Name: Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למדו לבצע מבחני תחרות צמיחה זוגיים לקביעת כושר השכפול היחסי של זני HIV-1. השיטה כוללת בניית שכפולי DNA ויראליים, ייצור מלאי ויראלי וניתוח קינטיקת צמיחה באמצעות PCR בזמן אמת וריצוף Sanger.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים אלה מומנו על ידי מענקים של שירותי בריאות הציבור בארה"ב P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 והליבה לפרופיל פונקציונלי וביולוגיה חישובית של המרכז לחקר האיידס באוניברסיטת וושינגטון (P30 AI027757).

<ol><li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+viral+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38(2010).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness%3A+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li>
<li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+%28CTL%29+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C%3A+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463(2010).</li>
<li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes%3A+implications+for+the+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li>
<li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+infection%2Fcompetition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li>
<li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22B+and+C.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li>
<li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li>
<li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q%2FE+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li>
<li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A%2C+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%2C+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA%28Lys%2C+3%29+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
<li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li>
<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
<li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in%5BTitle%5D)+AND+%22Japan.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+conserved-element+vaccines%3A+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li>
<li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li>
<li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction</a> (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests">http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests</a> (2014).</li>
<li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li>
<li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065(2013).</li>
<li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li>
<li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. הדעות מובעות בזאת הן של הכותבים ולא צריך להתפרש כרשמי או מייצג את דעותיהם של משרד הגנה האמריקאי או המחלקה של הצבא.

הפרוטוקולים שהוצגו מורכבים משני חלקים עיקריים: הבנייה של שיבוטים רקומביננטי HIV-1 מולקולריים ומבחני תחרות צמיחה. כדי להבחין בין שני וירוסים בתרבית תאי dually נגוע, חשוב שהשיבוטים המולקולריים המתחרים מכילים תגי רצף, אשר יכול להיות מזוהה על ידי assay פריימר-הבדיקה RT-qPCR או על ידי רצף סנגר. פרוטוקול זה עושה שימוש בתגי VifA וVifB, אשר תופסים אותו האזור של HIV-1 VIF NL4-3 ולקודד אותו רצף חומצות אמינו אבל שונה בשש מוטציות נרדפות. מוטציות אלה הוצגו לא להשפיע כושר שכפול נגיפי 20. שיטת שיבוט PCR מבוססת שימוש בפרוטוקול זה מספקת גמישות רבה יותר בבחירת אתרי שיבוט, בהשוואה לשיבוט מבוסס אתר הגבלה. עם זאת, יעילות שיבוט PCR יורדת ככל שעולה הגודל להכניס. המגבלה הנוכחית של הגודל הכנס היא ~ 5 KB 34. לשיבוט PCR מבוסס וmutagenesi אתר מכווןים, השימוש בDNA פולימרז באיכות גבוהה הוא קריטי כדי להקטין את הסיכוי של מוטציות נוספות. שימוש במספר המינימלי של מחזורי PCR צריכים להניב כמויות מספיקות של מוצרים מומלצים גם. מניסיוננו, אנו לא מזהים כל מוטציות נוספות לאחר צעדי mutagenesis PCR מבוססי שיבוט ואתר מכוון שתוארו כאן. עם זאת יש רצף מוצרי ה- PCR כדי לבדוק את כל מוטציות לא רצויות. באופן אידיאלי, צריך להיות resequenced אזור HIV כל הקידוד. לפחות שלוש נקודות זמן דגימה יש לבחון במסגרת שלב הצמיחה המעריכית 9. קינטיקה הצמיחה הנגיפית חייבת להיות ראשון שהוקמה באמצעות דגימה יומית כדי לקבוע את נקודות תקופת התרבות וזמן דגימה המתאימות לתחרות הצמיחה. גורם אחד שמשפיע על קינטיקה צמיחת ויראלי הוא הריבוי של זיהום (משרד הפנים). פרוטוקול זה משתמש משרד הפנים כולל של 0.005 עבור שני monoinfection ותחרות צמיחה, כפי שהוצג להניב יותר roתוצאות חזה מאשר נמוך MOIs 9. יחד עם זאת, ניתן להשתמש MOIs הנמוך להשיג שלב צמיחה המעריכית עוד במידת צורך, אבל על חשבון עקביות תוצאה. פרוטוקול זה מצביע על יחס זיהום ראשוני של 50:50, בהנחה שהבדלי הכושר של הווירוסים הם בדרך כלל לא ידועים מראש. עם זאת, השימוש ביחסים שוויוניים קלט מתאימים כאשר יש נתונים ראשוניים מצביעים על הבדלים משמעותיים בקינטיקה שכפול הנגיפית. במקרים אלה, יחס זיהום של 70:30 מומלץ לאפשר לגילוי הבדל כושר גדול שבו הווירוס פחות בכושר ממוקם בעודף 9. הפרוטוקול לקביעת 50 TCID, קינטיקה צמיחת ויראלי, ועל ביצוע מבחני צמיחת תחרות היו מותאמות באמצעות תת סוג B HIV-1, NL4-3 COTB-p24, וPBMCs מאותו תורם שPBMC הפגין רגישות עקבית ל- HIV זיהום 1 במבחנה. תקופת התרבותונקודות זמן דגימה המוצגות בפרוטוקול זה עשויות להיות מתאים ללימוד וירוסי M קבוצת HIV-1 בPBMCs האנושי. באמצעות PBMCs ממקור יחיד מומלץ מאוד כדי להשיג תוצאות עקביות כשכפול הנגיפי יכול להשתנות בתאי תורם שונים 35. למרות שפחות רצוי, PBMCs אספו מתורמים מרובים יכול לשמש כתחליף ובלבד שאותו המאגר משמש בכל הניסויים. חלופה נוספת היא השימוש בשורות תאים. הפרוטוקול המובא כאן שימש בהצלחה עם קו T-cell CEMx174 23,36. עם זאת, חשוב שהמספרים של תאי זרע הם להשיג צמיחה עקבית תא-מותאם מחדש. קינטיקה צמיחת ויראלי חייבת להיות גם הוקמה מחדש, כפי שהוא עשוי להשתנות בשורות תאים שונות, כדי לקבוע את הנקודות המתאימות בזמן דגימה בשלבי תחרות צמיחה. שתי שיטות שונות כדי לקבוע את היחס הנגיפי לחישוב כושר כלולות בprotocOL. הראשון משתמש RT-qPCR למדוד מספר עותק cDNA ויראלי בכל נקודת זמן דגימה. כושר שכפול נגיפי אז מחושב מהיחס הנגיפי, המבוסס על עותק מספר cDNA. לחלופין, היחס הנגיפי יכול להיקבע על בסיס היחס בין גובה שיא chromatogram באתרי תג VifAB. שתי השיטות הניבו תוצאות דומות (איור 4). שיטת גובה שיא chromatogram יכולה להיות מיושמת על זני HIV-1 אחרים ללא תג רצף מהונדס. לRT-qPCR, השימוש בצבעי יסוד או בדיקות להבחין גרסאות נגיפיות יש להעריך בזהירות ראשונה (ראה 20). עם זאת, RT-qPCR מספק רגישות טובה יותר לדגימות עם כמות קטנה של רנ&quot;א הנגיפי, כמו אלה מנקודת הפעם הראשונה במסגרת שלב הצמיחה המעריכית. מדידה ישירה של cDNA ויראלי גם מאפשרת זיהוי של בעיות טכניות שיכול לנבוע ממיצוי RNA וסינתזת cDNA. באמצעות שיבוטים מולקולריים עם תגי רצף מספק t עלות פתרון יעילo שיטות RT-qPCR, כמו שרק שני זוגות של צבעי יסוד ובדיקות דרושים כדי ללמוד וירוסים מרובים. אסטרטגיה זו גם מונעת את הבעיה וריאציה שיא גובה של ברצף chromatograms בשל בסיסים שכנים 37, כרצף נעשה באותו אתר בכל הווירוסים במחקר. מוצרי ה- PCR הופקו עבור RT-qPCR וסנגר רצף יכולים להיות גם שימוש בשיטות אחרות כדי לקבוע יחס נגיפי כגון רצף תפזורת של שיבוטים בודדים 12,13, HTA 4,7,17,19, או assay קשירת oligonucleotide (OLA) 38 .

כושר שכפול נגיפי מוגדר כיכולת של וירוס לייצר צאצאי זיהומיות בסביבת נתונה 1 והוא גורם תורם חשוב בקביעת השכיחות של גרסת וירוס ברמת האוכלוסייה לאורך זמן 2. כמו במחקרים vivo כושר אינם אפשריים עם וירוסים פתוגניים אדם, כגון HIV-1, שונים במבחנה לשעבר vivo מבחני כושר שכפול פותחו כדי לחקור את ההשפעות על כושר הנובעות מהתנגדות לסמים ומוטציות בריחה חיסוניות, epistasis והאבולוציה אוכלוסיות נגיפיות של 3-6. בין מבחני כושר שונים, מבחני תחרות צמיחה מוכרים להניב אמצעים רגישים יותר ותקפים של הבדלי כושר, כשתיים או יותר גרסאות נגיפיות להתחרות על אותה אוכלוסיית התא תחת בדיוק אותם התנאים סביבתיים, כפי שקורית בvivo 1,7,8. לפני, כמה variab מתחיל ניסויי תחרות צמיחהles צריך להיקבע, כולל השימוש בmultiplicities שונה של זיהום (משרד הפנים), יחס קלט נגיפי, ועיתוי של דגימה לניתוח. יש לנו חקרנו את ההשפעות של פרמטרים אלה על קינטיקה צמיחה נגיפית ועל התוצאות של ניסויי תחרות, וזיהינו גורמי מפתח הכרחיים למדידות חזקות של כושר HIV-1 בתא התרבות 9. בנוסף למשתני assay, יש מגוון של שיטות לquantitating גרסאות נגיפיות בניסויי תחרות צמיחה. 12,13 רצף גורף 10,11 או משובט נעשה שימוש כדי לקבוע את היחס של הווירוסים המתחרים המבוססים על תדרי נוקלאוטיד באתר (ים) של עניין. כושר יחסית נגזר משינויים ביחס זה לאורך זמן. שיטה זו היא נוחה שירותי רצפי DNA זמינים באופן נרחב. רצף אלל ספציפי המקביל השיטה (PASS) מאפשר רצף במספר רב של אתרים וזיהוי של recombinants 14 </sup&gt;, אבל זה גם דורש חומרים כימיים שפותחו במיוחד ומערכות גילוי. בעיקרו של דבר, בשיטות אלה פותחו ללמוד זני נגיפים עם מספר קטן של הבדלי נוקלאוטיד באזור של עניין. שיטות אחרות להשתמש גן כתב קטן 15 או נרדף מוטציות 4,16-18 כתגים להבחין וירוסים מתחרים על ידי רצף, מבחני מעקב heteroduplex (פח&quot;ע) 4,7,17,19 או להפוך תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת תמלול בכמותיים (RT-qPCR) 15,16,18,20, כל מה שיכול להיות שהוחל ללמוד מתחרים זנים ללא קשר לדמיון רצף. צעד נוסף נדרש להציג תגים להגנום נגיפי וassay RT-qPCR גם דורש ריאגנטים ומכשור ספציפיים. מצאנו כי תשואות בתפזורת סנגר רצף תוצאות דומות 9. בעקבות תחרות צמיחה, כושר שכפול נגיפי מוצג ככושר יחסי, או יחס בין כושר tוו גרסאות נגיפיות. הכושר היחסי של וירוס יכול להיות מוגדר כחלק הסופי של גרסה נגיפית המנורמל על ידי החלק הראשוני שלה בבידוד או כהפרש שיעור צמיחת נטו בין שני הווירוסים המתחרים. מצאנו שהשיטה השנייה, שימוש בנקודתי נתוני אורך רק במסגרת שלב הגידול מעריכי, הניבה את התוצאות חזקות ביותר 9,20. במבחנה מבחני כושר משמשים בעיקר ללמוד שיבוטים ביולוגיים 6-8 ושיבוטים מולקולריים זיהומיות של HIV-1. האחרון, שניתן למניפולציה גנטית, לעתים קרובות מועסק כדי לחקור את ההשפעה על כושר ממוטציות מסוימות או רצפים ספציפיים של עניין 3-5,21,22. הפרוטוקולים הבאים מתארים זרימת עבודה מנקודת בניית HIV-1 שיבוטים מולקולריים זיהומיות באורך מלא החדש באמצעות HIV-1 המכילים וקטורי תג רצף, החדרת מוטציות של עניין, מה שהופך את המניות נגיפיות והקמת קינטיקה צמיחת ויראלי, לביצוע assay תחרות צמיחה וחישוב כושר יחסי (איור 1). באמצעות הנהלים המותאמים, יצרנו שלוש מוטציות HIV-1 רקומביננטי ונקבעו כושר שכפולם. השיבוט המולקולרי רקומביננטי נבנה ראשון על ידי החלפת אזור גן איסור הפרסום-p24 HIV-1 של pNL4-3, פלסמיד המכיל הגנום זיהומיות באורך מלא של מעבדה זן HIV-1 NL4-3, עם COTB סינטטי (המרכז-של- עץ, תת סוג B) רצף איסור הפרסום-p24 23 כדי ליצור את מתח אב הטיפוס. שינויי אמינו בודדים (T186M, T242N, וI256V) היו אז הציגו ליצור שלושה שיבוטים מוטציה. כל מוטציה שהתחרתה נגד וירוס אב הטיפוס להתבונן השפעת הכושר של כל מוטציה ברקע הגנטי המסוים. שלוש מוטציות הפגינו רמות משתנות של fsitness שכפול מקלים לנמוך משמעותית מוירוס אב הטיפוס. המוטציה T242N דווחה בעבר שיש fitne מתוןss יעלה 24-26, דומה לתוצאות שמוצגת במחקר זה. עלות הכושר של שתי מוטציות האחרות שלא דווחה בעבר.

<table><tbody><tr><td>בניית שיבוטים</td><td></td><td></td><td></td>רקומביננטיים</tr><tr><td>פריימר כימרי/פריימרים מוטגניים/רצף</td><td>IDT</td><td></td><td>אוליגוס DNA מותאם אישית</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA ו-pNL4-3VifB פלסמיד</td><td></td><td></td><td>אנא צור קשר עם ד"ר ג'יימס מולינס (jmullins@uw.edu)</td></tr> <tr><td>DNA פולימראז בנאמנות גבוהה</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td> <td>נאמנות גבוההThermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg; GeneAmp&reg; מערכת PCR 9700</td></tr><tr><td>צבע טעינת DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb פלוס סולם DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל מהירה</td><td>QIAquick Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>אנזים DpnI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 מוכשר כימית Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>אבקת בסיס מרק Luria</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree פלסמיד מקסי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 מגיב טרנספקציה DNA</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0.22 &#956; צינור עליון מסנן m</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תרבית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאים Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime; s Dulbecco&Prime שונה; s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Phytohemagglutinin (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Human Interleukin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6 צלחת</td><td>באר VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48 צלחת</td><td>באר VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת עם תחתית שטוחה היטב</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת עם תחתית עגולה</td><td>היטב BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td> הר <td>בייקר ביו</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל עם טבעת O</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>ארנב נגד HIV-1 SF2 p24 אנטי סרום</td><td>NIH תוכנית ריאגנטים לאיידס</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>מצע TMB Microwell Peroxidase</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>גורם לכוויות קשות בכל דרכי החשיפה. השתמש בציוד מגן אישי. השתמש רק מתחת למכסה אדים כימי. יש לשטוף מיד עם הרבה מים למשך 15 דקות לפחות.</td></tr><tr><td>HIV p24 תוכנית</td><td>סטנדרטית לאיידס ווירוס הסרטן (NCI-Frederick)</td><td></td><td>לפרטי ההזמנה אנא צרו קשר עם ג'וליאן בס ג'וניור (bessjw@mail.nih.gov);</td></tr><tr><td>http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx קורא מיקרופלייט</td><td>מכשירים</td><td></td> מולקולריים <td>VMax קינטי ELISA קורא מיקרופלטות</td></tr><tr><td>בידוד RNA סינתזת</td><td></td><td></td><td></td>cDNA</tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp ערכת מיני RNA ויראלי</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Bioline Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>מאגר גדיל ראשון&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Rnase</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת qPCR בזמן אמת</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 PCR בזמן אמת&nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; ביטוי גנים מאסטר מיקס</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>קדימה, פריימר הפוך</td><td>IDT</td><td></td><td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>טכנולוגיות</td><td></td><td></td> חיים <td>בדיקה הזמנה מותאמת אישית אופטי</td></tr><tr><td>96 באר צלחת תגובה</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR + רצף</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז (ביולאז)</td> <td>ביוליין</td><td>מאגר Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>פריימר ריצוף</td><td>IDT</td><td></td><td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>ספק שירותי ריצוף DNA</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי אינטרנט GRC</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChromatQuan web tool</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pairwise צמיחת התחרות assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

בדיקות כושר במבחנה הן כלים חיוניים לקביעת התאמה לשכפול ויראלי עבור נגיפים כגון HIV-1. מדידות שונות שימשו כדי להעריך את כושר השכפול הנגיפי, החל ממספר החלקיקים הנגיפיים ליחידת זיהום, קצב הצמיחה בתרבית תאים וכושר יחסי הנגזר ממבחני תחרות גדילה מרובי מחזורים. מבחני תחרות גדילה מספקים מדידה רגישה במיוחד של כושר מכיוון שהנגיפים מתחרים על מטרות תאיות בתנאי גידול זהים. ישנם מספר גורמים ניסיוניים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע מבחני תחרות גדילה, כולל ריבוי הזיהום (MOI), זמני דגימה ושיטות זיהוי ויראליות וחישוב כושר. כל גורם יכול להשפיע על התוצאה הסופית ולכן יש לשקול אותו בזהירות במהלך תכנון הניסוי. הפרוטוקול המוצג כאן כולל שלבים מבניית שיבוט רקומביננטי חדש של HIV-1 ועד לביצוע מבחני תחרות גדילה וניתוח תוצאות הניסוי. פרוטוקול זה משתמש בערכי פרמטרים ניסיוניים שהוכחו בעבר כמניבים תוצאות עקביות וחזקות. נדונות חלופות, מכיוון שיש להתאים כמה פרמטרים בהתאם לסוג התא והנגיפים הנחקרים. הפרוטוקול מכיל שתי שיטות חלופיות לזיהוי נגיפים כדי לספק גמישות מכיוון שזמינות המכשירים, הריאגנטים והמומחיות משתנה בין מעבדות.

כדי לחקור את ההשפעה של שינויי כושר חומצת אמינו בודדים בHIV-1-Gag p24, השתמשנו mutagenesis המכוון oligonucleotide להציג מוטציות לפלסמיד המכיל pNL4-3 23,32,33 גן COTB-p24 HIV-1. מניות ויראלי נוצרו על ידי transfection של תאי 293T ונקטפו לאחר 48 שעות. הערכנו 50% מינון תרבית רקמת זיהומיות (50 TCID) של כל מניות נגיפיות בשיטת ריד Muench-31. TCID 50 של אב הטיפוס והווירוסים שעברו מוטציה נעו בין 10 אפריל - 10 מאי IU / מיליליטר (איור 3 א). קינטיקה הצמיחה של וירוסי רקומביננטי הוקמו בPBMCs מתורם יחיד במשרד פנים של 0.005. RT-qPCR שימש למדידת מספר עותק cDNA ויראלי יומית במשך שישה ימים. כל הווירוסים שעברו מוטציה ואב הטיפוס גדלו באופן אקספוננציאלי בין היום 2 ויום 4, הבא שצמיחה האט נגיפית, כפי שצוין על ידי מדרון ירידה של עליית מספר עותק רנ&quot;א הנגיפי (&lt;3B strong&gt; איור). הירידה בcDNA להעתיק מספר בין 0 היום (המתאים לבידוד) ויום 2 בשל הספיגה של וירוס לתאים והסרת של virions מאוגד על ידי שטיפת היום 1 (צעד 5.1.6). בשלב הצמיחה המעריכית, כל שלוש מוטציות היו קצב איטי יותר צמיחה (ז) מוירוס אב הטיפוס (איור 3 ג). כל שלוש מוטציות היו התחרו נגד וירוס אב הטיפוס במבחני תחרות צמיחה במשרד פנים כולל של 0.005. קינטיקה צמיחת ויראלי בתרבויות dually נגועות היו דומה לזה של monoinfection; שלב הצמיחה המעריכית הנגיפי היה בין ימים 2 ו -4, וצמיחת ויראלי הגיעה לרמה סביב יום 5 (איור 4 א). הבדלי קצב צמיחת ויראלי נגזרו מהשינוי ביחס הנגיפי לאורך זמן. היחס הנגיפי חושבו על בסיס עותק מספר cDNA של ההתייחסות והווירוסים שעברו מוטציה באמצעות RT-qPCR, ועל ידי גבהים שיא השוואהברצף chromatograms באתרי נוקלאוטיד להבחין שני וירוסים (איור 4). הבדלי קצב הצמיחה נקבעו באמצעות שיא הגובה ושיטות מספר עותק רנ&quot;א נגיפיים הניבו תוצאות דומות (איור 4C). היו כל שלוש מוטציות כושר שכפול נמוך מוירוסי אב הטיפוס עם I256V המוטציה שיש הכושר הנמוך ביותר (איור 4C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקולים שהוצגו במאמר זה בניית וירוס הדאגה פרוטוקולי הכנה של HIV-1 שיבוטים רקומביננטי והדור של מניות ויראלי.. פרוטוקולי מבחני כושר הם להקמת קינטיקה צמיחה הנגיפית וקביעת כושר נגיפי יחסי. קווים מקווקווים מייצגים תזרים חלופי לפרוטוקולים. לדוגמא, מוטציה יכולה להיות הציגה ישירות לתוך HIV-1 NL4-3שיבוט מולקולרי מבלי ליצור שיבוט רקומביננטי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> איור 2:. בנייה של שיבוטים מולקולריים רקומביננטי HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 באמצעות הארכת חפיפה () PCR עיצוב פריימרים chimeric. 5 &#39;חצאי צבעי יסוד מכילים את רצף וקטור NL4-3 ו&#39;3 חצאים להכיל את הקצוות של הרצף להוסיף. פריימרים כימרי (ב) משמשים כדי להגביר בר להוסיף, COTB Gag-p24. שברי להוסיף (C) משמשים כצבעי יסוד לPCR שני כדי ליצור פלסמיד רקומביננטי חדש. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> איור 3:. מאפייני צמיחת ויראלי בPBMCs () יומן 10 TCID 50 </sUB&gt; מניות ויראלי. (ב) קינטיקה צמיחת ויראלי בmonoinfections החלה במשרד פנים = 0.005. שיעורים (C) ויראלי צמיחה מעל שישה ימים, כוללים שלב מעריכי צמיחה (ימים 2-4) נגזר מהפנל (B). הערכים המוצגים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל מניסוי אחד. הברים השגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> קביעות צמיחת ויראלי וכושר יחסי () צמיחת ויראלי בתרבויות PBMC dually נגועות: איור 4.. יחסים (B) של וירוסי T242N ואב טיפוס נקבעו באמצעות RT-qPCR או שיטת שיא גובה רצף. (ג) הבדלים נקי נגיפיים שיעור צמיחה (ד) בין המוטציה ווירוסי אב הטיפוס בתרבויות dually נגועות, כפי שמוצג ב(). ערכי ד חושבו FROM נתונים יחס הנגיפיים המוצגים ב( B). הערכים המוצגים מייצגים את הממוצע של שלושה משכפל מניסוי אחד. הברים השגיאה מייצגים 95% מרווחי ביטחון.

תחרות צמיחה בין נגיפים כמעט איזוגניים מספקת מדידה רגישה לקביעת כושר השכפול היחסי. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, תחרות התפשטות וגידול וירוסים ושיטות ניתוח המותאמות להניב תוצאות רגישות ועקביות.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את כשירות השכפול היחסית של זני HIV-1 רלוונטיים. דבר זה מושג תחילה על ידי בניית שיבוטים מולקולריים ויראליים או פלסמידי DNA המכילים רצפי HIV-1 מלאים של השבטים הנחקרים. השלב השני הוא יצירת מלאי ויראלי עבור כל שיבוט מולקולרי באמצעות טרנספקציית DNA.בשלב הבא, קינטיקת הגדילה ושלב הגדילה המעריכית של כל זן של HIV-1 נקבעים באמצעות דגימה אורךית של תרביות תאים המודבקות בזן בודד. השלב הסופי הוא ביצוע תחרות גדילה בזוגות או הדבקה כפולה בתרביות תאים. לבסוף, נעשה שימוש בשעתוק הפוך, quantitative real-time PCR וגבהי שיאים של כרומטוגרם רצף DNA שהתקבלו מ-Sanger DNA sequencing כדי לקבוע את היחסים הוויראליים, המשמשים לאחר מכן לחישוב הכושר השכפולי הוויראלי היחסי.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון זיהום פארה-מונו (para-mono infection) או זיהום כפול בשתי נקודות זמן, הוא שהיא מספקת מדידות רגישות ועמידות יותר של ההבדל בכושר השכפול (replication fitness) בין שני זנים נגיפיים. הפרוטוקולים המוצגים במאמר זה כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, החדרת מוטציות רצויות באמצעות מוטגנזה מכוונת (site directed mutagenesis), הכנת מלאים נגיפיים וביצוע בדיקות כושר כדי לקבוע את קינטיקת הצמיחה הנגיפית ולחשב את הכושר הנגיפי היחסי. סרטון זה ידגים את התחרות לצמיחה ושתי שיטות שונות.כדי לקבוע את היחס הוויראלי לצורך חישוב הכושר (fitness), אנא עיינו בטקסט הפרוטוקול עבור כל שאר הפרוצדורות. כדי להתכונן לבדיקת תחרות הצמיחה, זרעו 3×10⁵ תאי דם פריפריאליים מונונוקליאריים (PBMCs) שעברו סטימולציה של PHA, בנפח כולל של 500 µL לבאר, בלוחית בעלת 48 בארות עם תחתית שטוחה. השאירו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5% carbon dioxide עד לההזרקה. לאחר מכן, הכינו 3 mL של אינוקולום המכיל 6,000 IU עבור כל נגיף.בניסוי טיפוסי, נבדקים מוטנטים מרובים, אך לצורך הדגמה זו, ייבדק מוטנט אחד בלבד מול נגיף הפרוטוטיפ. הכנה נכונה של האינוקולום הנגיפי היא שלב קריטי בהליך זה, שכן ייתכן שיהיה צורך בדילול סדרתי של מלאי הנגיף בעל תיתור זיהומי גבוה מאוד. העבירו 1.5 milliliters מכל אינוקולום נגיפי לשפופרת סטרילית כדי ליצור את אינוקולום הזיהום הכפול.הוסף 500 µL של האינוקולום הכפול ל-PBMCs שעברו גרייה ב-PHA בכל באער של פלטת 48 באערים. נפח התרבית הסופי הוא 1 mL לבאער. חלק 200 µL של האינוקולום הכפול לבאער בשתי פלטות של 96 באערים לצורך בידוד RNA. שמור פלטה אחת כגיבוי. דגור את התאים המחודיים ב-37 °C באטמוספירה של 5% CO2 למשך 16 עד 24 שעות. 16 עד 24 שעות לאחר החדילה, שטוף את התרביות, הסר והשלך 750 µL מהעלי-נוזל (supernatant) של התרבית והוסף 750 µL של מצע Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium מלא וטרי (cIMDM).עטפו את הפלטה בניילון נצמד וסובבו במשך 10 דקות ב-300 g. הסירו והשליכו 750 microliters של הנוזל העליון (supernatant). הוסיפו 750 microliters של cIMDM טרי. דגרו את הפלטות ב-37 degrees Celsius באטמוספירה של 5% carbon dioxide. יש לבחור את זמני הדגימה כך שיכללו לפחות שלוש נקודות זמן בתוך שלב הצמיחה האקספוננציאלית של הנגיף.לאיסוף דגימה, העבר 500 µL של תגבצית התרבית (supernatant) לשפופרת צנטריפוגה של 1.8 mL וסבב במשך דקה אחת ב-3000 g. העבר 200 µL של התגבצית נטולת התאים לשתי פלטות דגימה של 96 בארות לצורך בידוד RNA, כאשר פלטה אחת נשמרת כגיבוי. אחסן את התגבציות בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע בידוד ה-RNA.הוסיפו 500 µL של cIMDM טרי לכל תרבית והחזירו את הפלטה לאינקובטור עד למועד הדגימה הבא. לאחר מכן, מבודל RNA מהדגימות, ולאחריו מתבצע סינתזת CDNA. שתי שיטות לקביעת יחסים ויראליים יודגמו.הראשון באמצעות שעתוק הפוך, PCR כמותי בזמן אמת או RT qPCR, והשני באמצעות גבהי שיאי כרומטוגרמה. עבור qPCR, הכין סדרת מיהולים סטנדרטית בשלוש חזרות של הפלסמיד pNL4-3VifA, עם מיהול פי עשרה בכל שלב, מ-3 × 10⁶ עותקים למיקרוליטר ועד ל-30 עותקים למיקרוליטר. הכן פלטת תגובה ל-qPCR בעלת 96 בארות.כל פלטה צריכה להכיל לפחות ביקורת שלילית אחת, את סדרת המ 희לול הסטנדרטית בשלוש חזרות (triplicate) ושתי חזרות (duplicates) של כל דגימת cDNA. השתמשו בבדיקת ראשית-גשש (primer probe) מסוג vFIA כדי לזהות אותות בביקורות השליליות, בסדרת המ 희לול הסטנדרטית ובחזרה אחת של דגימת ה-cDNA. השתמשו בבדיקת ראשית-גשש מסוג vIFB עם החזרה השנייה של דגימת ה-cDNA. עבור כל תגובת qPCR, השתמשו ב-12.5 µL של qPCR master mix, ב-0.2 µM של ה-qPCR probe, ב-0.8 µM של כל אחת מהראשיתים (primers) הקדמית וההפוכה, וב-1 µL של cDNA. עבור סדרת המ 희לול הסטנדרטית, הוסיפו את המ 희לול הטורי של pNL4-3VifA במקום cDNA. עבור הביקורות השליליות, השתמשו במים או במאפר (buffer) במקום cDNA. הגדירו את פרמטרי מחזורי ה-PCR בהתאם להוראות היצרן להפעלת מכשיר ה-qPCR. חשבו את עקומת הסטנדרט באמצעות נתוני ההגברה מסדרת המ 희לול הסטנדרטית.השוו את נתוני ההגברה של דגימות ה-cDNA לעקומת הסטנדרט כדי לקבוע את מספר העותקים. השתמשו בחישוב קצב הצמיחה הוויראלי או בכלי האינטרנט GRC כדי לחשב את הכושר הוויראלי היחסי. הזינו את מספר עותקי ה-cDNA שהתקבל משלב ה-RT qPCR בפורמט המצוין המוצג. בחירה באפשרות calculate תפיק את ההפרש בקצב הצמיחה הנקי בין שני וירוסים מתחרים. כדי לקבוע יחסים ויראליים באמצעות גבהי שיאי כרומטוגרמה, בצעו הגברת PCR למקטעי HIV-one VIF המכילים את תג הרצף VIFAB באמצעות פריימרים VIF forward ו-VIF reverse. עבור כל תגובת PCR, השתמשו ב-1 µL של cDNA, ב-1XNH-four buffer, ב-1.5 mM של MgCl2, ב-0.2 mM של dNTPs, ב-2.5 U של Taq polymerase, וב-0.45 µM מכל פריימר.הוסף מים עד לנפח סופי של 50 µL. הגדר את פרמטרי מחזורי ה-PCR לשלושה מחזורים של 94 °C למשך דקה אחת, 55 °C למשך דקה אחת ו-70 °C למשך דקה אחת, ולאחריהם 34 מחזורים של 94 °C למשך 15 שניות, 58 °C למשך 30 שניות ו-70 °C למשך דקה אחת. ולבסוף, שלב השמרה ב-4 °C. לאחר מכן טהר את תוצרי ה-PCR באמצעות ערכה זמינה מסחרית ושלח את תוצרי ה-PCR המטוהרים לספק שירותי ריצוף DNA לצורך ריצוף לפי שיטת Sanger.בדקו את ציון איכות הקריאה הממוצע שסופק על ידי שירות הריצוף. אם דיוק קריאת הבסיסים הממוצע נמוך מ-85%, חזרו על הגברת ה-PCR, טיהור תוצרי ה-PCR וריצוף סנגר. השתמשו בכלי הרשת Chromat quantitative כדי לחשב את היחס הוויראלי בכל נקודת זמן.הקלטים הנדרשים הם רצף המנהיג (leader sequence) וקובץ כרומטוגרם של הרצף בפורמט .ab1. הכלי מודד את עוצמת השיא באתר שצוין.יחס עוצמת השיא תואם ליחס בין שני הנגיפים. השתמש בכלי הרשת GRC כדי לחשב כושר התאמה ויראלי יחסי (viral fitness). הקלט הוא גובה שיא הכרומטוגרמה של הרצף שהתקבל באמצעות כלי הרשת הכמותי Chromat בפורמט המפורט שמוצג. כלי הרשת GRC יחשב את ההפרש בקצב הצמיחה נטו בין שני הזנים הוויראליים המתחרים; נבנו אב-טיפוס ושלושה נגיפי HIV מוטנטיים ואופיינה צמיחתם ב-PBMCs. ה-TCID 50 נע בין 10⁴ ל-10⁵ IU למילליליטר. כל הנגיפים צמחו באופן אקספוננציאלי בין היום השני ליום הרביעי.בשלב הצמיחה המעריכית, לשלושת המוטנטים היה קצב צמיחה איטי יותר מאשר לווירוס המקור (prototype). כל מוטנט הועמד בתחרות מול וירוס המקור במבחני תחרות צמיחה ב-MOI כולל של 0.005; קינטיקת הצמיחה הוויראלית בתרביות עם זיהום כפול הייתה דומה לזו של זיהום בודד. שלב הצמיחה המעריכית של הווירוס היה בין היום השני לרביעי, והצמיחה הוויראלית הגיעה למישור (plateau) סביב היום החמישי.ההבדלים בקצב הגדילה הנגיפית נגזרו מהשינוי ביחס הנגיפי לאורך זמן. היחס הנגיפי חושב על בסיס מספר העתקים של cDNA של נגיפי הייחוס והמוטנטים באמצעות RT-qPCR, ועל ידי השוואת גבהי שיאים בכרומטוגרמות של רצפים באתרים נוקלאוטידיים המבחינים בין שני הנגיפים, כאשר המוטנט T242-N מושווה לפרוטוטייפ. בדוגמה זו, ההבדלים בקצב הגדילה שנקבעו באמצעות שתי השיטות הניבו תוצאות דומות.לשלושת המוטנטים הייתה כשירות שכפול נמוכה יותר מאשר לנגיס המקור, כאשר למוטנט I256-V הייתה הכשירות הנמוכה ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע בדיקות תחרות גדילה בזוגות (pair-wise growth competition essays) כדי לקבוע את כשירות השכפול היחסית של HIV-one.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

האזור כתר לולאה רצפים שונים V3 של גליקופרוטאין את פני השטח המעטפה (gp120) של HIV-1 יכול להיות מאופיין מבנית במקרים רבים על ידי קיפול ב סיליקו תפקידים 10-22 של הלולאה באמצעות...

הערכת Dynamic תכונות רלוונטיים Immunologically מבנית השלישון של HIV-1 רצף V3 קראון Loop R2 על ידי מבראשית מתקפל

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

כאן אנו מתארים cytotoxicity הסלולרי ומבחני infectivity סיבוב בודדים המאפשרים סינון המהיר ומדויק של תרכובות כדי לקבוע cytotoxicity הסלולרי (CC 50) וIC 50 ערכים נגד WT וסמים עמידים HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

פתוגנזה של HIV-1 מוגדרת הן על ידי מאפיינים נגיפיים והן על ידי גורמים גנטיים של המארח. כאן אנו מתארים שיטה חזקה המאפשרת מדידות הניתנות לשחזור כדי להעריך את ההשפעה של וריאציה של רצף גן ה-gag על יכולת השכפול במבחנה של הנגיף.

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

מתוארות שיטות להערכת היעילות והרעילות של מולקולות RNA המכוונות לשלבים שלאחר האינטגרציה של מחזור השכפול של HIV-1. שיטות אלו שימושיות לסינון מולקולות חדשות ולאופטימיזציה של הפורמט של מולקולות קיימות.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

למדו לבצע מבחני תחרות צמיחה זוגיים לקביעת כושר השכפול היחסי של זני HIV-1. השיטה כוללת בניית שכפולי DNA ויראליים, ייצור מלאי ויראלי וניתוח קינטיקת צמיחה באמצעות PCR בזמן אמת וריצוף Sanger.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

גלה סרטונים נוספים