CXCR6 GFP heterozygous הוכפפו להדמיית intravital T-P-L-S-M כניסוי. לחלקם ניתן זריקה תוך-פריטונית של tetrachloride כדי להשרות נזק כבדי חריף.
תאי מודאל המבטאים GFP נעקבו באמצעות וידאו ומסלוליהם הו सुपरפוזו כדי לקבל תמונת מצב של הניידות התאית. לאחר מכן, המסלולים נורמלו. בכבדים תקינים נמצאו תאים בעלי דפוסי נדידה אקראיים.
בכבדים שהוזרק להם CCI four נצפתה פגיעה בנדידה התאית. מדידה של ההעתקה הכוללת מנקודת המוצא הראתה בבירור כי חלה לכידה של תאים 36 שעות לאחר טיפול ב-CCI four באתר הנזק ההפטוצילרי. ניתן היה להוכיח את הפגיעה בנדידה עקב הנזק לכבד גם על ידי שרטוט מהירות הנדידה של תאים בודדים לאורך זמן, אשר הראה עצירה חלקית לאחר 18 שעות ועצירה מלאה של הנדידה לאחר 36 שעות.
ניתן היה להראות כי ההפחתה במהירות התאים הנודדים היא בעלת מובהקות סטטיסטית גם כאשר התאים הושוו כאוכלוסיות. לפיכך, גישה זו מתאימה למעקב אחר שינויים בנדידת תאים ובמיקומם במחלת כבד מתפתחת. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של אופן הכנת כבד של עכבר עבור מיקרוסקופיית רב-פוטונית תוך-חיה (intra vital multi photon microscopy).
השיטה שאנו מציגים כאן מאפשרת לנו לייצב את החיה להישרדות לטווח ארוך, וכן למזער ארטיפקטים של תנועה הודות לשיטת הקיבוע העדינה שאנו מספקים. לאחר ההרדמה, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי. במהלך הליך זה, חשוב לשלוט בפרמטרים החיוניים של החיה: ייצוב הטמפרטורה, קצב הלב, רמות חמצן ו-CO2. ניתן להשיג זאת על ידי התאמת עומק ההרדמה והנשימה בעקבות טכניקה זו.
ניתן לבצע פרוצדורות נוספות, כגון אנליזה של ציטומטריה זרימה או מיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (laser capture microdissection), כדי לענות על שאלות נוספות, למשל בנוגע לפנוטיפ של תאי החיסון המסתננים או למתווכים המופרשים על ידי הרקמה או התאים המסתננים לאחר התפתחותם. טכניקות אלו אפשרו לחוקרים להשיג תובנות לגבי הדינמיקה של תנועת הלוקוציטים ואינטראקציות תאיות בכבד, ובכך אפשרו לנתח את רצף האירועים המוביל למחלות כבד דלקתיות. אנא פעלו לפי הנחיות הבטיחות בלייזר בעת ביצוע דימות באמצעות לייזר אינפרה-אדום בעל פולס באנרגיה גבוהה המשמש למיקרוסקופיה רב-פוטונית.
ודא כי שום השתקפות של קרינת לייזר לא תגרום לסכנה לעיניך ולעורך בעת ביצוע ניסוי זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לדימות אינטראוייטלי (intravital) יציב וברזולוציה גבוהה של תאי מערכת החיסון בכבד, המאפשרת מעקב אחר נדידתם ואינטראקציות ביניהם לאורך תקופות זמן ממושכות. באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר רב-פוטונית אינטראוייטלית, גישה זו מאפשרת ניטור מפורט של התנהגות לוקוציטים במודל עכבר של מחלה דלקתית בכבד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- דימוי תוך-חי (Intravital Imaging)
רקע
- הבנת הדינמיקה של תאי מערכת החיסון בדלקת כבדית היא חיונית להשגת תובנות לגבי אימונופתולוגיה.
- טכניקות דימות לטווח ארוך נחוצות כדי ללכוד את התנהגות הלויקוציטים.
- שיטות קודמות היו חסרות את הרגישות והאמינות הנדרשות לתקופות תצפית ממושכות.
- מחקר זה נותן מענה לאתגרים אלו באמצעות גישת דימות חדשנית.
מטרת המחקר
- לחקירת נדידתם והאינטראקציה של לוקוציטים בכבד.
- להבנת מנגנוני הגיוס של תאי מערכת החיסון במהלך דלקת בכבד.
- לספק שיטה מהימנה לדימות ארוך טווח של תגובות חיסוניות.
שיטות שהשתמשו בהן
- ביצוע טרכיאוטומיה לשם בקרה נשימתית של העכבר.
- לפרוטומיה לחשיפת הכבד לצורך דימות.
- הטמעת הכבד בתוך מדיום להפחתת ארטיפקטים של תנועה.
- מיקרוסקופיית סריקה לייזר רב-פוטונית בשיטה אינטרה-ויטלית (Intravital) לדימות ברזולוציה גבוהה.
תוצאות עיקריות
- דימוי מוצלח לטווח ארוך של נדידת לוקוציטים ואינטראקציות ביניהם.
- רצפי time-lapse ברזולוציה גבוהה תפסו שינויים בהתנהגות הלוקוציטים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של גיוס תאי מערכת החיסון בדלקת של הכבד.
- הוכחת ההיתכנות של השיטה לחקר תגובות חיסוניות.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת כלי רב-עוצמה לחקר הדינמיקה של תאי מערכת החיסון.
- היא משפרת את הבנתנו לגבי תפקידם של לוקוציטים במחלות כבד.
- ניתן ליישם גישה זו במודלים אחרים של דלקת ותגובה חיסונית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות אינטרה-ויטלי ארוך טווח של דינמיקת תאי מערכת החיסון בכבד מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות למחלות כבד דלקתיות, וזאת באמצעות ויזואליזציה של גיוס לוקוציטים, מיקומם ואינטראקציות ביניהם בזמן אמת. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי קישור התנהגות תאי מערכת החיסון המבטאים CXCR6 להתקדמות המחלה במודלים פרה-קליניים, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בהיפותזות טיפוליות. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת תרכובות אימונו-מודולטוריות תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר נדידה ומיקום של תאי חיסון CXCR6.gfp+ בכבד בריא ובכבד חולה.
- ערך תפעולי: מספק תיקוף פונקציונלי של תתי-אוכלוסיות של לוקוציטים המעורבים באימונופתולוגיה באמצעות תצפית ישירה על אינטראקציות בין תאים.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הדמיה של נדידה לקויה ולכידת תאים במודלים של פגיעה בכבד המושרה על ידי CCl4.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כגון מהירות נדידה, העתקה כוללת ותדירות אינטראקציה, לצורך סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מספק נתוני time-lapse ברזולוציה גבוהה וניתנים לשחזור, עם רעילות פוטו-כימית מינימלית לאורך חלונות דימות של 6 שעות.
- ערך תפעולי: מאפשר פרוטוקולים סטנדרטיים של הכנה וקיבוע המפחיתים את השונות בין ניסויים ומעבדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין דינמיקה של תאי מערכת החיסון לבין התקדמות מחלה על ידי ביסוס מתאם בין התנהגות תאי CXCR6+ לבין נזק כבדי חריף וכרוני.
- ערך תפעולי: מסייע בתיקוף של מודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להערכה אורכית של תנועת לוקוציטים ברקמה שלמה.
- ערך מדעי: תומך בהתאמת ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור בין תוצרי דימות לתוצאות היסטופתולוגיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת מדדים כמותיים ודינמיים של התנהגות תאי מערכת החיסון במיקרו-סביבה של כבד הרלוונטית למחלה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בחינה של השערות בנוגע למנגנוני גיוס לוקוציטים ואינטראקציות עם הסטרומה במחלות כבד דלקתיות.
- סריקה: מספקת הכנה סטנדרטית של רקמה, מוכנה לבדיקה, עם ייצוב של מדדים חיוניים להשגת תנאי דימוי עקביים.
- אנליטיקה: מספקת מדדים מבוססי מעקב, כולל מהירות נדידה, העתקה ומפות אינטראקציה, לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת תצפיות intravital לפנוטיפים של מחלה באמצעות קורלציה עם נזק הפטו-צלולרי המושרה על ידי CCl4.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה לאיברים ולמודלים של מחלות אחרים באמצעות הכנה כירורגית סטנדרטית ומסגרת דימוי intravital.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באימונופתולוגיה המונעת על ידי לוקוציטים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של הרדמה, ניטור סימנים חיוניים וטמיעת רקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) באמצעות ויזואליזציה של מעורבות המטרה ותגובה תאית ברקמה שלמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכון של מועמדים לאימונומודולציה בהתבסס על תצפית ישירה של מודולציה של תאי מערכת החיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, ניהול הרדמה ותפעול מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy).
- תלוי במיקרוסקופים סורקים של לייזר רב-פוטוני עם עירור אדום-רחוק הניתן לכיוונון וגלאים רגישים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ההכנה הכירורגית, ניטור סימנים חיוניים ותהליכי ניתוח תמונות.
- התאמה למודלים אחרים דורשת תיקוף של ייצוב הרקמה וביטוי של חלבון הדגל (reporter) באיברים המטרה.
- מגבלות מעשיות כוללות את המורכבות הכירורגית ואת הצורך בהכשרה מיוחדת לשמירה על חיות בעל החיים במהלך הדמיה ארוכת טווח.
