Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את כושר השכפול היחסי של HIV זן אחד מעניין. זה מושג על ידי בניית שיבוטים מולקולריים נגיפיים או פלסמידים של DNA המכילים רצפים מעניינים של HIV באורך מלא. השלב השני הוא יצירת מלאי ויראלי עבור כל שיבוט מולקולרי על ידי טרנספקציה של DNA.

לאחר מכן, קינטיקת הגידול ושלב הצמיחה האקספוננציאלי של כל זן HIV אחד נקבעים על ידי דגימה אורכית של תרביות תאים נגועות מונו. השלב האחרון הוא ביצוע תחרות גדילה זוגית או זיהום כפול בתרביות תאים. בסופו של דבר שעתוק הפוך, PCR כמותי בזמן אמת ורצף DNA כרומטוגרמה גבהי שיא המתקבלים מריצוף ה-DNA של סנגר משמשים לקביעת יחסים ויראליים, המשמשים לאחר מכן לחישוב כושר השכפול הנגיפי היחסי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו זיהום פרמינול או זיהום DU, הוא שהיא מספקת מדידות רגישות וחזקות יותר של ההבדל ברשת השכפול בין שני זנים נגיפיים. הפרוטוקולים המוצגים במאמר זה כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV אחד, הכנסת מוטציות מעניינות לפי מוטגנזה מכוונת אתר, יצירת מלאי ויראלי וביצוע מבחני כושר כדי לבסס קינטיקה של צמיחה ויראלית ולקביעת כושר ויראלי יחסי. סרטון זה ידגים לתחרות הצמיחה ושתי שיטות שונות.

כדי לקבוע את היחס הנגיפי לחישוב הכושר, אנא עיין בטקסט הפרוטוקול עבור כל ההליכים האחרים כדי להתכונן לזרע בדיקת תחרות הגידול שלוש פעמים 10 עד החמישי PHA מגרה תאים חד-גרעיניים בדם היקפי או P BMCs בנפח כולל של 500 מיקרוליטר לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 48 בארות. שמור את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני עד לחיסון. לאחר מכן, הכינו שלושה מיליליטר של חיסון המכיל 6,000 יחב"ל לכל נגיף.

בניסוי טיפוסי נבדקים מוטציות מרובות, אך לצורך הדגמה זו תיבדק רק מוטציה אחת כנגד אב הטיפוס של הנגיף. הכנה נכונה של הנגיף באלום היא שלב קריטי בהליך זה. ייתכן שיהיה צורך בדילול סדרתי עם הגבעול הנגיפי עם כותרת זיהומית גבוהה מאוד העברה, 1.5 מיליליטר מכל חיסון ויראלי לצינור סטרילי כדי ליצור את חיסון הזיהום הכפול.

הוסף 500 מיקרוליטר של החיסון הכפול ל-PBMC המעורר PHA. בכל באר של צלחת 48 הבארות. נפח התרבות הסופי הוא מיליליטר אחד לבאר עליון, 200 מיקרוליטר לבאר של החיסון הכפול ל -2 צלחות באר 96

לבידוד RNA שמור צלחת אחת כגיבוי. דגרו על התאים המחוסנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני למשך 16 עד 24 שעות. 16 עד 24 שעות לאחר החיסון יש לשטוף את התרבויות, להסיר ולהשליך 750 מיקרוליטר של התרבית supernatant להוסיף 750 מיקרוליטר של צעיפים טריים שלמים, מדיום דוקוס שונה או C-I-M-D-M.

עוטפים את הצלחת בניילון נצמד ומסובבים במשך 10 דקות. במשקל של 300 גרם, הסר והשליך 750 מיקרוליטר של הסופרנטנט הוסף 750 מיקרוליטר של C-I-M-D-M טרי דגר את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. יש לבחור זמני דגימה כך שיכללו לפחות שלוש נקודות זמן בשלב הצמיחה האקספוננציאלית של הנגיף.

כדי לאסוף דגימה, העבירו 500 מיקרוליטר של תרבית סופרנטנט לצינור צנטריפוגה של 1.8 מיליליטר וסובבו במשך דקה אחת. ב-3000 גרם, העבירו 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט נטול התאים ל-2 96. ובכן לוחות דגימה לבידוד RNA, שוב, שמירת צלחת אחת כגיבוי לאחסן את הסופר נתן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לבידוד RNA.

הוסף 500 מיקרוליטר C-I-M-D-M טרי לכל תרבית והחזיר את הצלחת לחממה עד לזמן הדגימה הבא. לאחר מכן, RNA מבודד מהדגימות, ואחריו סינתזת CDNA. יודגמו שתי שיטות לקביעת יחסים נגיפיים.

הראשון באמצעות שעתוק הפוך, PCR כמותי בזמן אמת או R-T-Q-P-C-R והשני באמצעות Chromatogram Peak Heights. עבור QPCR, הכינו סדרת דילול סדרתי סטנדרטית בשלוש עותקים של הפלסמיד PNL ארבעה שלושה VIFA מדללים פי עשרה בכל שלב משלוש פעמים 10 לששת העותקים למיקרוליטר עד 30 עותקים למיקרוליטר. הגדר צלחת תגובה QPCR של 96 בארות.

כל צלחת צריכה להכיל לפחות בקרה שלילית אחת, סדרת הדילול הסטנדרטית בשלוש עותקים וכפילויות של כל דגימת CD NA. השתמש בבדיקת פריימר A-V-I-F-A כדי לזהות אותות בפקדים השליליים בסדרת הדילול הסטנדרטית ועם עותק אחד של דגימת ה-CDNA. השתמש בבדיקת הפריימר VIFB עם העותק השני של דגימת CD NA עבור כל תגובת QPCR השתמש ב-12.5 מיקרוליטר של תערובת המאסטר QPCR.

0.2 מיקרומולר של בדיקת QPCR. 0.8 מיקרומולר כל אחד מהפריימרים קדימה ואחורה ומיקרוליטר אחד של CD NA לסדרת הדילול הסטנדרטית, הוסף את הדילול הסדרתי של PNL ארבע שלוש VIFA במקום CDNA עבור הבקרות השליליות, השתמש במים או בופר במקום CDNA, הגדר את פרמטרי המחזור של PCR בהתאם להוראות היצרן להפעלת מכונת QP qPCR R. חשב את העקומה הסטנדרטית באמצעות נתוני הגברה מסדרת הדילול הסטנדרטית.

השווה את נתוני ההגברה של דגימות CD NA לעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את מספר העותק. השתמש בחישוב קצב הצמיחה הנגיפי או בכלי האינטרנט GRC כדי לחשב קלט כושר ויראלי יחסי. מספר עותק ה-CDNA שהתקבל משלב RT qPCR R בפורמט שצוין.

מוצג בחירת חישוב תוציא את הפרש קצב הצמיחה נטו בין שני נגיפים מתחרים כדי לקבוע יחסי ויראלים באמצעות גבהי שיא של כרומטוגרמה. PCR להגביר, שברי HIV אחד VIF המכילים את תג הרצף VIF AB באמצעות פריימרים VIF קדימה ו-VIF הפוך. עבור כל תגובת PCR, השתמש במיקרוליטר אחד של CDNA אחד XNH ארבעה מאגר, 1.5 מילימולר של M gcl שני 0.2 מילימולר של DTPs, 2.5 U של TAC פולימראז ו-0.45 מיקרומולר מכל פריימר.

הוסף מים לנפח סופי של 50 מיקרוליטר. הגדר את פרמטרי המחזור של PCR לשלושה מחזורים ב-94 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. 55 מעלות צלזיוס לדקה אחת ו-70 מעלות צלזיוס לדקה אחת, ולאחר מכן 34 מחזורים ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות.

58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-70 מעלות צלזיוס למשך דקה. ולבסוף, החזקה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכה זמינה מסחרית ולהגיש את מוצרי ה-PCR המטוהרים לספק שירותי ריצוף DNA לריצוף Sanger.

בדוק את ציון איכות הקריאה הממוצע המסופק על-ידי שירות הרצף. אם דיוק קריאת הבסיס הממוצע נמוך מ-85%, חזור על טיהור הגברת ה-PCR של מוצרי PCR וריצוף Sanger. השתמש בכלי האינטרנט הכמותי של Chromat כדי לחשב את היחס הנגיפי בכל נקודת זמן.

הכניסות הנדרשות הן רצף המנהיג וקובץ הכרומטוגרמה של הרצף. בפורמט AB one. הכלי מודד את עוצמת השיא באתר שצוין.

היחס בין עוצמת השיא תואם את היחס בין שני הנגיפים. השתמש בכלי האינטרנט GRC כדי לחשב כושר ויראלי יחסי. הקלט הוא גובה השיא של כרומטוגרמת הרצף המתקבל באמצעות כלי האינטרנט הכמותי של Chromat בפורמט שצוין.

הכלי האינטרנטי GRC יחשב את הפרש קצב הצמיחה נטו בין שני הזנים הוויראליים המתחרים, נבנו אב טיפוס ושלושה וירוסים מוטנטיים של HIV ואופיינה צמיחתם ב-pbmc. ה-TCID 50 נע בין 10 לרביעי ל-10 ל-IU החמישי למיליליטר. כל הנגיפים גדלו באופן אקספוננציאלי בין היום השני ליום הרביעי.

בשלב הגידול האקספוננציאלי, לכל שלושת המוטציות היה קצב גדילה איטי יותר מאשר לנגיף האב-טיפוס. כל מוטציה התחרתה נגד נגיף האב-טיפוס במבחני תחרות גדילה ב-MOI כולל של 0.005, קינטיקה של צמיחה ויראלית בתרביות נגועות כפולות הייתה דומה לזו של זיהום מונו. שלב הגדילה האקספוננציאלית של הנגיף היה בין היום השני לרביעי, והצמיחה הוויראלית הגיעה לרמה בסביבות היום החמישי.

ההבדלים בקצב הגדילה הנגיפי נגזרו מהשינוי ביחס הנגיפי לאורך זמן. היחס הנגיפי חושב על סמך מספר עותק ה-CDNA של הייחוס והנגיפים המוטנטיים באמצעות R-T-Q-P-C-R ועל ידי השוואת גבהי שיא בכרומטוגרמות רצף באתרי נוקלאוטידים, תוך הבחנה בין שני הנגיפים, המוטציה T 2 42 N מושווה לאב-טיפוס. בדוגמה זו, ההבדלים בקצב הגידול שנקבעו באמצעות שתי השיטות הניבו תוצאות דומות.

לכל שלושת המוטאנטים היה כושר שכפול נמוך יותר מאשר לנגיף האב-טיפוס, כאשר למוטציה I 2 56 V יש את הכושר הנמוך ביותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע מאמרי תחרות צמיחה של PWIs כדי לקבוע את כושר השכפול היחסי של HIV. אחד.