Name: תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו פרוטוקול ל-qRT-PCR בזמן אמת לניתוח פרופילי ביטוי של תת-סוגי אינטרפרון מסוג I ו-III. השיטה מאפשרת הבחנה בהבדלי זוג בסיס בין רצפים דומים מאוד באמצעות בדיקות אוטומטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency הסכם YI-AI-6153-01, קרנות ביצוע עצמיות FDA ​​/ CBER, וה- FDA הנגד רפואי היוזמה. TCT, MNB, VPM, LMS, וKDK נתמכו על-ידי מינוי לתכנית להשתתפות במחקר במרכז להערכת ביולוגיה ולמחקר מנוהל על ידי Oak Ridge המכון לחינוך מדעי באמצעות הסכם Interagency בין departmen אנרגיה של ארה&quot;ב ובארה&quot;ב מנהל מזון ותרופות.

1. הכנת דילולי סדרה רגיל (איור 3 א) הערה: סדרת דילול סידורי של פלסמידים לינארית המכילים הרצפים ממוקדים על ידי מערכת Pr / Pb משמשות כסטנדרטים כמותיים לassay qRT-PCR. כל סט דילול סדרתי סטנדרטי לתת IFN מכיל נפח מספיק כדי לרוץ 90 צלחות assay. ארבע נקודות של עקומת הדילול הסטנדרטי המשמשת לassay נבחרו כדי לכסות ערכי ה- CT ממגוון של 20 עד 32 (טבלה 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה סטנדרטית (50 בצהריים) ו- DNA זרע סלמון (ssDNA, 10 מ&quot;ג / מיליליטר) פתרונות מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת ssDNA / מים לדילול 17 סטים סטנדרטיים על ידי ערבוב 51 μl של ssDNA עם 20.3 מיליליטר של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית רצועת PCR 8-צינור אחד עבור קבוצת דילול סטנדרטית. הערה: הכנת דילולים הסידוריים סטנדרטיים מפתרוני המניות תיקח 2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 190 μl של תמהיל ssDNA / מים לfצינור irst ברצועה ו -180 μl של ssDNA תערובת / מים לחמישה צינורות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול 01:20 על ידי העברת 10 μl מהמניות רגילות 50 בערב ועד הצינור עם 190 μl של ssDNA / המים, לערבב; מערבולת ובמהירות צנטריפוגות רצועת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע דילול 1:10 על ידי העברת 20 μl מהצינור ביותר בדילול לאחרונה לצינור הבא בסדרה; מערבולת ובמהירות צנטריפוגות רצועת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.6 עד הצינור האחרון בסדרת הדילול קיבל הסטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.3-1.7 עבור כל תקן. </li></ol> ראה טבלה 3 להלן 2. הכנת פריימר / Probe (Pr / Pb) ואין תבנית הבקרה (NTC) עבודה בורסת תערובות (איור 3) הערה: כל 1.7 מיליליטר Pr / Pb להגדיר עובד מניות ו128.6 μl אין תבנית בקרה (NTC) עובד תמהיל המניה תעשה 30 צלחות assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Pr / Pb להגדיר תערובות המניה עובדות. לאE: הכנת סט Pr / Pb ומנייה עובדת NTC מתערבבת מפתרוני המניות תיקח 2-3 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פריימרים ובדיקות בבית 100 מיקרומטר עם מים טהורים להכנת פתרונות מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית עד שבע עשרה 2 צינורות מיליליטר; אחד עבור כל קבוצת Pr / Pb הכלול בassay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה פריימרים (100 מיקרומטר), בדיקות (100 מיקרומטר), וssDNA (10 מ&quot;ג / מיליליטר) פתרונות מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של ssDNA לכל צינור באמצעות פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. הוסף את פריימר קדימה המתאים, לאחור תחל, ולחקור לכל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה. ראה בטבלת 1 סטי Pr / Pb מיקוד תת IFN אדם וטבלה 2 למקוק רזוס סטי Pr / Pb. מוסיפים מים כדי להביא את עוצמת הקול של כל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה ל -200 μl. הערה: הנפח של פריימרים, בדיקה, ומים להוסיף תלויה בריכוז התגובה הסופי המבוקש לPr / Pbלהגדיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תערובות המניה NTC עובד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי רצועות PCR 5-הצינור לייבל למניות פועלות NTC מתערבבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 14.3 μl של כל Pr / Pb מוגדר צינור תערובת המניה עובדת המתאים NTC. ראה טבלה 4 לשילובי סט Pr / Pb לבארות NTC. מוסיף מים לכל אחד מהמנייה עובדת NTC מתערבב להביא את הנפח הסופי 128.6 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, צנטריפוגה בקצרה, ולמקם את הצינורות בחושך על קרח או ב -20 ° C לאחסון ארוך טווח. </li></ol></li></ol> ראה טבלה 4 להלן <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את Pr / Pb להגדיר מניות עובדות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרת aliquot של סטי Pr / Pb נדרשים לתערובות המניה עובדת NTC, להוסיף 1.5 מיליליטר של מים כדי להביא את הנפח הסופי של כל Pr / Pb להגדיר עובד צינור המניה לרמה של 1.7 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס, צנטריפוגה בקצרה, ולמקם את הצינורות בחושך על קרח או ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך יותר. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת לוחות assay 384 גם באמצעות pipettor רב-ערוצי האוטומטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מקור 96-היטב של סטי Pr / Pb ותערובות של NTC לaliquoting 384-גם צלחות assay. הערה: הכנת צלחת המקור מתערובות מניית פעולת Pr / Pb תיקח פחות משעה 1. כל צלחת מקור 96-גם היא מספיק כדי להפוך את שש צלחות 384 גם assay (איור 3 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בקצרה צנטריפוגות Pr / Pb להגדיר מניות פועלות ותערובות של המניה עובדת NTC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת 96-היטב חדשה בבלוק 96-היטב קירור מקורר ולייעד את הבארות עבור כל קבוצת Pr / Pb או NTC לערבב הבארות לקבל (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים עד לצלחת 96-היטב בעזרת פיפטה רבה 250 μl אלקטרונית: לוותר 66 μl מים לכל Pr / Pb להגדיר היטב (למעט 4 הבארות ליעד 17). לוותר 82.5 μl מים ל4 יעד 17 הבארות. לוותר 27.5 μl מים לכל תערובת NTC כן. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את Pr / Pb הנכון להגדיר עובד המניה לבארות המיועדות של הצלחת 96-היטב: לוותר 54 μl של Pr / Pb הנכון להגדיר עובד המניה לבארות המיועדות Pr / Pb הסט (למעט 4 הבארות ליעד 17). לוותר 67.5 μl של היעד 17 Pr / Pb להגדיר עובד המניה ליעד 17 בארות סט Pr / Pb המיועדים. להוסיף 22.5 μl של התמהיל הנכון NTC עובד המניה לבארות המיועדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 96-היטב עם חותם צלחת דבק ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 XG כדי להבטיח שהתוכן בחלק התחתון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת 96-היטב במיקסר המערבולת באמצעות מתאם צלחת 96-היטב ולערבב 1 דקות ב 1000 סל&quot;ד. צנטריפוגה הצלחת 96-היטב במשך 5 דקות ב 700 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את צלחת מקור 96-גם בחושך על 4 מעלות צלזיוס אם באמצעות באותו היום, אחרת לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות assay 384 גם על ידי הוספת Pr / Pb מגדיר באמצעות pipettor רב-ערוצי האוטומטיים. הערה: הכנה של שש צלחות assay מצלחת המקור 96-גם תיקח 3-4 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע צלחות, מראש לצנן את קן הקירור עד 4 מעלות צלזיוס וחימום מוקדם של מאייד הצלחת 125 ° C וגוש החום התחתון עד 80 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר נושבת בין 20-25 ליטר לדקה (LPM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את pipettor רב-ערוצי האוטומטיים ולפתוח את הפרוטוקול להכנת לוחות assay IFN על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתקנת הפלטפורמה, למקם את תיבת קצה pipet מלאה לחלוטין בעמדת פלטפורמת 1, 96-גם צלחת המקור בעמדת 4, וצלחת 384 גם חדשה בעמדה 6. בגין הריצה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. הערה: בסיומה של ריצה, כל טוב יכיל 5 μl של תמהיל Pr / Pb. הערה: הסכום הסופי של ssDNA הוסיף לכל טוב של צלחת assay 384 גם היא 0.025 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את צלחת assay 384 גם על משטח שטוח כדי להבטיח נוזלים נמצאים בתחתית של הבארות וליישם דבקחותם צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחת 1 דקות ב 700 x גרם. הסר את חותם צלחת הדבק, למקם את צלחת 384 גם assay לתוך מייבש הצלחת ולמקם את סעפת 384 גם ישירות מעל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התוכן של הצלחת 384 גם assay יבש, להחיל חותם צלחת דבק חדש, לעטוף בנייר כסף, תווית, וחנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הערה: ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים 3.2.3-3.2.6 עד 6 x 384 גם צלחות assay מוכנים או הנוזלי בצלחת מקור 96-גם מרוקנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את קן הקירור, סגור את התוכנה, ולכבות את pipettor רב-ערוצי האוטומטיים. כבה את מייבש הצלחת. </li></ol></li></ol> 4. טעינה והפעלה פלייט 384 גם Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני גן המשק (HKG) גם תערובות, אשר מורכבת של קבוצת Pr / Pb לHKG, ssDNA, תערובת אמן PCR, ומים, שיש להוסיף לצלחת 384 גם assay מיובש ( <strong&gt; איור 3D). הערה: הכנת תערובות וטעינת צלחת assay תיקח 1-2 שעות. ריצת צלחת assay תיקח פחות משעה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית צינור 1.5 מיליליטר לכל תערובת HKG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 2 μl של ssDNA (10 מ&quot;ג / מיליליטר) עם 84.9 מים μl. הוסף 2 μl של ssDNA המדולל, 11.8 μl מים, 23 μl של תערובת אב, ו -9.2 μl של 20x הנכון HKG Pr / Pr להגדיר על צינור אחד, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש dehydrogenase glyceraldehyde-3-פוספט (GAPDH) ו- C יוביקוויטין (UBC) כHKG עבור assay האדם (ראה לוח חומרים). השתמש GAPDH וRNA ריבוזומלי 18S כHKG עבור assay רזוס. הערה: HKG משמש לביצוע assay גמיש וצריך לשקף את הגנים מתאימים לסוג התא שנבדקה GAPDH, UBC, ו18S הם דוגמאות לHKG נפוץ;. HKG האחר עשוי להיות מתאים יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם וpositive לשלוט גם תערובות, אשר מורכבת של המדגם או cDNA שליטה החיובי, תערובת אמן, ומים, שיש להוסיף לצלחת 384 גם assay מיובש. הכן את המדגם ותערובות שליטה החיוביות במספיק כמות לוותר עד 21 בארות צלחת (איור 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סינתזת cDNA, בצע את הוראות היצרן כדי להכין את דגימות RNA בצעד עיכול DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות ובקרה חיובית מראש מסינתזת cDNA של לפחות 500 ננוגרם של RNA ואחריו טיפול עם RNase H (נפח סופי של 24 μl עבור כל דגימה) הבאים הוראות היצרן. אחסן את cDNA מוכן ב -20 ° C עד לשימוש. הפשרה, מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה cDNA המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 78.8 μl של תערובת אמן ו54.8 μl מים לכל דגימה 24 μl וצינור ביקורת חיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בקצרה צנטריפוגות הצינורות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסטנדרטים וNTC גם מתערבב, consisting של תערובת אמן ומים, שיש להוסיף לצלחת assay 384 גם מיובש (איור 3D). לסטנדרטים גם לערבב, להוסיף 165 μl מים עד 275 μl של תערובת שני בצינור 1.5 מיליליטר. לNTC גם לערבב, להוסיף 52.5 μl מים ל52.5 μl של תערובת שני בצינור 1.5 מיליליטר. מערבולת בקצרה צנטריפוגות הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת assay 384 גם מיובשת לטעינה של תערובות ודוגמאות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחת מיובשת 384 גם assay מ4 ° C ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על בלוק 384 גם קירור מקורר, להסיר את חותם צלחת הדבק ולהתוות את הבארות של הצלחת לייעד בי תערובות ודוגמאות השונות יהיו pipetted (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחת assay 384 גם עם תערובת היטב סטנדרטית, סטנדרטים, NTC גם לערבב, דגימות, בקרה חיובית, ותמהיל HKG (איור 3E). כל הפתרונות וורטקס ו צנטריפוגות לזמן קצר לפני הניפוק לצלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 6 μl של הסטנדרטים ולערבב היטב כל אחד סטנדרטי עם פיפטה הרבה האלקטרונית 30 μl. לוותר 1.5 μl של דילול סדרתי הסטנדרטי הנכון למיועד גם עם פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 7.5 μl של NTC גם לערבב לכל NTC היטב עם פיפטה הרבה האלקטרונית 30 μl. לוותר 7.5 μl של המדגם לבארות המיועדות עם פיפטה רבה 30 μl האלקטרונית. לוותר 2.5 μl של HKG Pr / Pb תערובות לבארות המיועדות עם פיפטה רבה 12.5 μl האלקטרונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את כל בארות ריקות עם 7.5 μl של תערובת מים ותערובת אמן שאריות עם פיפטה הרבה אלקטרוני 30 μl; 7.5 μl מים לבד יעבוד גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את צלחת 384 גם assay עם סרט הדבק האופטי ו צנטריפוגות 1 דקות ב 700 x גרם. מערבולת הצלחת 384 גם האטום במיקסר המערבולת 2 דקות ב2,600 סל&quot;דוצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 700 x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת assay 384 גם האטום במכונה qRT-PCR, לפתוח את התבנית לפריסת assay ולהתחיל לרוץ. תוצאות ניתן לייצא כגיליון אלקטרוני או כקובץ טקסט לניתוח: הערה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתנאים התרמיים אופטימליים הבאים תגובת Cycler עבור assay: i) 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ii) 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, iii) 95 מעלות צלזיוס למשך 25 s, iv) 59 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. חזור על השלבים III ו- IV במשך 40 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים הגולמיים מפלטפורמת qRT-PCR ליישום תוכנת גיליון אלקטרוני. עלילה כל תקן שנקבע כעקומה סטנדרטית להתבונן ליניאריות 4 נקודות. ביצוע ניתוח על ידי חישוב ΔCq או על ידי עותק מספר מבוסס על העקומות סטנדרטי ארבע נקודת 27. </li></ol></li></ol> ראה איור 3 להלן

<ol><li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li>
<li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferons%2C+interferon-like+cytokines%2C+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li>
<li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses%3A+cellular+receptors+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li>
<li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li>
<li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li>
<li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1%2C+STAT2%2C+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li>
<li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+genes%3A+a+complex+web+of+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li>
<li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li>
<li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vaccinia+virus+soluble+alpha%2Fbeta+interferon+%28IFN%29+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li>
<li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li>
<li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+autoimmunity%3A+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li>
<li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li>
<li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li>
<li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li>
<li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+viral+hepatitis%22%5BJournal%5D)">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li>
<li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li>
<li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li>
<li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Association+of+Physicians+of+India%22%5BJournal%5D)">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27%3A+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology+%28Orlando%2C+Fla.%29%22%5BJournal%5D)">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-alpha+Acts+on+the+S%2FG2%2FM+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li>
<li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+%28pDCs%29+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes%3A+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li>
<li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li>
<li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li>
<li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+interferon+%26+cytokine+research+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li>
<li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+genomic+data+in+the+discovery%2C+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933(2009).</li>
<li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li>
<li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I%2C+II%2C+and+III+interferon+and+their+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+interferon+%26+cytokine+research+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li>
<li>Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLittle%2C+S+%22Current+protocols+in+human+genetics+%2F+editorial+board%2C+Jonathan+L.+Haines+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]</a>. 9 (Unit 9 8), (2001).</li>
</ol>

VPM ו-RLR הם ממציאים שותפים של הטכנולוגיה למדידת ביטוי של תת-סוגים IFN ו-IFN ולהפיק ממנה הכנסות מתמלוגים. שאר המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

דו&quot;ח זה מתאר עיצוב, ייצור אצווה, וגישה כלפי ניתוח של assay למדוד שעתוק של קבוצה של גנים דומים מאוד בהגדרת מעבדת מחקר. Assay qRT-PCR תפוקה הגבוהה דיווח כאן מודד את IFN- ו-- תת λ עם סגוליות גבוהות. שיטה זו כרוכה שני היבטים מרכזיים, העיצוב של סטי Pr / Pb שמפלים בין בני משפחת גן הומולוגי והפיתוח של פלטפורמת הפקה ליצירת צלחות assay אמינות ועקביות 384 גם מראש עם סטי Pr / Pb. בדיקות qRT-PCR לשלב או כימי גישה מבנית (MB) (LNA) לקראת שיפור הסגוליות שלהם 29. לשתיים מקבוצות פריימר בassay רזוס (הטבלה 2), מערכת ההגברה-עקשן מוטציה (נשק) שולבה ברצפי פריימר כדי לשפר את הספציפיות 30 נוסף. בזמן שהוא בדרך כלל הטוב ביותר כדי למקד את צמתים אקסון-אקסון לenhaהספציפיות פליטות של תגובת qRT-PCR, זה לא היה אפשרי בגלל הסוג אני IFN גנים אין אינטרונים. לכן, הדנ&quot;א הגנומי יהיה מוגבר בתגובת PCR, והוא חייב להיות מושפל על ידי טיפול DNase לאחר מיצוי RNA. אזור היעד לסטי Pr / Pb הוגבל לאזורי הקידוד של פפטיד הבוגר לכל IFN. בגלל דמיון רצף הגבוה בקרב תת IFN-α, במיוחד באזור פפטיד הבוגר, זה היה לפעמים יש צורך להתפשר רגישות כדי להבטיח סגוליות. זה היה במיוחד המקרה עם IFN-α17, שבו יש לו את תמליל פפטיד הבוגר רק ארבעה בסיסים ייחודיים בהשוואה נגד תת IFN-α האחר. IFN-α17 מיקוד הנדרש פריימרים המחייבים את התמלילים של תת מרובים, הגבלה ספציפי לבדיקה. כתוצאה מכך, תגובת PCR תגביר סוגים אחרים מאשר IFN-α17, ובכך לצרוך אחוז ניכר של חומרים כימיים PCR וlowering את המשרעת של אות הקרינה מהבדיקה הספציפית לIFN-α17. אתגר נוסף לעיצוב סטי Pr / Pb רגישים וספציפיים לגנים דומים מאוד כגון IFN הוא האפשרות שהרצפים באתר GenBank המבואר לא יכולים להיות מלאים או מקיפים בזמן של עיצוב. שוב, זה היה אתגר עבור IFN-α17, שבו רצפים מבואר חדש לא ליישר באופן מושלם עם הגרסה של הרצף באתר בעת העיצוב. לכן, בעת תכנון Pr / Pb מציב לגנים שלא נחקרו באופן אינטנסיבי, זה חכם כדי לבדוק את הרצף המבואר האחרון של גן יעד מעת לעת. לבסוף, יש צורך להבטיח שקבוצות Pr / Pb לא להגביר פסוידו-שניתן עיבד אבל לא תורגם. לאחר עיצוב סטי Pr / Pb, האתגר הבא הוא אופטימיזציה תנאי PCR של שבע עשרה Pr / Pb שונה קובע בצלחת אחת 384 גם. סטנדרטים תמליל הם important בבדיקת הספציפי של קבוצת Pr / Pb ולהיות חיוניים להרמונית תנאי qRT-PCR של PCR התגובות השונות ומשונות. בדיקת סט Pr / Pb נגד הסטנדרטים התמליל קובעת את היעילות והרגישות שלה; פלסמידים המבטאים פסוידו-דומה מאוד עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי Pr / Pb להגדיר באופן סלקטיבי מודד שעתוק של הגן הפונקציונלי. הסטנדרטים התמליל גם לספק אמצעים כמותיים של ניתוח (מספר התמלילים), בנוסף לחצי כמותית הניתוח יחסית לגן משק (ΔCq). pipetting רב-ערוצי רובוטית מצלחת מקור 96-היטב לתוך צלחות assay 384 גם מרובות משפר את הדיוק ועקביות של תוצאות בין-צלחת. DNA זרע סלמון (ssDNA) משמש כנשא שמייצב ומשמר את סטי Pr / Pb לאחסון ארוך טווח, כפי שעושה ייבוש ריאגנטים לוותר לתוך הצלחות. ייבוש הצלחות גם מקטין את הנפח של התגובההכרחי לתוצאות לשחזור, אשר בתורו שומרת דגימות יקרות ומפחיתה את השימוש בחומרים כימיים יקרים. באמצעות צעדים אלה, קבוצות של צלחות הם התאספו המספקות דיוק ועקביות במשך יותר משישה חודשים. בעקבות הכנת צלחת, אמצעי בקרת איכות הוא קריטי כדי לבדוק את העקביות של קבוצה של צלחות. לצורך כך, ארבע קבוצות נוספות של סטנדרטים מנוהלות על צלחת. הצלחת &quot;סטנדרטי 5x&quot; עוקבת אחר ביצועים ויוצרת מערך נתונים שהסטנדרטים של צלחת פרט בהשוואה. בעוד עשרה דילולים של פי 10 של כל תקן משמשים במהלך עיצוב assay, שיקולי החלל דורשים כי ארבע נקודות משמשות לעקומה סטנדרטית על כל צלחת assay, ולצלחת סטנדרטית 5x. בנוסף, בקרה חיובית צריכה להיות כלולה בכל צלחת כדי להבטיח את תוקפו של הצלחת. בדרך כלל, זה לוקח 3-4 שעות כדי להכין את שש צלחות assay מאחד Pr / Pb שלצלחת ource; זה אפשרי להכין שתים עשרה צלחות ביום אחד במעבדת מחקר. מאז כל צלחת assay תת אנושית IFN בוחנת שבע עשרה סטי Pr / Pb ויכולה להכיל חמישה עשר דגימות ניסוי, יום אחד של הרכבה מייצר קבוצה של צלחות עם היכולת לייצר עד 3,060 נקודות נתונים ניסיוניות. נתונים גולמיים מפלטפורמת qRT-PCR יכולים להיות מעובד ונאספו באמצעות תסריטי תכנות בתוכנת יישום גיליון אלקטרוני כדי למלא תבנית ניתוח מוגדרת מראש באופן אוטומטי. שיטה זו מקטינה את ידיים על הזנת נתונים, טעויות העתקה ובכך למנוע ומאפשרת לחוקר להתמקד בניתוח נתונים ולא הרכבה נתונים. כפי שתואר כאן, assay qRT-PCR תפוקה גבוה זה יכול להיות מיושם על מנת למדוד את הביטוי של תת אינטרפרון בדגימות מקוק רזוס אדם או ויכול להיות מותאם לשימוש עבור מינים אחרים או קבוצות גן הומולוגיות. הגמישות של פריסת הצלחת מאפשרת למשתמש לשנות את פריימר / בדיקה קובעת להתאים את הגנים שלריבית כלפי מערכת מודל סוג תא מסוים או. assay זה יכול להיות מיושם למדידת חתימות ביטוי IFN בדגמי תרבית תאים לומדים פתוגנים או בדגימות מטופל בהקשר של מודלים מחלה על מנת להבהיר את מנגנוני האיתות מעורבים בתגובה חיסונית.

סוגי I ו- III אינטרפרונים (IFN) הם קריטיים בתגובה החיסונית לוירוסים וגירויים פתוגניים אחרים ובהווה בכל החוליות 1. תאי מערכת חיסון ואינו חסינים להביע ולהפריש, כמו גם להגיב ל, IFN 2. חיישני חיסון מולדים, כגון קולטנים לחיוג כמו (TLR), סטינג, וRIG-אני, לגרום לי סוג וביטוי III IFN על זיהוי של דפוסי הפתוגן קשורים מולקולריים (PAMP) 3,4. בבני אדם, סוג אני IFN כולל IFN-β, -ω, -κ, ו -12 תת-סוגים של IFN-α, ונקשר לרצפטור IFNAR1 / IFNAR2 המורכב 2,5. סוג III IFN כולל IFN-λ1, -λ2, ו-λ3 ולהיקשר לקולטן המורכב IL10RB / IL28RA 2. קלסי, סוגי I ו- III IFN נקשרים לקולטן מתחמים המיוחסים להם שלאחר מכן לגייס STAT1 / heterodimers STAT2 וליזום שעתוק של גני אינטרפרון מגורה (ISG) 6. ISG מעורב במגוון הרחב של פונקציות, מנגיפים ואנטיפעילות שגשוג להפעלה של התגובה החיסונית אדפטיבית 7. מנגנונים הרבים פתוגנים התפתחו כדי להתחמק, ​​לערער, ​​ולחטוף את האלמנטים של מסלול איתות IFN להדגים את החשיבות של IFN בתגובה החיסונית המולדת 8. לדוגמא, וירוס vaccinia מבטא קולט דמה עם ההומולוגיה IFNAR1 שsequesters הקלד אני IFN 9 בעוד וירוס מחלה דמוי Yaba מפריש גליקופרוטאין שמעכב הקלד I ו- III IFN חלבונים 10. בנוסף לתפקידם בהגנת מארחת, IFN גם מעורב במעקב הסרטן ומספר מחלות אוטו-דלקתי: השתקת ביטוי IFN בתאי סרטן השד מגבילה immunosurveillance 11, ייצור יתר של IFN-α הוא מנגנון בפיתוח מערכתי זאבת אדמנתית 12, והפעלה תועה של סטינג מובילים לדלקת מערכתית הנגרמת על ידי כמויות עודפות של IFN בvasculopathy הקשורים STING13. טיפולי, IFN משמש לטיפול בטרשת נפוצה 14, זיהומים נגיפיים כרוניים כגון 15 HBV ו- HCV 16,17, וסוגי סרטן כמו לוקמיה שעיר תא 18 ולוקמיה מיאלואידית כרונית 19. שאלות על הרלוונטיות של IFN בתהליך פיסיולוגי מסוים ברציפות לחשוף את הטבע בכל מקום של משפחת ציטוקינים זה. הקלד אני IFN, במיוחד תת IFN-α, נחשב לעתים קרובות כישות אחת 20-23, ולא כקבוצה קשורה באופן הדוק, אך ברורה, חלבונים. הקיום וההתמדה של מיני IFN המרובים כולל תת IFN-α, לאורך האבולוציה חוליות 24 מצביעים על כך שלפחות קבוצת משנה של תת אלה יש פונקציות ספציפיות או ייחודיות. ייתכן שדפוסי ביטוי IFN הגדרה יהיו לפענח ולעזור לאפיין את הפונקציות הספציפיות של אחד או יותר מתת 17. האתגר של לימוד tהוא מקליד תת I ו- III IFN מבוסס על זהות הרצף המשותפת שלהם: שנים עשר תתי הסוגים IFN-α לשתף&gt; 50% 25 ותת IFN-λ לשתף 81-96% 26 של רצפי חומצות אמינו שלהם. בassay qRT-PCR שתואר, משואה מולקולרית (MB) וחומצות גרעין נעולות (LNA) בדיקות ניאון להפלות הבדלי זוג בסיס יחידים בין הרצפים תת סוג IFN דומים מאוד ומאפשרים האפיון של חתימת ביטוי IFN. פורמט הצלחת 384 גם של assay כולל שני (סטנדרטים פרוטוקול) כמותי ו( גני משק הבית (HKG)) חצי כמותית אמצעים, המאפשר ניתוח על ידי עותק תמליל מספר וΔCq בהתאמה. הרכבה אצווה, בהנחייתם של pipetting אוטומטית רבת ערוצים, ואחסון לטווח ארוך, אפשרית באמצעות ייבוש פריימר / הבדיקה (Pr / Pb) קובעת על הצלחות, לשפר את שחזור, שירות, והמעשיות של assay. פרוטוקול זה מתאר את התהליךלהכנת 384 גם צלחות assay qRT-PCR (איור 1) עם עד שבעה עשר קבוצות שונות Pr / Pb מיקוד תת אנושי IFN (טבלת 1). Pr / Pb להגדיר עובד צלחות מקור המניה (איור 2) משמשות להכנה מרובה 384 גם צלחות assay בתהליך שיכול להיות אוטומטי באמצעות pipettor רב-ערוצי רובוטית. בעוד ההתמקדות הראשונית הייתה על יצירת פרוטוקול ללימוד חתימות ביטוי IFN אדם, שיטה זו יושמה על קופי רזוס, כמו גם. למרות צלחת הפריסות שונות במקצת וסטי Pr / Pb (טבלת 2) נבדלים, שיטת ההכנה כוללת ליצירת הצלחות האנושיות ורזוס היא זהה. עם שינויים מינימאליים של הפרוטוקול, השיטה יכולה להיות מוצאת להורג, כדי לאפשר פיתוח של מבחני ללמוד קבוצות אחרות של גנים הקשורים באופן הדוק. דמויות ראו 1 ו -2 להלן ראה לוחות 1 ו -2 Below

<table><tbody><tr><td>רצועות צינור PCR 0.2 מ"ל&nbsp;</td><td>Eppendorf (ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>E0030 124 286</td><td></td></tr><tr><td>12 ערוצים 384 אקולייזר פיפטה אלקטרונית, 0.5-12.5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>14-387-139</td><td>*הופסק</td></tr><tr><td>12 ערוצים 384 אקולייזר פיפטה אלקטרונית, 1-30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>14-387-137</td><td>*</td></tr><tr><td>פיפטה אלקטרונית 12 ערוצים הופסקה, 5-250 ul</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק (וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>14-387-118</td><td>*</td></tr><tr><td>הופסק צינור מיקרו צנטריפוגה 2.0 מ"ל,</td><td>מוצרים מדעיים סטריליים של Celltreat (שירלי, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה אלקטרונית 8 ערוצים, 15-1250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>14-387-115</td>*<td></td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים חד פעמיים שהופסקו&nbsp;</td><td>VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)</td><td>89094-668</td><td>מאגרי 25 מ"ל עם 2 חוצצים</td></tr><tr><td>E-Centrifuge</td><td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, ארה"ב)</td><td>1090003</td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>Hs99999901_s1</td><td>סט פריימר/בדיקה Rhesus HKG</td></tr><tr><td>במהירות קבועה מיני וורטקסר</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>אטם צלחת דבק חדיר גז</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)</td><td>AB-0580</td><td>אטם צלחת חד פעמי המשמש בתהליך הכנת הצלחת&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)</td><td>FBR (סילבר ספרינג, מרילנד, ארה"ב)</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td> של <td>סט פריימר/בדיקה HKG אנושי</td></tr><tr><td>גליצרלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH)</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>Rh02621745_g1</td> סט <td>פריימר/בדיקה Rhesus HKG</td></tr><tr><td>הדסון סולו פיפטור רב-ערוצי אוטומטי&nbsp;</td><td>הדסון רובוטיקס (ספרינגפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>800200</td><td>שונה עם קן קירור של 384 בארות</td></tr><tr><td>פלסמידים ליניאריים (גנים IFN)</td><td>Aldevron (פארגו, ND, ארה"ב)</td>פריט <td>הזמנה מותאם אישית</td><td>3000, 3580; משמש לתקני בדיקה&nbsp;</td></tr><tr><td>מעכבי LNA</td><td>Exiqon (וובורן, MA, ארה"ב)</td>פריט <td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>500100</td></tr><tr><td>LNA Probes</td><td>Sigma-Proligo (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>מספר חומר VC00023</td></tr><tr><td>קצות פיפט מסוננים מטריצה, 12.5 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)</td><td>14-387-193</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפט מסוננים מטריקס, 30 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)</td><td>14-387-196</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפט באורך מורחב של מטריקס TallTip, 1,250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>14-387-160</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפט באורך מורחב של Matrix TallTip, 250 ul</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>14-387-152</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תגובה אופטית של מיקרו-אמפר עם ברקוד</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)4309849</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)4311971</td><td></td> <td>סרט דבק המשמש לאיטום הצלחת לפני הפעלת qRT-PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft (רדמונד, וושינגטון, ארה"ב)&nbsp;</td>שפת התיכנות <td>של Office 2010</td><td>Visual Basic&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקסר מערבולת MixMate</td><td>Eppendorf (ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>5353 000.014</td><td>מנגנון מערבולת צלחת דו-ממדית</td></tr><tr><td>בדיקות משואות מולקולאריות</td><td>FBR (סילבר ספרינג, MD, ארה"ב)</td> <td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>PCR Cooler, מערכת אחסון קר ללא קרח עבור 96 צלחות באר וצינורות PCR</td><td>Eppendorf (ווסטבורי, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>מייבש צלחות (סעפת)</td><td>ייצור עיצוב מכני וחשמלי, משרד שירותי המחקר של NIH (בת'סדה, מרילנד, ארה"ב)</td>ערכות פריימר בהזמנה <td></td><td>מותאמת אישית</td></tr><tr><td></td><td>FBR (סילבר ספרינג, מרילנד, ארה"ב)</td><td>הזמנה</td><td></td>מותאמת אישית</tr><tr><td>pUC57 פלסמיד DNA</td><td>Genescript (פיסקאטאווי, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>SD1176</td><td></td></tr><tr><td>ללא Rnase 1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה</td><td>Life Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>DNase ללא RNase סט (50)</td><td>Qiagen (ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>מעבדות ביולוגיות ניו אינגלנד (Ipswitch, MA, ארה"ב)</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen (ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לרובוט (קצה שקוף קצות פיפט מעוקרים מראש)</td><td>הדסון רובוטיקס (ספרינגפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td><td>800350-S</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DNA זרע סלמון</td><td>Invitrogen (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>SoftLinx Version V</td><td>Hudson Robotics (ספרינגפילד, ניו ג'רזי, ארה"ב)</td>תוכנה <td>בהזמנה מותאמת אישית</td><td>לתכנות צעדי פיפטינג</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), ללא AmpErase UNG</td><td>Life Technologies (גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>ABgene אטמי צלחות דבק&nbsp; &nbsp;</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)</td><td>AB0580</td><td></td></tr><tr><td>יוביקוויטין C (UBC)</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)</td><td>Hs01871556_s1</td><td>ערכת פריימר/בדיקה HKG אנושית</td></tr><tr><td>ערכת סינתזה Verso cDNA</td><td>Thermo-Fisher Scientific (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)AB1453B</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ViiA 7 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב)4453536</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water-Ultra Pure</td><td>Quality Biological, INC. (גייטרסבורג, מרילנד, ארה"ב)</td><td>351-029-101</td><td></td></tr><tr><td>Zipvap 384 (גוף חימום מייבש צלחות)</td><td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, ארה"ב)</td><td>384-109A</td><td>מייבש צלחות</td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי rt-pcr assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי i ו- iii תת סוגי אינטרפרון

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

המתואר בדוח זה הוא בדיקת qRT-PCR לניתוח של שבעה עשר תת-סוגים של IFN אנושיים בפורמט צלחת של 384 בארות המשלב בדיקות ספציפיות ביותר של חומצת גרעין נעולה (LNA) ומשואות מולקולאריות (MB), תקני תמלול, פיפטינג רב-ערוצי אוטומטי וייבוש צלחות. קביעת הביטוי בקרב אינטרפרונים מסוג I (IFN), במיוחד שנים עשר תת-הסוגים IFN-α, מוגבלת על ידי זהות הרצף המשותפת שלהם; כמו כן, הרצפים של IFN מסוג III, במיוחד IFN-λ2 ו-λ3, דומים מאוד. בדיקה זו מספקת אמצעי אמין, ניתן לשחזור וזול יחסית לניתוח הביטוי של שבעה-עשר תעתיקי תת-הסוג של אינטרפרון.

Assay qRT-PCR מתואר יכול להיות מיושם לנתח דפוסי ביטוי של סוגי I ו- III IFN במגוון רחב של סוגי תאים והקשרים. לדוגמא, אני סוג של אדם וחתימות ביטוי III IFN נותחו בתאים היקפיים mononuclear הדם (PBMC) מ -6 תורמי מגורה עם ligands TLR; LPS C (25 מיקרוגרם / מיליליטר), (10 מיליליטר / ng), imiquimod (10 מיקרומטר), וoligonucleotides CPG (1 מיקרומטר) (איור 4): פולי אני. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת יישום גיליון אלקטרוני ומוצגים כתרשימי רדאר עם תת IFN-α מסודר בכיוון השעון לפי עץ פילוגנטי של רצף החלבון שלהם 27. תרשימי הרדאר של ביטוי IFN האנושי מוצגים בקנה מידת יומן מחושב באמצעות שתי שיטות שונות של ניתוח שולב בעיצוב assay: ערך CQ מוחלט המנורמל לHKG (ΔCq), ולהעתיק את מספר התבנית למיקרוגרם (מק&quot;ג) של רנ&quot;א הכל . ערכי מספר עותק מחושבים מo התוצאות<html> עקומת הסטנדרט של תמליל fa. הנתונים מראה כי חתימות ביטוי אנושיות IFN שהושרו על ידי אגוניסטים TLR הן יגנד ספציפיים. ראה איור 4 להלן כפי שהודגם לחתימות ביטוי IFN האנושיות, חתימות ביטוי של סוגי I ו- III IFN בקופי רזוס היו גם יגנד TLR הספציפי. PBMC מ 3 תורמים היו מגורה עם פולי אני: C (50 מיקרוגרם / מיליליטר), LPS (10 מיקרוגרם / מיליליטר), וimiquimod (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 3 שעות (איור 5). הביטוי תת סוג IFN בתאי unstimulated בתחילת המחקר היה נמוך. מספר מוגבל של IFN- תת באו לידי ביטוי בתגובה לLPS ופולי אני: C. בניגוד לכך, ביטוי IFN בתגובה לimiquimod היה גבוה והביטוי תת הסוג היה רחב. ביטוי של IFN-β וIFN-λ1 היה מוגבר על ידי כל שלושת TLR אגוניסטים 28. ראה תרשים 5 להלן תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> איור 1:. מספר הפריסה לצלחת 384 גם assay עם שבע עשרה סטי Pr / Pb יעד מתייחס לסט Pr / Pb. עקומות ארבע הנקודה סטנדרטית (המשולש אפור כהה) מתווספות לעמודי 1-5. סטי HKG Pr / Pb (הרקע לבן) מתווספים לעמודי 6 ו -7 עמודים שנותרו, 8-24, הם ספציפיים לאחד משבעת-העשרה סטי Pr / Pb. דוגמאות נוספות לשורות AP, מעמודים 6-24 (חיצים שחורים). שתי הבארות (O5, P5) בחלק התחתון של עמודה 5 מקבלות רק מים ותערובת אמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> איור 2:. הפריסה לצלחת מקור 96-היטב עם שבע עשרה סטי Pr / Pb מספר היעד מתייחס לPr / Pbלהגדיר. חיצים שחורים מייצגים כאשר סט Pr / Pb מתווסף בארות מרובות. תערובות NTC מתווספות לבארות המיועדות (הרקע אפור כהה). שתי הבארות (F3, G3) עם קווים אלכסוניים הן שאינן בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> איור 3: סכמטי של צעדים ספציפיים בפרוטוקול assay qRT-PCR תרשים AE לבחור חלקים מהפרוטוקול.. (א) שלב 1: הכנת דילולים סדרתי סטנדרטיים. הכנת תערובות המניה עובדת Pr / Pb וNTC: שלב 2 (ב). הכנה של צלחת מניות 96-גם עבודה של סטי Pr / Pb ותערובות של NTC: שלב 3.1 (C). שלב (D) 4.1-3: הכנת התערובות לטעינת צלחת 384 גם assay. (E) Step 4.5: טעינת צלחת 384 גם assay. תרשימים נקראים משמאל למעלה בפינה הימנית התחתונה. ריאגנטים לאינטרפרון assay (IFN) מאוחסנים ב -20 מעלות צלסיוס ושמותיהם מופיעים בעמודה השמאלית; פעולות נפרדות קווים בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> איור 4: החתימה האנושית ביטוי IFN בתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) שונה בתגובה לligands TLR משמש לגירוי PBMC היו מגורה עם ligands TLR וRNA היה לקצור לניתוח qRT-PCR.. האמצעים הגיאומטריים של תגובות השיא לפולי אני: C (25 מיקרוגרם / מיליליטר) בשעה 8 שעות (ריבועים אדומים), LPS (10 ng / ml) בשעה 4 שעות (משולשים ירוק), imiquimod (10 מיקרומטר) בשעה 16 שעות ( יהלומים סגולים), CPG (1 מיקרומטר) ב16 שעות (עיגולים שחורים), ושליטה unstimulated ב 16 שעות (עיגולים כחולים) מ -6 תורמים מוצגות ביומן 10 בקנה מידה כפונקציה של ביטוי של HKG UBC ΔCq (משמאל) או כעותק מספר לכל מיקרוגרם של RNA (מימין) . תת IFN-α מסודרים על פי עלילת פילוגנטי דמיון רצף חומצות האמיניות. נתון זה פורסם במקור באימונולוגיה והביולוגיה של תא 27. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> איור 5:. חתימת רזוס IFN מקוק הביטוי בתאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) שונה בתגובה לligands TLR משמש לגירוי PBMC משלושה קופי רזוס (שנקבע על ידי רבוע, יהלומים, ומשולש) היו מבודד מכל דם ו מגורה עם lipopolysaccharide (LPS) (10 מיקרוגרם / מיליליטר), פולי אני: C (50 מיקרוגרם / מיליליטר) או imiquimod (10 מיקרוגרם / מיליליטר). תאים נקצרו ב0 שעה (אופn צורות) או אחרי 3 שעות של גירוי TLR (צורות סגורות) למדידת ביטוי IFN. רמות התמליל אני סוג, II ו- III IFN מוצגות ביומן 10 בקנה מידה כפונקציה של ביטוי של HKG GAPDH ΔCq (משמאל) או כRNA מספר / מיקרוגרם עותק (מימין). נתון זה פורסם במקור בכתב העת של אינטרפרון וציטוקין המחקר 28. <img alt="טבלת 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> טבלה 1:. רצפי סט פריימר / בדיקה IFN אדם ותגובת מידע <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> טבלה 2:. רצפי סט מקוק רזוס IFN פריימר / בדיקה ותגובת מידע <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> ריכוז פלסמיד (FM) </td></tr><tr><td></td><td> </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2,500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> לוח 3: מידע ריכוז סט דילול רגיל. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> סטי IFN Pr / Pb הוסיפו </td><td> נפח מים מוסף (מיליליטר) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> לוח 4: המניה עובדת NTC מתערבבת מידע.

פרוטוקול זה מתאר בדיקת qRT-PCR בעלת תפוקה גבוהה לניתוח חתימות ביטוי IFN מסוג I ו-III. הבדיקה מפלה הבדלים בזוגות בסיסים בודדים בין התעתיקים הדומים מאוד של גנים אלה. באמצעות הרכבת אצווה ופיפטינג רובוטי, הבדיקות עקביות וניתנות לשחזור.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין ולהריץ פלטות בדיקה בעלות 384 בארות לצורך ניתוח בתושבה גבוהה (high throughput) של קבוצת גנים בעלי הומוגיה גבוהה, כגון תתי-סוגי האינטרפרון מסוג 1 ו-3. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת דילול סדרתי סטנדרטי המשמש להרצת פלטות הבדיקה. לאחר מכן, מוכנות תערובות מלאי העבודה של הפריימר, הפרוב ובקרת חסר תבנית (no template control) המשמשות להכנת הפלטות.לאחר מכן, פלטות בדיקה בעלות 384 בארות מוכנות באמצעות פיפט רב-ערוצי אוטומטי והן מיובשות לצורך אחסון. לבסוף, פלטות הבדיקה בעלות 384 הבארות מופעלות ומנותחות. בסופו של דבר, בדיקת ה-RT PCR quantitative real-time בעלת התפוקה הגבוהה משמשת להגדרת חתימות ביטוי של interferon במודלים של תרביות רקמה, במחקרי פתוגנים או בדגימות קליניות בהקשר של מחלות זיהומיות או אוטואינפלמטוריות.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון quantitative RT-PCR, המשתמשות בגרסאות סטנדרטיות של גושים ליניאריים או SYBR Green, הוא שניתן להשתמש במולקולרי ביקון (molecular beacon) ובגושים פלואורסצנטיים מסוג lock nucleic acid כדי להבחין בין הבדלים של זוג בסיסים בודד בין רצפים דומים מאוד. לאחר הפשרה, ערבוב בוורטקס (vortexing) וסרטיפוגה קצרה של סטנדרט ושל salmon sperm או SSDNA. הכין את תערובת ה-SSDNA והמים עבור 17 סדרות של דילול סטנדרטים על ידי ערבוב של 51 µL של SSDNA עם 20.3 mL של מים. העבר 190 µL מתערובת ה-SSDNA והמים למבחנה הראשונה של פס PCR בעל שמונה מבחנות ו-180 µL לחמש המבחנות הבאות.בצעו דילול של 1:20 על ידי העברה של 10 µL מהמלאי הסטנדרטי של 50 pM למסביב עם 190 µL של תערובת S-S-D-N-A water, ערבבו ב-vortex וסבבו במהירות במ centriuge. ברצועת ה-PCR, בצעו דילול של 1:10 על ידי העברה של 20 µL מהמבחנה שדוללה לאחרונה למבחנה הבאה בסדרה, ערבבו ב-vortex וסבבו במהירות ב-centrifuge את רצועת ה-PCR. חזרו על דילול ה-1:10 עד שהמבחנה האחרונה בסדרה תקבל את הסטנדרט.לאחר סימון של עד 17 מבחנות בנפח שני מיליליטר, השתמשו בפיפטה אלקטרונית רב-ערוצית של 12.5 מיקרוליטר כדי להוסיף שני מיקרוליטר של S-S-D-N-A לכל מבחנה, תוך שימוש בפריימרים ובגששים שהוכנו בהתאם לפרוטוקול הכתוב. הוסיפו את הפריימר הקדמי המתאים, הפריימר ההפוך ואת הגשש לכל מבחנה של סט גששים ממלאי העבודה, כדי להכין את תערובות מלאי העבודה של בקרת חסר תבנית (NTC).העבירו 14.3 µL מכל סט של פריימרים וגששים (primer probe set) למבחנה המתאימה של תערובת מלאי העבודה של ה-NTC, בהתאם לטבלה זו. לאחר הוצאת הכמות הדרושה של סטי הפריימרים והגששנים עבור תערובות מלאי העבודה של ה-NTC, הוסיפו 1.5 mL של מים כדי להביא את הנפח הסופי של כל מבחנת מלאי העבודה של סטי הפריימרים והגששנים ל-1.7 mL. הכינו פלטת מקור בעלת 96 בארות של סטי הפריימרים והגששנים ותערובות ה-NTC.הניחו פלטת 96 בארות חדשה בבלוק קירור מקורר לבארות 96, וסמנו את הבארות עם סט הפרימר והפרובה המתאים או תערובת NTC באמצעות פיפט רב-ערוצי אלקטרוני בנפח 250 µL. הוסיפו 66 µL של מים לכל סט של פרימר ופרובה. חלקו 82.5 µL של מים לארבע הבארות של יעד 17.העבירו 27.5 µL של מים לכל באר של תערובת anti C. לאחר מכן, הוסיפו 54 µL של מתניבי הפריימר המתאימים מהמלאי העובד לבארי מתניבי הפריימר הייעודיים. העבירו 67.5 µL מהמלאי העובד של מתניבי הפריימר של target 17 לבארי מתניבי הפריימר הייעודיים של target 17.הוסיפו 22.5 µL מתמיס העבודה של ה-NTC המתאים לבארים המיועדות. לאחר מכן, השתמשו במדבקת איטום לפלטה כדי לאטום את פלטת 96 הבארים, וסובבו בצנטריפוגה במשך דקה אחת ב-700 Gs עם מתאם לפלטת 96 בארים, כדי להבטיח שהתכנים נמצאים בתחתית הבארים. הניחו את הפלטה בוורטקס וערבבו ב-1000 RP במשך דקה אחת.לאחר מכן, סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-700 Gs למשך חמש דקות. כדי להכין את פלטות הבדיקה בעלות 384 בארות, הפעילו את הפספט רב-הערוצים האוטומטי ולחצו פעמיים על סמל התוכנה כדי לפתוח את הפרוטוקול להכנת פלטות בדיקת interferon להגדרת הפלטפורמה. הניחו קופסת טיפים למספפט מלאה לחלוטין במיקום פלטפורמה מספר אחת, את פלטת המקור בעלת 96 בארות במיקום ארבע, ופלטה חדשה בעלת 384 בארות במיקום שש.התחילו את ההרצה על ידי לחיצה על כפתור הניגון (play). כאשר ההרצה הושלמה, הקישו בעדינות את לוחית הבדיקה בעלת 384 הבארים על משטח שטוח כדי להבטיח שהנוזלים נמצאים בתחתית הבארים, והשלימו את איטום הלוחית באמצעות מדבקת איטום לאחר סבוב של הלוחית ב-700 Gs למשך דקה אחת. הסירו את מדבקת האיטום מהלוחית.הנח את פלטת הבדיקה בעלת 384 הבארים למייבש הפלטות, ומקם את המניפולטור (manifold) ל-384 בארים ישירות מעל הבארים. לאחר שתוכלי התכנים של פלטת הבדיקה בעלת 384 הבארים התייבשו, הנח מדבקת איטום דביקה חדשה, תווית רפיל מהירה (rapid foil label) ואחסן בחושך בטמפרטורה של 4 °C עד למועד הטעינה והרצת פלטת הבדיקה.הכינו שתי תערובות באריות עבור גן בית (housekeeping gene או HKG) על ידי דילול של 2 µL של S-S-D-N-A ב-84.9 µL של מים. לאחר מכן, הוסיפו לכל מבחנת HKG מסומנת 2 µL של SSD NA מדולל, 11.8 µL של מים, 23 µL של master mix ו-9.2 µL של סט ראשוני-גשוש (primer Probe set) תואם של 20 XHKG, ערבבו במערבל Vortex וצנטריפוגו לזמן קצר. לאחר הכנת הדגימות, הוסיפו לבקרת חיובית של CDNA 78.8 µL של master mix ו-54.8 µL של מים לכל מבחנה של דגימה ובקרת חיובית בנפח 24 µL. כדי להכין את תערובות הבארים עבור התקנים (standards) וה-NTC שיוספו ללוח בדיקה מיובש בעל 384 בארות, הוסיפו 165 µL של מים ל-275 µL של master mix במבחנה של 1.5 mL עבור תערובת באר ה-NTC, ובנפרד הוסיפו 52.5 µL של מים ל-52.5 µL של master mix במבחנה של 1.5 mL.הוצא פלטת בדיקה בעלת 384 בארות שהוכנה מראש ויובשה מטמפרטורה של 4 °C וסבב אותה בצנטריפוגה ב-700 g למשך דקה אחת. באמצעות פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית של 30 µL, העבר 7.5 µL של NTC. ערבב היטב כל בארת NTC.העבירו שש מיקרוליטרים של תמיסות התקן לבארים המתאימות, וערבבו היטב 1.5 מיקרוליטרים של התקן לכל באר תקן. לאחר מכן, העבירו 7.5 מיקרוליטרים של הדגימה לבארים המיועדות באמצעות פיפטה רב-ערוצית אלקטרונית של 12.5 מיקרוליטר. העבירו 2.5 מיקרוליטרים של תערובות הפריימר והפרוב של HKG לבארים המיועדות, ולאחר מכן אטמו את הפלטה באמצעות סרט דביק אופטי ובצעו סנטריפוגה ב-700 Gs למשך דקה אחת. ערבבו את פלטת 384 הבארים האטומה במערבל וורטקס במהירות של 2,600 RPM למשך שתי דקות, ובצעו סנטריפוגה ב-700 Gs למשך חמש דקות.לבסוף, הכניסו את פלטת הבדיקה האטومة למכשיר ה-Q-R-T-P-C-R. פתחו את התבנית עבור פריסת הבדיקה והשתמשו בתנאי התגובה הבאים. התחילו את ההרצה, ייצאו את הנתונים ונתחו אותם בהתאם לפרוטוקול הכתוב כפי שמוצג בדמות זו; נתוני הבעת החתימה של אינטרפרון מסוג 1 ו-3 בנישאי אדם נותחו בתאים מונונוקליאריים של דם פריפרי (p BMCs) מששת תורמים שעברו גירוי עם ליגנדים של קולטני Toll-like.הנתונים מוצגים כתרשימי רדאר בסולם לוגריתמי באמצעות שתי שיטות ניתוח, הכוללות ערך CQ מוחלט מנורמל לגן הבית ומספר העותקים של התבנית למיקרוגרם של RNA כולל. הנתונים מראים כי חתימות ביטוי של אינטרפרון אנושי שגורו על ידי אגוניסטים של TLR הן חתימות ביטוי ספציפיות לליגנד של אינטרפרון מסוג one ו-three ב-Resus Maccas. היו גם ספציפיים לליגנד TLR בניסוי זה, PBMC משלושה תורמים עוברו גירוי עם שלושה ליגנדים למשך שלוש שעות.ביטוי של תתי-סוגי אינטרפרון בתאים שאינם מעוררים בנקודת הבסיס היה נמוך, כפי שמוצג כאן. מספר מוגבל של תתי-סוגי אינטרפרון אלפא בוטאו בתגובה ל-LPS ו-poly ic. לעומת זאת, ביטוי האינטרפרון בתגובה ל-imiquimod היה גבוה, וביטוי תתי-הסוגים היה ביטוי רחב של אינטרפרון בטא ואינטרפרון.Lambda one הוגבר על ידי כל שלושת האגוניסטים של TLR. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ההכנה, ההרצה והניתוח של פלטות בדיקה תלת-ממדיות בעלות ארבעה בארות לניתוח בעלת תפוקה גבוהה של קבוצה דומה מאוד של גנים, כגון תתי-סוגי האינטרפרון מסוג 1 ו-3.

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

סרטון זה מדגים שיטה כמותית לזיהוי זיהום ויראלי באמצעות PCR שעתוק לאחור בזמן אמת. שלב השעתוק ההפוך ממיר את הרנ"א ל-cDNA, אשר לאחר מכן מוגבר באמצעות מחזורי PCR. נוכחותו של RNA ויראלי במדגם מאושרת על ידי ניתוח עקומות ההגברה והדיסוציאציה של ה- DNA המתקבל מה- PCR.

PCR כמותי בזמן אמת לאבחון זיהומים ויראליים

סרטון זה מדגים בדיקת פוספטאז אלקליין אלקליין עוברית המופרשת באמצעות תאי כתב אינטרפרון-α/β HEK-Blue כדי לכמת את האינטרפרונים מסוג I (IFNs) המשתחררים בעקבות גירוי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים על ידי תאי T CD4+ נגועים ב- HIV-1.

כימות של אינטרפרונים ביו-אקטיביים מסוג I באמצעות בדיקת כתב אלקליין אלקליין מופרש

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

ניתן להבחין בין ניתן להבחין בין כרומוזומי מעצבים של פרויקט גנום השמרים הסינתטיים, Sc2.0, לבין עמיתיהם המקוריים באמצעות בדיקת גנוטיפ מבוססת PCR הנקראת PCRTagging, שיש לה נקודת קצה של נוכחות/היעדרות. כאן אנו מתארים שיטת זיהוי PCR בזמן אמת בתפוקה גבוהה עבור גנוטיפ PCRTag.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

למדו פרוטוקול ל-qRT-PCR בזמן אמת לניתוח פרופילי ביטוי של תת-סוגי אינטרפרון מסוג I ו-III. השיטה מאפשרת הבחנה בהבדלי זוג בסיס בין רצפים דומים מאוד באמצעות בדיקות אוטומטיות.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

גלה סרטונים נוספים