Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

Zachary A. Crannell; Brittany Rohrman; Rebecca Richards-Kortum

doi:10.3791/52620

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

Full Text

14,774 Views

08:37 min

March 30, 2015

DOI: 10.3791/52620-v

Zachary A. Crannell*¹, Brittany Rohrman*¹, Rebecca Richards-Kortum¹

¹Department of Bioengineering,Rice University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בפישוט כמותי של פולימראז רקומבינאז כדי לכמת את ריכוז ה-DNA של דגימות לא ידועות. זה מושג על ידי הוספת הבקרה החיובית הפנימית של DNA המטרה, פריימרים של DNA ובדיקות עם תווית פלואורסצנטית לתגובה. כשלב שני, התגובות ממוקמות במכונת ה-PCR בזמן אמת, המחממת את התגובות להפעלת האנזימים ומנטרת את הקרינה של הבדיקות כדי לזהות את יצירת מגברי המטרה והבקרה.

לאחר מכן, הנתונים הפלואורסצנטיים מנותחים באמצעות סקריפט כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית ולאמת את הבדיקה. התוצאות מראות כי ניתן לכמת דגימות DNA במדויק בסדר גודל אחד של הריכוז הנכון בהתבסס על ניסויי האימות המשמשים לכימות DNA מטרה אחת של HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו PCR כמותי בזמן אמת, הוא ש-RPA הוא איזותרמי, ולכן אין צורך במחזור תרמי יקר.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos