פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית
March 30th, 2015
מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בפישוט כמותי של פולימראז רקומבינאז כדי לכמת את ריכוז ה-DNA של דגימות לא ידועות. זה מושג על ידי הוספת הבקרה החיובית הפנימית של DNA המטרה, פריימרים של DNA ובדיקות עם תווית פלואורסצנטית לתגובה. כשלב שני, התגובות ממוקמות במכונת ה-PCR בזמן אמת, המחממת את התגובות להפעלת האנזימים ומנטרת את הקרינה של הבדיקות כדי לזהות את יצירת מגברי המטרה והבקרה.
לאחר מכן, הנתונים הפלואורסצנטיים מנותחים באמצעות סקריפט כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית ולאמת את הבדיקה. התוצאות מראות כי ניתן לכמת דגימות DNA במדויק בסדר גודל אחד של הריכוז הנכון בהתבסס על ניסויי האימות המשמשים לכימות DNA מטרה אחת של HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו PCR כמותי בזמן אמת, הוא ש-RPA הוא איזותרמי, ולכן אין צורך במחזור תרמי יקר.
RPA דורש גם הגברה נמוכה יותר לטמפרטורה, סובלני לדגימות מלוכלכות, מגביר את המטרה לרמות הניתנות לזיהוי תוך דקות, ומשתמש באנזימי lly כדי לאפשר הובלה ואחסון קלים בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל לנקות את כל משטחי הספסל והציוד בתמיסה של 50% אקונומיקה ליצירת סביבת עבודה נקייה לפני הגברה מראש, הסר את תמיסת המגנזיום אצטט 280 מילי-מולרי, את מאגר ההתייבשות ואת כדורי התגובה מהמקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשיר את התמיסות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הרכיבו תערובת מאסטר על ידי העברת 383.5 מיקרוליטר של מאגר ההתייבשות לצינור מיקרו פוגה חדש ב-41.6 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז למאגר ומערבולת כדי לערבב ב-35 מיקרוליטר מגנזיום אצטט לצינור נפרד.
החזירו למקפיא את המגנזיום אצטט בתמיסות מלאי חיץ ההתייבשות. לאחר מכן השג את הפריימר והבדיקה מהמקרר של ארבע מעלות צלזיוס. הנח אותם בסביבת העבודה של ההגברה המוקדמת וכבה את האורות כדי למזער את החשיפה לאור ב-27.3 מיקרוליטר מכל אחד מ-10 הפריימרים המיקרומולריים קדימה ואחורה לתערובת המאסטר.
הבא ב-7.8 מיקרוליטר מתוך 10 מיקרו-מולרי hex המסומן HIV 1D NA. בדוק את תערובת המאסטר ומערבל את הצינור. לאחר מכן ניתן להוסיף כאן את הפריימר ואת פתרונות מלאי הבדיקה לריאגנטים לאחסון עבור הבקרה החיובית הפנימית כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט כדי להרכיב את תגובות ה-QRPA. ראשית הניחו את כדורי האנזים המיובשים בהקפאה לתוך צינורות בודדים של שניים, רצועות צינור PCR נמוכות בגובה שמונה בארות פיפטה 37.5 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לתוך צינור המכיל גלולה.
מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה הפיפטה כדי להמיס את הכדור מבלי ליצור בועות. הסר את הקצה מהתגובה בזהירות כדי למנוע אובדן נפח וכדי להקפיד להחליף את קצות הפיפטה בין כל צינור. מעבירים את הצינורות לגוש קר 96 היטב צונן למשך חמש דקות לפחות כדי לקרר את תערובת המאסטר.
בינתיים, טען את תוכנת המחזור התרמי עם הפרוטוקול ופריסת הלוח מצוינת בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, חותכים שתי רצועות של דבקי איטום מיקרו פלסטיק שקופים כך שיהיו מעט רחבים יותר מצינורות ה-PCR. וגם להשיג שני מכסי רצועות צינור PCR שטוחים, ציטוט תבנית הפלסמיד האחת של HIV כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט.
ואז הוסף 10 מיקרוליטר מהתבנית לצינור ה- PCR המתאים. שוב, מערבבים בעדינות את התערובת עם קצה הפיפטה. לאחר מכן, הוסיפו 2.5 מיקרוליטר של מגנזיום אצטט לכל מכסה צינור, ואז הניחו בעדינות את הכובעים על גבי צינורות התגובה כך שהם לא יהיו אטומים לחלוטין.
המגנזיום אצטט צריך להיות גלוי בבירור דרך המכסה. הנח את רצועות צינור ה-PCR לתוך מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגה את הצינורות למשך 10 שניות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור ולהסיר בועות. שילוב תמיסת המגנזיום אצטט עם תערובת המאסטר יוזם את תגובת ה-QRPA.
הסר במהירות את צינורות ה-PCR לגוש הקר כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הסר לאט את המכסים כדי למנוע זיהום התגובות ואטום את הצינורות בסרט איטום מיקרוס שקוף. העבירו את הצינורות למחזור התרמי בהתאם למיקומים בפריסת הצלחת.
סגור את המכסה של המחזור התרמי ולחץ על התחל הפעלה. הקפד לייעד שם קובץ לניסוי בסיום הריצה. הצג את נתוני הקרינה הגולמיים וייצא אותם לגיליון אלקטרוני שייצור קובץ הנקרא תוצאות הגברה של כמות.
לבנות את העקומה הסטנדרטית. ראשית, הורד את סקריפט העקומה הסטנדרטי, ולאחר מכן פתח את MATLAB או תוכנית ניתוח נתונים דומה. פתח את קובץ ה- Script ולחץ על הפעל כדי להפעיל את קובץ ה- Script.
הקלד את מספר קבצי הנתונים שיש לנתח כאשר תתבקש לעשות זאת. לאחר מכן, הקלד את מספר הדגימות ומספר השכפולים בכל קובץ אימון. בחלון הפקודה.
הקלד את ריכוז ה-DNA הנמוך ביותר ב-10 עותקים מבוססי לוג ששימשו לבניית העקומה הסטנדרטית ולחץ על Enter. בדוגמה שלפנינו. הריכוז הנמוך ביותר הוא יומן אחד המבוסס על 10 עותקים.
לאחר מכן הקלד את ההבדל בריכוז בין כל תקן DNA בשורת הפקודה ולחץ על Enter כאן. מרווח הריכוז הוא יומן אחד המבוסס על 10 עותקים. לאחר מכן, הזן את הערך עבור סף השיפוע בחלון הפקודה ולחץ על Enter.
ערך זה הוא בדרך כלל בין שלוש לחמש. הקלד את המספר סטיות תקן מעל הרקע עבור סף חיובי, המכונה גם Z ולאחר מכן הקש Enter ערכי Z טיפוסיים בטווח שבין 1 לחמש. לאחר מכן, ציין את הציוד ששימש לאיסוף הנתונים במקרה זה.
הקלד אחד עבור המחזור התרמי ולאחר מכן הקש Enter. אם יש בקרה חיובית פנימית, בחר את ברירת המחדל או ערך חדש עבור הסף על-ידי הקלדת Y או N, בהתאם לשאלה אם יש צורך בסף חדש. לבסוף, בחר את כל קבצי הגיליון האלקטרוני שישמשו לבניית העקומה הסטנדרטית.
לאחר מכן, קובץ ה- Script ייבא וינתח באופן אוטומטי את כל הנתונים. QRPA בזמן אמת בוצע על דגימות כפולות המכילות מספרי עותקים שונים של HIV 1D NA. תחילת ההגברה הניתנת לזיהוי המצוינת על ידי עלייה בקרינה מתרחשת מוקדם יותר עבור דגימות עם מספרי עותקי DNA גבוהים יותר מאשר עבור דגימות עם מספרי עותקים נמוכים יותר. נתוני הקרינה הגולמיים שימשו ליצירת עקומה סטנדרטית מהגברה של ריכוזים ידועים של HIV 1D NA. נתונים אלה התאימו לעקומה מעריכית, והערך בריבוע R מצביע על התאמה טובה.
העקומה הסטנדרטית שימשה לחיזוי הריכוזים של דגימות DNA נוספות בריכוז ידוע. התאמת הערך של Z ל-1 מאפשרת חיזוי מדויק של ריכוזי DNA נמוכים. לעומת זאת, ריכוזי DNA גבוהים צפויים טוב יותר עם ערך Z של חמש.
כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור של-RPA חסרים מחזורים אמיתיים כדי להגביל את קצב הגברת ה-DNA. לכן יש לשלוט במדויק בקצב ההגברה. עקביות בין ניסויים היא קריטית, לכן הקפד להשתמש באותם סימני פריימר עבור כל הניסויים.
הגן על רכיבי התגובה מפני חום ואור. הוסיפו מגנזיום אצטט מיד לפני תחילת איסוף הנתונים, ושמרו את התגובות בבלוק הקר עד להתחלה. הניסוי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול עבור בדיקת הגברה של פולימראז רקומבינזי בזמן אמת שנועדה לכמת ריכוזי DNA בדגימות. השיטה משתמשת במעגל תרמי או במיקרוסקופ עם מחמם במצב, וכוללת פיתוח של בקרה חיובית פנימית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוטכנולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
- גנומיקה
רקע
- ניתוח כמותי של DNA הוא קריטי בתחומי מחקר ביולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות כמו PCR כמותי בזמן אמת דורשות מעגלי תרמי יקרים.
- הגברה של פולימראז רקומבינזי (RPA) מציעה אלטרנטיבה איזותרמית.
- בקרות חיוביות פנימיות משפרות את האמינות של בדיקות כמותיות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לכימות ריכוזי DNA באמצעות RPA.
- ליצור בקרה חיובית פנימית לאימות משופר של הבדיקה.
- לספק סקריפטים לניתוח נתוני פלואורסצנציה בזמן אמת.
שיטות ששימשו
- הכנת תערובות תגובה עם DNA מטרה, פריימרים וגששים פלואורסצנטיים.
- שימוש במכונת PCR בזמן אמת כדי לנטר את הפלואורסצנציה במהלך ההגברה.
- ניתוח נתוני פלואורסצנציה ליצירת עקומת סטנדרט.
- אימות הבדיקה באמצעות ניסויים לכימות DNA של HIV מטרה.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מכמתת בדיוק ריכוזי DNA בתוך סדר גודל אחד.
- ניסויי אימות אישרו את יעילותה של הבקרה החיובית הפנימית.
- RPA הדגימה יתרונות על פני שיטות PCR מסורתיות.
- הפרוטוקול נגיש לחוקרים ללא ציוד יקר.
מסקנות
- הבדיקת RPA שפותחה היא שיטה אמינה לכימות DNA.
- בקרות חיוביות פנימיות חיוניות לאימות הבדיקה.
- שיטה זו יכולה לאפשר גישה רחבה יותר לטכניקות כימות DNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative DNA measurement is a foundational capability in target validation and assay development, where accurate concentration data supports lead identification and predictive confidence. The described qRPA method provides an isothermal alternative to qPCR, reducing equipment dependency and enabling deployment in resource-variable settings. This positions the assay as a scalable tool for early discovery workflows requiring reliable nucleic acid quantification without thermal cycling infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise DNA target quantification in complex samples.
- Operational Value: Supports functional target validation by delivering concentration data within one order of magnitude accuracy using internal positive controls.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by generating standard curves that allow cross-experiment comparison and assay performance assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements essential for dose-response modeling and compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay standardization through internal positive controls that monitor amplification efficiency and inhibition.
- Scalability: Compatible with microscope-based detection, supporting adaptation to point-of-care or decentralized testing formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage quantification to preclinical validation through reproducible standard curve generation.
- Biomarker Alignment: Supports monitoring of DNA-based biomarkers where concentration changes indicate target engagement or pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative outputs that inform go/no-go decisions by defining detectable limits and dynamic range.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where quantitative nucleic acid data informs compound prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying DNA targets to assess pathway modulation or genetic perturbation effects.
- Screening: Delivers reproducible fluorescence-based readouts suitable for high-throughput adaptation when paired with automated liquid handling.
- Analytics: Generates standard curves and Z-score thresholds that allow teams to compare conditions and validate assay sensitivity.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing quantifiable DNA measurements that correlate with biological activity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across DNA targets, reducing redevelopment effort for new assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability through internal positive control normalization.
- Operational Value: Enhances reproducibility via isothermal amplification and cold-block reaction setup, minimizing temperature-dependent artifacts.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating need for thermal cyclers, lowering barrier to entry for quantitative DNA analysis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through concentration data that supports accurate dosing and target exposure modeling.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in primer/probe design and fluorescence data interpretation.
- Needs access to fluorescence detection equipment such as a real-time PCR machine or microscope with stage heater.
- Demands standardization of reagent handling, including magnesium acetate addition timing and cold-block storage.
- Involves adaptation considerations for sample types, particularly regarding inhibitor tolerance and DNA purity.
- Includes practical limitations such as the one-order-of-magnitude quantification accuracy and absence of true amplification cycles requiring precise reaction timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assembling the Quantitative Recombinase Polymerase Amplification (qRPA) Reactions for a Standards Curve
5:16
Constructing a Standard Curve from Multiple Experiments with Custom Scripts
6:55
Results: Construction of an HIV-1 DNA Standard Curve by qRPA
7:53
Conclusion
