תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין ולהפעיל 384 לוחות בדיקה היטב לניתוח תפוקה גבוהה של קבוצת גנים הומולוגית מאוד, כגון תת-סוגים של אינטרפרון מסוג אחד ושלושה. זה מושג על ידי הכנת דילול סדרתי סטנדרטי המשמש להפעלת לוחות הבדיקה. לאחר מכן, מכינים את בדיקת הפריימר וללא בקרת תבניות תערובות מלאי עבודה המשמשות להכנת הצלחות.

לאחר מכן מכינים את 384 לוחות בדיקת הבאר באמצעות פיפטר רב ערוצי אוטומטי והם מיובשים לאחסון. לבסוף, 384 לוחות בדיקת הבאר מופעלים ומנותחים. בסופו של דבר, בדיקת RT PCR R כמותית בזמן אמת בתפוקה גבוהה משמשת להגדרת חתימות ביטוי אינטרפרון במודלים של תרביות רקמה, חקר פתוגנים או בדגימות קליניות בהקשר של מחלות זיהומיות או אוטו-דלקתיות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו R כמותי שני PCR, תוך שימוש בבדיקות ליניאריות סטנדרטיות או ירוק סייברג, הוא שניתן להשתמש בבדיקות פלואורסצנטיות של משואה מולקולרית ונעילה של חומצת גרעין כדי להבחין בהבדלים בין זוגות בסיסים בודדים בין רצפים דומים מאוד לאחר הפשרה, מערבולת וצנטריפוגה קצרה של זרע סטנדרטי וסלמון או S-S-D-N-A. הכן את תערובת המים SSD NA עבור 17 ערכות הדילול הסטנדרטיות על ידי ערבוב 51 מיקרוליטר של S-S-D-N-A עם 20.3 מיליליטר מים. יש להוציא 190 מיקרוליטר מתערובת המים SS DNA לצינור הראשון של רצועת PCR עם שמונה צינורות ו-180 מיקרוליטר לחמשת הצינורות הבאים.

בצע דילול של 1 עד 20 על ידי העברת 10 מיקרוליטר מהמלאי הסטנדרטי של 50 פיקומולר לצינור עם 190 מיקרוליטר של מערבולת תערובת מים S-S-D-N-A וצנטריפוגה מהירה. רצועת ה-PCR מבצעת דילול של 1 עד 10 על ידי העברת 20 מיקרוליטר מהצינור המדולל האחרון לצינור הבא במערבולת הסדרה וצנטריפוגה מהירה של רצועת ה-PCR. חזור על הדילול של 1 עד 10 עד שהצינור האחרון בסדרה יקבל את התקן.

לאחר תיוג של עד 17 צינורות של שני מיליליטר, השתמש בפיפטה אלקטרונית רב-ערוצית בנפח 12.5 מיקרוליטר כדי להוסיף שני מיקרוליטר של S-S-D-N-A לכל צינור באמצעות פריימרים ובדיקות שהוכנו על פי פרוטוקול הטקסט. הוסף את הפריימר קדימה המתאים, פריימר הפוך ובדיקה לכל פריימר. בדיקת סט צינור מלאי עבודה להכנת בקרת התבנית ללא או תערובות מלאי עבודה NTC.

העבר 14.3 מיקרוליטר מכל ערכת בדיקה פריימר לצינור תערובת מלאי העבודה המתאים של NTC על פי טבלה זו. לאחר הסרת Eloqua של ערכות בדיקות הפריימר הנדרשות ל-NTC, מלאי העבודה מתערבב ב-1.5 מיליליטר מים כדי להביא את הנפח הסופי של כל ערכת בדיקה פריימר, צינור מלאי עבודה ל-1.7 מיליליטר. להכנת צלחת מקור של 96 באר של ערכות בדיקת הפריימר ותערובות NTC.

הנח צלחת חדשה של 96 בארות בבלוק קירור מקורר של 96 בארות ויעד את הבארות עם סט בדיקת הפריימר הנכון או תערובת NTC באמצעות פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית בנפח 250 מיקרוליטר. הוסף 66 מיקרוליטר מים לכל סט בדיקה פריימר. באר להוציא 82.5 מיקרוליטר מים לארבע בארות היעד.

יש להוציא 27.5 מיקרוליטר מים לכל תערובת אנטי C. ובכן לאחר מכן, הוסף 54 מיקרוליטר של בדיקות הפריימר הנכונות במלאי העבודה לבדיקות הפריימר המיועדות בחלוקת בארות. 67.5 מיקרוליטר של ערכת העבודה של בדיקת המטרה 17 למטרה המיועדת 17 בדיקות פריימר בבארות.

הוסף 22.5 מיקרוליטר מתערובת מלאי העבודה הנכונה של NTC לבארות הייעודיות. לאחר מכן השתמש בחותם צלחת דבק כדי לאטום את צלחת 96 הבארות והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-700 Gs כדי להבטיח שהתכולה נמצאת בתחתית הבארות עם מתאם 96 הבארות. מניחים את הצלחת במיקסר המערבולת ומערבבים בחום של 1000 סל"ד למשך דקה.

ואז צנטריפוגה את הצלחת ב -700 גרם למשך חמש דקות. כדי להכין את 384 לוחות הבדיקה של הבאר, הפעל את הפיפטר הרב-ערוצי האוטומטי ולחץ פעמיים על סמל התוכנה כדי לפתוח את הפרוטוקול לייצור לוחות בדיקת אינטרפרון להגדרת הפלטפורמה. הנח קופסת קצה פיפטה מלאה לחלוטין במצב פלטפורמה אחת, צלחת מקור 96 באר במצב ארבע וצלחת באר חדשה 384 במצב שש.

התחל את הריצה על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה בסיום הריצה. הקש בעדינות על לוחית בדיקת הבאר 384 על משטח ישר כדי להבטיח שהנוזלים נמצאים בתחתית הבארות והחל חותם צלחת דבק לאחר סיבוב הצלחת ב-700 Gs למשך דקה אחת. הסר את אטם לוחית ההדבקה.

הנח את לוחית בדיקת הבאר 384 לתוך מייבש הצלחות ומקם את סעפת הבאר 384 ישירות מעל הבארות. לאחר שתכולת 384 לוחות הבדיקה יבשה. מרחו חותם לוחית דבק חדש, תווית נייר כסף מהירה ואחסנו בחושך בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש לטעינה והפעלה של לוחית הבדיקה.

הכן שני גנים לניקיון משק בית או תערובות באר HKG על ידי דילול שני מיקרוליטרים של S-S-D-N-A ב-84.9 מיקרוליטר מים. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של ה-SSD NA המדולל 11.8 מיקרוליטר מים, 23 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ו-9.2 מיקרוליטר של הפריימר הנכון של 20 XHKG המוגדר לכל צינור HKG, מערבולת וצנטריפוגה קצרה לאחר הכנת הדגימות ו-CDNA בקרה חיובית ב-78.8 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ו-54.8 מיקרוליטר מים לכל דגימה של 24 מיקרוליטר וצינור בקרה חיובי. כדי להכין את התקנים ותערובות בארות NTC שיתווספו לצלחת בדיקת באר מיובשת של 384 הוסף 165 מיקרוליטר מים ל-275 מיקרוליטר של תערובת מאסטר בצינור של 1.5 מיליליטר לבאר NTC מערבבים ב-52.5 מיקרוליטר מים ל-52.5 מיקרוליטר תערובת מאסטר בצינור של 1.5 מיליליטר.

הסר צלחת בדיקה מיובשת של 384 באר שהוכנה בעבר מארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה ב-700 GS למשך דקה אחת. עם הפיפטה הרב-ערוצית האלקטרונית בנפח 30 מיקרוליטר מחלקים 7.5 מיקרוליטר NTC. מערבבים היטב לכל NTC.

ובכן לחלק שישה מיקרוליטר מהתקנים מערבבים היטב ו -1.5 מיקרוליטר מהתקן לכל תקן. ובכן, אז חלקו 7.5 מיקרוליטר מהדגימה לבארות המיועדות עם פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית בנפח 12.5 מיקרוליטר. הוצא 2.5 מיקרוליטר של פריימר HKG Probe מתערבב לבארות המיועדות לאחר שימוש בסרט דבק אופטי כדי לאטום את הצלחת והצנטריפוזיה ב-700 Gs למשך מערבולת דקה אחת, את צלחת 384 הבאר האטומה במיקסר המערבולת ב-2, 600 סל"ד למשך שתי דקות וצנטריפוגה ב-700 גבינה למשך חמש דקות.

לבסוף, הנח את לוחית הבדיקה האטומה במכונת Q-R-T-P-C-R. פתח את התבנית עבור פריסת הבדיקה ושימוש בתנאי התגובה הבאים. התחל לרוץ, לייצא ולנתח את הנתונים על פי פרוטוקול הטקסט כפי שניתן לראות באיור זה, חתימות ביטוי אינטרפרון אנושיות מסוג 1 ו-3 נותחו בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי או p BMCs משישה תורמים מגורים עם ליגנדים קולטנים דמויי טול.

הנתונים מוצגים כתרשימי מכ"ם בסולם לוג תוך שימוש בשתי שיטות ניתוח, כולל ערך CQ מוחלט מנורמל לגן משק הבית ומספר עותק של תבנית למיקרוגרם של RNA כולל. הנתונים מראים כי חתימות ביטוי אינטרפרון אנושיות שנוצרו על ידי אגוניסטים של TLR הן חתימות ביטוי ספציפיות לליגנד של אינטרפרון מסוג 1 ו-3 ב-Resus Maccas. היו גם ספציפיים לליגנד TLR בניסוי זה, PBMC משלושה תורמים היו מגורים עם שלושה ליגנדים למשך שלוש שעות.

ביטוי תת-סוג אינטרפרון בתאים לא מגורים בנקודת ההתחלה היה נמוך כפי שמוצג כאן. מספר מוגבל של תת-סוגים של אינטרפרון אלפא באו לידי ביטוי בתגובה ל-LPS ופולי-איק. לעומת זאת, ביטוי אינטרפרון בתגובה לאימיקימוד היה גבוה וביטוי תת-הסוג היה ביטוי רחב של אינטרפרון בטא ואינטרפרון.

למבדה אחת שופרה על ידי כל שלושת האגוניסטים של TLR לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין, להפעיל ו analyze. 3D ארבע לוחות בדיקה היטב לניתוח תפוקה גבוהה של קבוצת גנים דומה מאוד כמו תת-הסוגים של אינטרפרון מסוג אחד ושלושה.