פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית
30 במרץ 2015
מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בפישוט כמותי של פולימראז רקומבינאז כדי לכמת את ריכוז ה-DNA של דגימות לא ידועות. זה מושג על ידי הוספת הבקרה החיובית הפנימית של DNA המטרה, פריימרים של DNA ובדיקות עם תווית פלואורסצנטית לתגובה. כשלב שני, התגובות ממוקמות במכונת ה-PCR בזמן אמת, המחממת את התגובות להפעלת האנזימים ומנטרת את הקרינה של הבדיקות כדי לזהות את יצירת מגברי המטרה והבקרה.
לאחר מכן, הנתונים הפלואורסצנטיים מנותחים באמצעות סקריפט כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית ולאמת את הבדיקה. התוצאות מראות כי ניתן לכמת דגימות DNA במדויק בסדר גודל אחד של הריכוז הנכון בהתבסס על ניסויי האימות המשמשים לכימות DNA מטרה אחת של HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו PCR כמותי בזמן אמת, הוא ש-RPA הוא איזותרמי, ולכן אין צורך במחזור תרמי יקר.
RPA דורש גם הגברה נמוכה יותר לטמפרטורה, סובלני לדגימות מלוכלכות, מגביר את המטרה לרמות הניתנות לזיהוי תוך דקות, ומשתמש באנזימי lly כדי לאפשר הובלה ואחסון קלים בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל לנקות את כל משטחי הספסל והציוד בתמיסה של 50% אקונומיקה ליצירת סביבת עבודה נקייה לפני הגברה מראש, הסר את תמיסת המגנזיום אצטט 280 מילי-מולרי, את מאגר ההתייבשות ואת כדורי התגובה מהמקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר את התמיסות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרכיבו תערובת מאסטר על ידי העברת 383.5 מיקרוליטר של מאגר ההתייבשות לצינור מיקרו פוגה חדש ב-41.6 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז למאגר ומערבולת כדי לערבב ב-35 מיקרוליטר מגנזיום אצטט לצינור נפרד.
החזירו למקפיא את המגנזיום אצטט בתמיסות מלאי חיץ ההתייבשות. לאחר מכן השג את הפריימר והבדיקה מהמקרר של ארבע מעלות צלזיוס. הנח אותם בסביבת העבודה של ההגברה המוקדמת וכבה את האורות כדי למזער את החשיפה לאור ב-27.3 מיקרוליטר מכל אחד מ-10 הפריימרים המיקרומולריים קדימה ואחורה לתערובת המאסטר.
הבא ב-7.8 מיקרוליטר מתוך 10 מיקרו-מולרי hex המסומן HIV 1D NA. בדוק את תערובת המאסטר ומערבל את הצינור. לאחר מכן ניתן להוסיף כאן את הפריימר ואת פתרונות מלאי הבדיקה לריאגנטים לאחסון עבור הבקרה החיובית הפנימית כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט כדי להרכיב את תגובות ה-QRPA. ראשית הניחו את כדורי האנזים המיובשים בהקפאה לתוך צינורות בודדים של שניים, רצועות צינור PCR נמוכות בגובה שמונה בארות פיפטה 37.5 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לתוך צינור המכיל גלולה.
מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה הפיפטה כדי להמיס את הכדור מבלי ליצור בועות. הסר את הקצה מהתגובה בזהירות כדי למנוע אובדן נפח וכדי להקפיד להחליף את קצות הפיפטה בין כל צינור. מעבירים את הצינורות לגוש קר 96 היטב צונן למשך חמש דקות לפחות כדי לקרר את תערובת המאסטר.
בינתיים, טען את תוכנת המחזור התרמי עם הפרוטוקול ופריסת הלוח מצוינת בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, חותכים שתי רצועות של דבקי איטום מיקרו פלסטיק שקופים כך שיהיו מעט רחבים יותר מצינורות ה-PCR. וגם להשיג שני מכסי רצועות צינור PCR שטוחים, ציטוט תבנית הפלסמיד האחת של HIV כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט.
ואז הוסף 10 מיקרוליטר מהתבנית לצינור ה- PCR המתאים. שוב, מערבבים בעדינות את התערובת עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיקרוליטר של מגנזיום אצטט לכל מכסה צינור, ואז הניחו בעדינות את הכובעים על גבי צינורות התגובה כך שהם לא יהיו אטומים לחלוטין.
המגנזיום אצטט צריך להיות גלוי בבירור דרך המכסה. הנח את רצועות צינור ה-PCR לתוך מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגה את הצינורות למשך 10 שניות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור ולהסיר בועות. שילוב תמיסת המגנזיום אצטט עם תערובת המאסטר יוזם את תגובת ה-QRPA.
הסר במהירות את צינורות ה-PCR לגוש הקר כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הסר לאט את המכסים כדי למנוע זיהום התגובות ואטום את הצינורות בסרט איטום מיקרוס שקוף. העבירו את הצינורות למחזור התרמי בהתאם למיקומים בפריסת הצלחת.
סגור את המכסה של המחזור התרמי ולחץ על התחל הפעלה. הקפד לייעד שם קובץ לניסוי בסיום הריצה. הצג את נתוני הקרינה הגולמיים וייצא אותם לגיליון אלקטרוני שייצור קובץ הנקרא תוצאות הגברה של כמות.
לבנות את העקומה הסטנדרטית. ראשית, הורד את סקריפט העקומה הסטנדרטי, ולאחר מכן פתח את MATLAB או תוכנית ניתוח נתונים דומה. פתח את קובץ ה- Script ולחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script.
הקלד את מספר קבצי הנתונים שיש לנתח כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר מכן, הקלד את מספר הדגימות ומספר השכפולים בכל קובץ אימון. בחלון הפקודה.
הקלד את ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר ב-10 עותקים מבוססי לוג ששימשו לבניית העקומה הסטנדרטית ולחץ על Enter. בדוגמה שלפנינו. הריכוז הנמוך ביותר הוא יומן אחד המבוסס על 10 עותקים.
לאחר מכן הקלד את ההבדל בריכוז בין כל תקן DNA בשורת הפקודה ולחץ על Enter כאן. מרווח הריכוז הוא יומן אחד המבוסס על 10 עותקים. לאחר מכן, הזן את הערך עבור סף השיפוע בחלון הפקודה ולחץ על Enter.
ערך זה הוא בדרך כלל בין שלוש לחמש. הקלד את המספר סטיות תקן מעל הרקע עבור סף חיובי, המכונה גם Z ולאחר מכן הקש Enter ערכי Z טיפוסיים בטווח שבין 1 לחמש. לאחר מכן, ציין את הציוד ששימש לאיסוף הנתונים במקרה זה.
הקלד אחד עבור המחזור התרמי ולאחר מכן הקש Enter. אם יש בקרה חיובית פנימית, בחר את ברירת המחדל או ערך חדש עבור הסף על-ידי הקלדת Y או N, בהתאם לשאלה אם יש צורך בסף חדש. לבסוף, בחר את כל קבצי הגיליון האלקטרוני שישמשו לבניית העקומה הסטנדרטית.
לאחר מכן, קובץ ה- Script ייבא וינתח באופן אוטומטי את כל הנתונים. QRPA בזמן אמת בוצע על דגימות כפולות המכילות מספרי עותקים שונים של HIV 1D NA. תחילת ההגברה הניתנת לזיהוי המצוינת על ידי עלייה בקרינה מתרחשת מוקדם יותר עבור דגימות עם מספרי עותקי DNA גבוהים יותר מאשר עבור דגימות עם מספרי עותקים נמוכים יותר. נתוני הקרינה הגולמיים שימשו ליצירת עקומה סטנדרטית מהגברה של ריכוזים ידועים של HIV 1D NA. נתונים אלה התאימו לעקומה מעריכית, והערך בריבוע R מצביע על התאמה טובה.
העקומה הסטנדרטית שימשה לחיזוי הריכוזים של דגימות DNA נוספות בריכוז ידוע. התאמת הערך של Z ל-1 מאפשרת חיזוי מדויק של ריכוזי DNA נמוכים. לעומת זאת, ריכוזי DNA גבוהים צפויים טוב יותר עם ערך Z של חמש.
כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור של-RPA חסרים מחזורים אמיתיים כדי להגביל את קצב הגברת ה-DNA. לכן יש לשלוט במדויק בקצב ההגברה. עקביות בין ניסויים היא קריטית, לכן הקפד להשתמש באותם סימני פריימר עבור כל הניסויים.
הגן על רכיבי התגובה מפני חום ואור. הוסיפו מגנזיום אצטט מיד לפני תחילת איסוף הנתונים, ושמרו את התגובות בבלוק הקר עד להתחלה. הניסוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבדיקת הגברה של פולימראז רקומינז בזמן אמת (real-time recombinase polymerase amplification), שנועדה לכימות ריכוזי DNA בדגימות. השיטה עושה שימוש במכשיר תרמוסייקלר (thermal cycler) או במיקרוסקופ עם מחמם במה, וכוללת פיתוח של בקרת חיובית פנימית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוטכנולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
- גנומיקה
רקע
- ניתוח כמותי של DNA הוא קריטי בתחומי מחקר ביולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות כמו real-time quantitative PCR דורשות מכשירי thermal cyclers יקרים.
- שיטת recombinase polymerase amplification (RPA) מציעה חלופה איזותרמית.
- בקרה חיובית פנימית משפרת את המהימנות של בדיקות כמותיות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לכימות ריכוזי DNA באמצעות RPA.
- יצירת בקרת חיווי חיובית פנימית לשיפור תיקוף הבדיקה.
- אספקת סקריפטים לניתוח נתוני פלואורסצנציה בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תערובות תגובה עם DNA מטרה, פריימרים וגששים פלואורסצנטיים.
- שימוש במכשיר real-time PCR לניטור פלואורסצנציה במהלך ההגברה.
- ניתוח נתונים פלואורסצנטיים ליצירת עקומת סטנדרט.
- תיקוף של הבדיקה באמצעות ניסויים המכמתים DNA מטרה של HIV.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מכמתת במדויק ריכוזי DNA בטווח של סדר גודל אחד.
- ניסויי תיקוף אישרו את יעילותו של בקר החיובי הפנימי.
- RPA הראה יתרונות על פני שיטות PCR מסורתיות.
- הפרוטוקול נגיש לחוקרים שאינם מחזיקים בציוד יקר.
מסקנות
- בדיקת ה-RPA שפותחה היא שיטה מהימנה לכמותיות DNA.
- בקרי חיוביים פנימיים חיוניים לתיקוף הבדיקה.
- שיטה זו עשויה להקל על גישה רחבה יותר לטכניקות של כמותיות DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של DNA היא יכולת בסיסית באישוש מטרות ובפיתוח בדיקות, שבה נתונים מדויקים על הריכוז תומכים בזיהוי מובילים (leads) ובביטחון ניבוי. שיטת ה-qRPA המתוארת מספקת חלופה איזותרמית ל-qPCR, ובכך מפחיתה את התלות בציוד ומאפשרת פריסה בסביבות עם משאבים משתנים. הדבר ממצב את הבדיקה ככלי בר-הרחבה עבור זרימות עבודה של גילוי מוקדם הדורשות כימות מהימן של חומצות גרעיניות ללא תשתית של מעגלי תרמיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות מדויק של מטרות DNA בדגימות מורכבות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אספקת נתוני ריכוז בדיוק של סדר גודל אחד, תוך שימוש בבקרי חיווק פנימיים.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי יצירת עקומות סטנדרט המאפשרות השוואה בין ניסויים והערכת ביצועי הבדיקה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים, החיוניות למידול תגובה למספר ולהערכות מוכנות לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות בקרים חיוביים פנימיים המנטרים את יעילות ההגברה ואת העכבה.
- שביליות: תואם לגילוי מבוסס מיקרוסקופ, מה שמאפשר התאמה לפורמטים של בדיקות בנקודת הטיפול (point-of-care) או לבדיקות מבוזרות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין כימות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות יצירה של עקומת סטנדרט הניתנת לשחזור.
- התאמה של סמנים ביולוגיים: תומך בניטור של סמנים ביולוגיים מבוססי DNA, שבהם שינויים בריכוז מעידים על מעורבות המטרה או על ויסות של מסלול.
- קידום מותאם סיכונים: מספק פלטים כמותיים המנחים החלטות של המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) על ידי הגדרת גבולות גילוי וטווח דינמי.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר נתונים כמותיים של חומצות גרעיניות מכוונים את תעדוף התרכובים ומחקרי מנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על ידי כימות יעדי DNA כדי להעריך אפנון של מסלולים או השפעות של הפרעה גנטית.
- סריקה: מספקת קריאות מבוססות פלואורסצנציה הניתנות לשחזור ומתאימות להתאמה לסריקה בסביבה של תפוקה גבוהה כאשר הן משולבות עם מערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים.
- אנליטיקה: מייצרת עקומות סטנדרט וספי זיוּב Z-score המאפשרים לצוותים להשוות בין תנאים ולאמת את רגישות הבדיקה.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות פרה-קלינית על ידי אספקת מדידות DNA כמותיות המתואמות עם פעילות ביולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמת כימות לשימוש חוזר שניתן להחיל על יעדי DNA שונים, ובכך מפחיתה את מאמצי הפיתוח מחדש עבור בדיקות חדשות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת השונות באמצעות נרמול של בקרת חיובי פנימית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הגברה איזותרמית והגדרת תגובה בבלוק קירור, ובכך ממזער ארטיפקטים תלויי טמפרטורה.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי ביטול הצורך במחזורי תרמיים, ובכך מוריד את חסם הכניסה לניתוח DNA כמותי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד רכיבים בעדיפות מותאמת סיכון באמצעות נתוני ריכוז התומכים במינון מדויק ובמידול חשיפה למטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית בתכנון פריימרים/פרובים ובפירוש נתונים פלואורסצנטיים.
- נדרשת גישה לציוד גילוי פלואורסצנטי, כגון מכשיר real-time PCR או מיקרוסקופ עם מחמם במה.
- דורש סטנדרטיזציה של הטיפול בריאגנטים, כולל עיתוי ההוספה של מגנזיום אצטט ואחסון בבלוק קירור.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי דגימות, במיוחד בנוגע לסבילות למעכבים ולטוהר ה-DNA.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דיוק כמותי של סדר גודל אחד והיעדר מחזורי הגברה אמיתיים הדורשים תזמון מדויק של התגובה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
