Name: פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למד שיטת RPA לכימות DNA בזמן אמת עם בקרה פנימית חיובית. הפרוטוקול משתמש במכשיר PCR או במיקרוסקופ עם חימום, ומספק ניתוח נתוני פלואורסצנץ ליצירת עקומת סטנדרט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק מקרן ביל ומלינדה גייטס באמצעות אתגרי Grand בHealth Initiative הגלובלי.

<ol><li>Yoon, J. -Y., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-Chip+Pathogen+Sensors+for+Food+Safety%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-Chip Pathogen Sensors for Food Safety.</a> Sensors. 12 (8), 10713-10741 (2012).</li>
<li>Quintero-Betancourt, W., Peele, E. R., Rose, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+parvum+and+Cyclospora+cayetanensis%3A+A+review+of+laboratory+methods+for+detection+of+these+waterborne+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium parvum and Cyclospora cayetanensis: A review of laboratory methods for detection of these waterborne parasites.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (3), 209-224 (2002).</li>
<li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li>
<li>Asiello, P. J., Baeumner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+isothermal+nucleic+acid+amplification%2C+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review.</a> Lab on a Chip. 11 (8), 1420-1430 (2011).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> PLoS Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Krõlov, K., Frolova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+Rapid+Detection+of+Chlamydia+trachomatis+by+Recombinase+Polymerase+Amplification+Directly+from+Urine+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics+JMD%22%5BJournal%5D)">Sensitive and Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Recombinase Polymerase Amplification Directly from Urine Samples.</a> The Journal of Molecular Diagnostics JMD. 16 (1), 127-135 (2014).</li>
<li>Santiago-Felipe, S., Tortajada-Genaro, L. a, Puchades, R., Maquieira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay+as+a+DNA+amplification-detection+strategy+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.</a> Analytica Chimica Acta. 811 (1), 81-87 (2014).</li>
<li>Kersting, S., Rausch, V., Bier, F. F., von Nickisch-Rosenegk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Plasmodium+falciparum+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+and+lateral+flow+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis.</a> Malaria Journal. 13 (1), 99(2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+test+to+diagnose+cryptosporidiosis%3A+lab+assessment+in+animal+and+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid test to diagnose cryptosporidiosis: lab assessment in animal and patient specimens.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2565-2571 (2014).</li>
<li>Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper+and+plastic+device+for+performing+recombinase+polymerase+amplification+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A paper and plastic device for performing recombinase polymerase amplification of HIV DNA.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 3082(2012).</li>
<li>Loo, J. F. C., Lau, P. M., Ho, H. P., Kong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+aptamer-based+bio-barcode+assay+with+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+for+cytochrome-c+detection+and+anti-cancer+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">An aptamer-based bio-barcode assay with isothermal recombinase polymerase amplification for cytochrome-c detection and anti-cancer drug screening.</a> Talanta. 115 (1), 159-165 (2013).</li>
<li>Euler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+recombinase+polymerase+amplification+assays+for+detection+of+biothreat+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for detection of biothreat agents.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1110-1117 (2013).</li>
<li>Abd El Wahed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+assay+for+rapid+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.</a> PloS One. 8 (8), e71642(2013).</li>
<li>Escadafal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Molecular+Assays+for+the+Detection+of+Yellow+Fever+Virus+in+Low-Resource+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rapid Molecular Assays for the Detection of Yellow Fever Virus in Low-Resource Settings.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (3), e2730(2014).</li>
<li>Hutson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+gondii+RP+Promoters+%26+Knockdown+Reveal+Molecular+Pathways+Associated+with+Proliferation+and+Cell-Cycle+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">T. gondii RP Promoters & Knockdown Reveal Molecular Pathways Associated with Proliferation and Cell-Cycle Arrest.</a> PLoS ONE. 5 (11), 15(2010).</li>
<li>Segall, H. I., Yoo, E., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+detection+of+artificial+replication-competent+lentivirus+of+altered+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 118-129 (2003).</li>
<li>DNA Extraction from Serum. Life Technologies. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dna-extraction-from-serum.html</a> (2014).</li>
<li>Crannell, Z. A., Rohrman, B. A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+HIV-1+DNA+using+Real-Time+Recombinase+Polymerase+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), (2014).</li>
<li>Sollis, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+the+performance+of+HIV+viral+load+technologies+on+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Systematic review of the performance of HIV viral load technologies on plasma samples.</a> PloS one. 9 (2), e85869(2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+use+of+antiretroviral+agents+in+HIV-1-infected+adults+and+adolescents%22">Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents</a>. , Department of Health and Human Services. Washington D.C. 1-166 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

על מנת לקבל נתונים כימות משמעותיים באמצעות אלגוריתם MATLAB, המשתמש חייב לבחור ערכי קלט מתאימים כאשר תתבקשו לעשות זאת. לאחר ביצוע כל תסריט בסעיפים 5 ו -6, כל משתני הקלט שנשלחים באופן אוטומטי בחלון הפקודה ותפוקות נוצרות באופן אוטומטי. בסעיף 5.7 המשתמש יתבקש לבחור סף מדרון. הערך של סף המדרון משפיע על הריבוע של מקדם המתאם (r 2) לכושר. כאשר משתמשים בנתוני הקרינה גלם מיוצאים מCycler תרמית, ערכים בין 2.0 ו -5.0 נוטים להניב r 2 מקדם גבוה. בסעיף 5.8 המשתמש חייב לציין ...

<html> הגברה חומצות גרעין הכמותית היא טכניקה חשובה לזיהוי של איכות הסביבה, foodborne, ופתוגנים שמקורן במים, כמו גם לאבחון קליני. תגובה בזמן אמת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) היא שיטת תקן הזהב לגילוי רגיש, ספציפי, וכמותי של חומצות גרעין, למשל, לHIV-1 בדיקה נגיפית עומס, זיהוי של חיידקים פתוגנים, ובדיקות סקר לאורגניזמים רבים אחרים - 1 3. במהלך זמן אמת qPCR, פריימרים להגביר DNA הפתוגן במחזורים, ואות ניאון שנוצרה היא פרופורציונאלי לכמות ה- DNA המוגבר במדגם בכל מחזור. מדגם המכיל ריכוז לא ידוע של DNA הפתוגן ניתן לכמת באמצעות עקומה סטנדרטית המתייחסת הריכוז הראשוני DNA של דגימות סטנדרטי והזמן שבו אות הניאון מגיעה לסף מסוים (כלומר, סף המחזור, או T C). &quot;Jove_content&quot;&gt; מכיוון שזמן אמת qPCR דורש ציוד יקר תרמית רכיבה על אופניים וכמה שעות כדי לקבל תוצאות, טכניקות הגברה בידוד תרמיות חלופיות, כגון הגברה פולימראז recombinase (RPA), פותחו 4. פלטפורמות אלה בדרך כלל מספקות תוצאות מהירות יותר ולהגביר חומצות גרעין בטמפרטורה נמוכה יותר, בודדת, אשר עשוי להיות מושלמת עם ציוד פחות יקר, יותר פשוט. RPA, שהוא אטרקטיבי במיוחד עבור יישומי נקודה של טיפול, מגביר DNA בדקות, דורש טמפרטורה נמוכה הגברה (37 ° C), ונשאר פעיל בנוכחות של זיהומי 5,6. מבחני RPA פותחו עבור מגוון רחב של יישומים, כוללים ניתוח מזון, זיהוי פתוגן, הקרנת סמים סרטן, וזיהוי של סוכני biothreat 7-12. עם זאת, שימוש בRPA לכימות של חומצות גרעין הוגבל 13,14. בעבודה קודמת, זה היה shown שRPA כמותית בזמן אמת (qRPA) אינו ריאלי 15. כאן, פרוטוקול מפורט יותר ניתן לשימוש בזמן אמת RPA כמותיים לכמת דגימות ידועות באמצעות עקומה סטנדרטית, שיטה שדומה לכימות באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע תגובת RPA על Cycler תרמית לגילוי DNA HIV-1 כהוכחה של קונספט, כמו גם כיצד לפתח שליטה פנימית חיובית (IPC) כדי להבטיח את המערכת מתפקדת כראוי. איסוף נתונים באמצעות Cycler תרמית או ניתוח מיקרוסקופ ונתונים לבניית עקומת סטנדרט באמצעות נתוני אימון גם מפורט. לבסוף, השיטה לכימות דגימות ידועות באמצעות העקומה סטנדרטית עם תסריט מותאם אישית באה לידי ביטוי. טכניקה זו מאפשרת qRPA כימות של דגימות בריכוזים לא ידועים ויש לו יתרונות רבים על פני זמן אמת מסורתי qPCR.

<table><tbody><tr><td>qRPA Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 קדימה פריימר</td><td>משולב טכנולוגיות DNA</td><td>מותאמות אישית DNA אוליגוס</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>HIV-1 פריימר הפוך</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>מותאמות אישית DNA אוליגוס</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GA TTT TTG TAA TTT TTT TTT G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>בדיקת HIV-1</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>אוליגוס DNA מותאם אישית</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>בדיקת IPC</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>אוליגוס DNA מותאם אישית</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GA ATA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>ריאגנטים exo RPA (כדורים, מאגר התייבשות, מגנזיום אצטט</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp רצועות צינור PCR אקסו</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR רצועות צינור מכסה שטוח</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>דבק מיקרו-אטם</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>יעד HIV-1 (pHIV-IRES- eYFP&Delta; סביבה ודלתא; Vif&Delta; Vpr)</td><td></td><td></td> <td>פלסמיד מותאם אישית, ראה: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. אפיון וזיהוי של lentivirus בעל יכולת שכפול מלאכותי של טווח מארח שונה. טיפול מולקולרי 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>DNA גנומי זכר</td><td>אנושי יישומי ביוסיסטמס</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 באר בלוק קר</td><td>קול פארמר</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>מחזורי תרמי</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer 1.0 M, pH 8.0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free</td><td>water Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>IPC Development</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryptosporidium parvum IPC template</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>ניתן גם להזמין מטרה סינתטית דו-גדילית מ-IDT אם המשתמש אינו מצויד לעבוד עם C. parvum (חומר זיהומי BSL-2). פריימרים PCR ו-RPA עבור C. parvum תוכננו באמצעות מספר כניסה של GenBank AF115377.1</td></tr><tr><td>פריימר PCR קדימה</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>מותאמות אישית DNA oligos</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr><tr><td>PCR ארוך הפוך פריימר</td><td>משולב DNA טכנולוגיות</td><td>DNA מותאם אישית</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelty DNA פולימראז ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X מאגר</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>ניסויי</td><td></td><td></td><td></td>מיקרוסקופ</tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>מחמם</td><td>במה כלים ביו-מדעיים</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>1 ערוץ דיוק יציבות גבוהה בקר טמפרטורה</td> כלים <td>ביו-מדעיים</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP קוביית מסנן</td><td>זייס</td><td>סט מסננים 38 (000000-1031-346)</td> <td>עירור BP 470/40 ננומטר, פליטה BP 520/50 ננומטר</td></tr><tr><td>קוביית מסנן HEX</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>עירור BP 530/30 ננומטר, פליטה BP 575/40 ננומטר</td></tr><tr><td>חותך לייזר</td><td>רשת חרט</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8 אינץ' אקריליק שחור</td><td>מקמאסטר קאר</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"מ אקריליק שקוף</td><td>מקמאסטר קאר</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סופר דבק</td><td>אופיס דיפו</td><td>דורו סופר דבק&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי בדרגת PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח</td><td></td><td></td><td></td>נתונים</tr><tr><td>Microsoft</td> Excel <td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB סקריפט : "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>כלול בתסריט SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>כלול בתסריט SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>כלול ב-SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>כלול ב-SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>כלול בתוכנת SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>כלול ב-SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה assay עם בקרה פנימית חיובית

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

לאחרונה הוכח כי הגברת פולימראז רקומבינאז (RPA), פלטפורמת הגברה איזותרמית לזיהוי פתוגנים, עשויה לשמש לכימות ריכוז דגימת ה-DNA באמצעות עקומה סטנדרטית. בכתב יד זה, מסופק פרוטוקול מפורט לפיתוח ויישום בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז כמותית בזמן אמת (בדיקת qRPA). תוך שימוש בכימות DNA של HIV-1 כדוגמה, מתוארים כולם הרכבה של תגובות RPA בזמן אמת, עיצוב רצף בקרה חיובית פנימית (IPC) והגברה משותפת של ה-IPC והיעד המעניין. ניתנים הוראות ותסריטי עיבוד נתונים לבניית עקומה סטנדרטית באמצעות נתונים מניסויים מרובים, אשר עשויים לשמש לחיזוי ריכוז הדגימות הלא ידועות או להערכת ביצועי הבדיקה. לבסוף, מתוארת שיטה חלופית לאיסוף נתוני פלואורסצנטיות בזמן אמת עם מיקרוסקופ ומחמם במה כצעד לקראת פיתוח בדיקת qRPA נקודתית. הפרוטוקול והסקריפטים המסופקים עשויים לשמש לפיתוח בדיקת qRPA עבור כל יעד DNA מעניין.

לפני בחירת רצף לשמש IPC בניסויי qRPA עם יעד מועמדי DNA (HIV-1), שליטה פנימית חיובית (IPC) נוצרים והוקרנו ביכולתם להגביר בתגובות qRPA ללא נוכחי DNA HIV-1. מועמדי IPC הם ארוכים יותר מהיעד (HIV-1) DNA כדי למנוע היווצרות IPC מהיווצרות amplicon HIV-1 מתחרה-out. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הדור של שני C. מועמדי parvum IPC אומתו על ידי הנוכחות של 415 ולהקות 435 נ&quot;ב באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה. בתגובות qRPA, מועמד IPC הקצר הציג הגברה קטנה (אי...

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בשיטת quantitative recombinase polymerase simplification כדי לכמת את ריכוז ה-DNA של דגימות לא ידועות. הדבר מושג תחילה על ידי הוספת בקרה חיובית פנימית של DNA מטרה, פריימרים ל-DNA וגששים המסומנים פלואורסצנטית לתגובה. כשלב שני, התגובות מוכנסות למכשיר real-time PCR, המחמם את התגובות כדי להפעיל את האנזימים ומנטר את הפלואורסצנציה של הגששים כדי לזהות את היווצרות האמפליקונים של המטרה והבקרה.בשלב הבא, הנתונים הפלואורסצנטיים מנותחים באמצעות סקריפט להפקת עקומת סטנדרט ולאישור הבדיקה. התוצאות מראות שניתן לכמת דגימות DNA באופן מדויק בטווח של סדר גודל אחד מהריכוז הנכון, בהתבסס על ניסויי האישור ששימשו לכימות של מטרה אחת של DNA של HIV. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון qPCR כמותי בזמן אמת, הוא ש-RPA היא איזותרמית, ולכן אין צורך במכשיר תרמוסייקלר יקר.RPA דורש גם טמפרטורת הגברה נמוכה יותר, עמיד לדגימות מזוהמות, מגביר את המטרה לרמות גילוי תוך דקות, ומשתמש באנזימים ליאפיליים המאפשרים הובלה ואחסון קלים בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל, נקו את כל משטחי משטח העבודה והציוד בתמיסת 50% bleach כדי ליצור מרחב עבודה נקי לפני ההגברה; הוציאו את תמיסת המגנזיום אצטט בריכוז 280 millimolar, את באפר ההידרטציה ואת כדורי התגובה מהמקפיא בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius והפשיתו את התמיסות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר (master mix) על ידי העברה של 383.5 µL של באפר ההידרטציה למבחנה מיקרו-צנטריפוגית חדשה, הוספת 41.6 µL של מים נקיים מנוקליאז (nuclease free water) לבאפר וערבוב במכשיר וורטקס, והעברת 35 µL של מגנזיום אצטט למבחנה נפרדת.החזיר את תמיסות המלאי של מגנזיום אצטט בבופר ההידרציה למקפיא. לאחר מכן, הוצא את הפריימרים והפרובים מהמקרר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הנח אותם בסבירת העבודה של טרום-ההגברה וכבה את האורות כדי למזער את החשיפה לאור. הוסף 27.3 µL מכל אחד מהפריימרים הקדמיים והאחוריים בריכוז 10 µM לתערובת המאסטר (master mix).בשלב הבא, הוסיפו 7.8 µL של ה-HIV 1D NA.Probe המסומן ב-hex בריכוז 10 µM אל התערובת הראשית (master mix) וערבבו את המבחנה ב-vortex. לאחר מכן, החזירו את תמיסות המלאי של הפריימר והפרובה לאחסון. ניתן להוסיף כאן ריאגנטים לבקרת פוזיטיבית פנימית, כפי שמצוין בפרוטוקול הכתוב, להרכבת תגובות ה-QRPA. ראשית, העבירו את כדוריות האנזים המיובשות בהקפאה למבחנות בודדות בתוך שני פסי מבחנות PCR בעלי 8 בארות בגובה נמוך (low-rise). העבירו בעזרת פיפט 37.5 µL של התערובת הראשית לתוך מבחנה המכילה כדורית.ערבבו בעדינות את תכולת המבחנה בעזרת טיפ של פיפט כדי להמיס את המשקע מבלי ליצור בועות. הוציאו את הטיפ מהתגובה בזהירות כדי למנוע איבוד נפח, והקפידו להחליף טיפים של הפיפט בין כל מבחנה. העבירו את המבחנות לבלוק קירור של 96 בארות המקומם בקרח למשך חמש דקות לפחות כדי לקרר את תערובת המאסטר (master mix).בינתיים, טענו את התוכנה של המעגל התרמי עם הפרוטוקול; פריסת הפלטה מפורטת בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, גזרו שני פסים של מדבקות איטום פלסטיק שקופות עבור המיקרו-צינורות, כך שיהיו רחבים מעט יותר מצינורות ה-PCR. כמו כן, הכינו שני מכסים שטוחים לפסי צינורות PCR, והעבירו מנה (aliquot) של תבנית פלסמיד HIV-1 כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב.לאחר מכן, הוסיפו 10 µL מהתבנית (template) למסורת ה-PCR המתאימה. שוב, ערבבו בעדינות את התערובת באמצעות קצה הפ pipette. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 µL של מגנזיום אצטט לכל מכסה של מבחנה, והניחו בעדינות את המכסים על מבחנות התגובה כך שלא יהיו אטומות לחלוטין.ה-magnesium acetate צריך להיות גלוי בבירור דרך המכסה. יש להניח את רצועות מבחורי ה-PCR במיקרו-צנטריפוגה ולסובב את המבחורים במשך 10 שניות כדי לרכז את כל הנוזל בתחתית המבחורה ולהוציא בועות אוויר. ערבוב תמיסת ה-magnesium acetate עם ה-master mix מתניע את תגובת ה-QRPA.העבירו במהירות את מבחנות ה-PCR לבלוק הקירור כדי להפסיק את התגובה. לאחר מכן, הסירו את המכסים באיטיות כדי למנוע זיהום של התגובות ואטמו את המבחנות בעזרת סרט איטום שקוף למיקרו-מבחנות (micros seal film). העבירו את המבחנות למכשיר ה-thermal cycler בהתאם למיקומיהן בסידור הפלטה.סגור את מכסה התרמוצקלר ולחץ על start run. הקפד להגדיר שם קובץ עבור הניסוי עם סיום ההרצה. צפה בנתוני הפלואורסצנציה הגולמיים וייצא אותם לגיליון אלקטרוני, פעולה שתצור קובץ בשם quantification amplification results.לבניית עקומת standard. ראשית, הורד את הסקריפט לעקומת ה-standard, ולאחר מכן פתח את MATLAB או תוכנה דומה לניתוח נתונים. פתח את הסקריפט ולחץ על run כדי להפעילו.הקלידו את מספר קבצי הנתונים שיש לנתח כאשר תתבקשו לכך. לאחר מכן, הקלידו את מספר הדגימות ואת מספר החזרות בכל קובץ אימון. בחלון הפקודות.הקלידו את ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר בבסיס לוג 10 (copies) ששימש לבניית עקומת הסטנדרט ולחצו על Enter. בדוגמה המוצגת כאן, הריכוז הנמוך ביותר הוא log-based 10 copies אחד.לאחר מכן, הקלידו בחלון הפקודות את ההפרש בריכוז בין כל סטנדרט DNA ולחצו על enter. מרווח הריכוז הוא לוג 10 של עותקים. כעת, הזינו בחלון הפקודות את הערך עבור סף השיפוע ולחצו על enter.ערך זה הוא בדרך כלל בין שלושה לחמישה. הקלידו את מספר סטיות התקן מעל הרקע עבור הסף החיובי, המכונה גם Z, ולאחר מכן לחצו על enter; ערכי Z טיפוסיים נעים בין אחד לחמישה. לאחר מכן, הגדירו את הציוד ששימש לאיסוף הנתונים במקרה זה.הקלידו 1 עבור הטרמיקלר (thermal cycler), ולאחר מכן לחצו על Enter. אם קיימת בקרת חיובית פנימית, בחרו את ערך ברירת המחדל או ערך חדש עבור הסף על ידי הקלדת Y או N, בהתאם לצורך בהגדרת סף חדש. לבסוף, בחרו את כל קבצי גיליון החשבון שישמשו לבניית עקומת הסטנדרט.הסקריפט ייבא וינתח באופן אוטומטי את כל הנתונים. בדיקת Realtime QRPA בוצעה על דגימות כפולות שהכילו מספרים שונים של עותקים של HIV 1D NA. תחילתה של הגברה ניתנת לגילוי, המזוהה על ידי עלייה בפלואורסצנציה, התרחשה מוקדם יותר עבור דגימות עם מספר עותקי DNA גבוה יותר מאשר עבור דגימות עם מספר עותקים נמוך יותר. נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים שימשו ליצירת עקומת סטנדרט מהגברה של ריכוזים ידועים של HIV 1D NA. נתונים אלו הותאמו לעקומה מעריכית, וערך ה-R squared מעיד על התאמה גבוהה.העקומה הסטנדרטית שימשה לחיזוי ריכוזים של דגימות DNA נוספות בעלות ריכוז ידוע. התאמת ערך Z למספר אחת מאפשרת חיזוי מדויק של ריכוזי DNA נמוכים. לעומת זאת, ריכוזי DNA גבוהים נחזים טוב יותר עם ערך Z של חמישה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ב-RPA חסרים מחזורים אמיתיים להגבלת קצב הגברת ה-DNA. לכן, יש לשלוט במדויק בקצב ההגברה. עקביות בין הניסויים היא קריטית, ולכן הקפידו להשתמש באותן מנות (aliquots) של פריימרים עבור כל הניסויים.הגנו על רכיבי התגובה מחום ומאור. הוסיפו מגנזיום אצטט מיד לפני תחילת איסוף הנתונים, ושמרו את התגובות בבלוק קירור עד להתחלה. הניסוי.

development-quantitative-recombinase-polymerase-amplification-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ה-PCR הדיגיטלי הדו-צדדי (ddPCR) – שינוי של טכניקת ה-PCR המסורתית השימושית בזיהוי שני סמנים גנטיים שונים בו זמנית. תגובת PCR יחידה מחולקת לטיפות מתחלבות בגודל ננוליטר המועצמות באופן עצמאי, וזיהוי אותות הגברה פלואורסצנטיים בצבעים שונים מחלק הטיפות משמש לחישוב הריכוז ההתחלתי של רצפי המטרה.

PCR דיגיטלי דופלקס לכימות סימולטני של סמנים גנטיים כפולים

כאן, אנו מתארים שיטה לכימות סימולטני של מעגלי כריתת קולטני תאי T (TRECs) ומעגלי כריתת רקומבינציה של מחיקת K (KRECs). בדיקת TREC/KREC יכולה לשמש כסמן של תפוקת בלוטת התימוס ומח העצם.

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ואימות של שיטת PCR כמותית המשמשת לזיהוי וכימות של DNA EHV-2 בנוזלי נשימה של סוסים. פרוטוקול האימות EHV-2 qRT-PCR כולל הליך בן שלושה חלקים: פיתוח, אפיון בדיקת qRT-PCR בלבד ואפיון השיטה האנליטית כולה.

פיתוח ותיקוף של שיטת ה- PCR כמותי עבור Equid ההרפס-2 אבחון בנוזלי הנשימה

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

בדיקות DNA סביבתיות דורשות תכנון קפדני, בדיקות, אופטימיזציה ואימות לפני תחילת איסוף נתוני השדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שייקח את המשתמשים דרך כל שלב של תכנון בדיקת qPCR ספציפית למינים, מבוססת בדיקה לגילוי וכימות של דנ"א של מיני יעד מדגימות סביבתיות.

פיתוח ובדיקה של מבחני PCR כמותיים ספציפיים למינים עבור יישומי DNA סביבתיים

הוראות מפורטות ניתנות לבניית פלואורימטר מודולרי בקוד פתוח התואם לתנורי חימום רבים בעלות נמוכה לביצוע הגברה של חומצת גרעין איסותרמית כמותית בזמן אמת.

פלואורימטר מיניאטורי בקוד פתוח לניטור תגובות הגברה של חומצות גרעין איזותרמיות בזמן אמת בהגדרות מוגבלות במשאבים

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

כדי להקל על הזיהוי המהיר והמדויק של Acinetobacter baumannii, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהגברה רקומבינאז פולימראז (RPA) בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a לזיהוי זיהומי A. baumannii .

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מבוססת Cas12a

למד שיטת RPA לכימות DNA בזמן אמת עם בקרה פנימית חיובית. הפרוטוקול משתמש במכשיר PCR או במיקרוסקופ עם חימום, ומספק ניתוח נתוני פלואורסצנץ ליצירת עקומת סטנדרט.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

גלה סרטונים נוספים