לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

סרטון זה מדגים שיטה לתיעוד דינמיקת תיקון רקמות במיקרוסקופ סטריאוסקופיה באמצעות הדמיית time-lapse. הדבר מתבצע תחילה על ידי גידול עוברי דגי zebrafish לשלבי הלרבה, כאשר סנפיר הזנב התפתח למספיק גודל המאפשר ביצוע קל של קטיעות. בדרך כלל הדבר מושג לאחר הבקיעה.

השלב השני הוא קטיעה של סנפיר הזנב באמצעות מחט של מזרק. השלב השלישי הוא הצמדת הזחלים לתא דימות והקלטת סרט time-lapse תחת מיקרוסקופ סטריאומטרי. השלב האחרון הוא כימות של התחדשות סנפיר הזנב באמצעות תוכנה לניתוח דימויים כגון Bit Plains S או התוכנה בקוד פתוח image J.שלום. המעבדה שלי חוקרת ריפוי פצעים והתחדשות רקמות תוך שימוש בדגי zebrafish כמודל.

היום נדגים שיטה הלוכדת את הדינמיקה של תהליכים אלו בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה סטריאו בשדה בהיר. היום נדגים שיטה הלוכדת את התהליכים המוקדמים של התחדשות רקמה באמצעות סנפיר הזנב של זחלי דג הזברה. שיטת הדימיון המוצגת מספקת הזדמנות לצפות ולנתח התנהגויות במقياس של רקמה שלמה בהגדרת מיקרוסקופ פשוטה, הניתנת להתאמה בקלות לכל מיקרוסקופ סטריאו המצויד ביכולות צילום בשהיה (time-lapse).

אם כן, נתחיל. גידול דגי זברה לשלבי הזחלת. ניתן לצפות באופן המיטבי בריפוי פצעים בסנפיר הזנב לאחר שלבי הבקיעה, שכן לסנפיר הזנב יש התפתחות מספקת עד זמן זה, וניתן לבצע קטיעות בקלות מבלי לפגוע בחוט השדרה או ברקמות אחרות.

אספו את הביצים בקרבה ובסביבה מוגנת והדגרימו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 28 degree Celsius למשך לילה. למחרת בבוקר, הסירו את העוברים המתים ושטפו אותם במדיום עבור עוברים המכיל תמיסת מלח אקווריום instant ocean בריכוז של 0.03%. במידת הצורך, הוסיפו לצלחת מדיום עבור עוברים עם 0.003% pheno thyroid כדי למנוע פיגמנטציה של הזחלים.

לצורך הדגמה זו, נתנו לעוברים להתפתח באינקובטור עד יומיים לאחר ההפריה, כאשר הזחלים בקעו מהמקלויות (chorions) שלהם, כהכנה של תא הדמיה. בשלב זה, אנו מציגים שתי שיטות לבניית תא ההדמיה. שיטה אחת מורכבת מתא הדמיה העשוי מצינור PVC בדרגה המיועדת למי שתייה או מצינור טפלון, שניתן להשיג בכל חנות חומרי בניין.

השתמשו בצינור בעל קוטר חיצוני של 25 millimeter וקוטר פנימי של 20 millimeter, שכן זהו הגודל המתאים להצמדת זכוכית כיסוי. חתכו את הצינור כדי ליצור טבעות בעובי של 10 millimeter באופן אחיד ככל האפשר. השתמשו בנייר זכוכית כדי להחליק את הקצוות ושטפו במים ובאתנול.

הניחו לאוויר בתא להתייבש. שיטה שנייה כוללת שימוש בתא דימות עם תחתית זכוכית בטכנולוגיית מט (matte tech) מיוצרת מראש, בראש זכוכית, או הכנה של תא דימות מצלחית פטרי קטנה. כדי להכין תא דימות משלכם, השתמשו בצלחית פטרי של 35 או 50 מילימטר וקדחו חור של 10 מילימטר במכסה.

בשלב הבא, מרחים גריז סיליקון על החלק החיצוני של לוחות הכיסוי ומצמידים לוח כיסוי ריבועי או עגול בגודל 25 על 25 מילימטר לחלק החיצוני באמצעות קצה פיפטה נקי, כדי להבטיח שתוצר הקיבוע יישאר מחובר היטב. במהלך הליך הדימות, מצמידים רשת פלסטיק עדינה לחלק הפנימי של לוח הכיסוי. ניתן לבצע זאת על ידי גזירת הרשת בהתאם לקוטר הטבעת הפנימית, ולאחר מכן גזירת מלבן קטן שגודלו פי שלושה מגודל הזחלים במרכז הרשת.

קיבוע והדמיה של הזחלים לפני הפציעה. שלב זה מתאים לכימות מאוחר יותר של התחדשות הסנפיר. ראשית, הכין תמיסת agarose בריכוז 0.5% בעלת נקודת התכה נמוכה בתוך תווך עוברים (embryo medium) לצורך קיבוע הדגימה, על ידי העברת זחל שהורדם אל תמיסת ה-agarose שנשמרה בטמפרטורה של 42 °C.

בתוך בלוק חימום, העבירו את ה larvae עם טיפה של agros לפטריית Petri קטנה ומקמו את ה larvae על צדם. באמצעות קצה של micro loader סגור, המתינו שה-aros יתמצק והוסיפו תמיסת trica. עברו למיקרוסקופ הסטריאו שבו ייעשה שימוש בהמשך.

לצורך דימוי בשיטת time-lapse, אנו משתמשים במיקרוסקופ סטריאוסקופי zeiss discovery V 12 ובתוכנת Axio vision לצורך ההדגמה. ראשית, יש להתאים את הגדרות המיקרוסקופ על ידי בחירת העדשה וההגדלה המתאימות לדימוי. לאחר מכן, יש לבחור את מצב זיהוי המצלמה של המיקרוסקופ בתוכנת alvis.

בחרו במצב חי (live mode) כדי לצפות בזחליים על המסך. פתחו את חלון המאפיינים כדי לזהות את הבהירות באופן אוטומטי או כדי לכוון ידנית את הניגודיות בבסיס התאורה האחורית של המיקרוסקופ. הסירו את הזחליים משדה הראייה ובחרו בתכונת תיקון ההצללה (shading correction).

כדי למזער את רעשי הרקע, החזיר את הזחלים לשדה הראייה וצלם תמונה. שמור את התמונה כהכנה לפציעה. הסר את הזחלים מה-aros על ידי גירוד ה-aeros מהראש תחילה.

דבר זה מאפשר לזחלים להחליק החוצה מה-aeros על ידי משיכה עדינה של הראש הרחק מה-aeros שנותר. הכינו פלטת aeros בריכוז 1.5% באמצעות תמיסת מלח instant ocean. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הניחו את הזחלים על צדם על ה-aros שהתמצק ובצעו קטיעה של החלק הדיסטלי של סנפיר הזנב באמצעות מחט של מזרק בכיל 23.

קיבוע הזחלים לצילום בשיטת Time-lapse. נציג שתי שיטות לצילום בשיטת Time-lapse. בשיטה הראשונה, נראה כיצד לצלם את הזחלים בטבעת התא (chamber ring) לאחר קיבוע הזחלים.

גרדו בזהירות את ה-agros שהתגבש מסביב לסנפיר הזנב הדיסטלי באמצעות טיפ של פפיט micro loader עם מכסה. פעולה זו מאפשרת ריפוי תקין של הפצע או רגנרציה של הרקמה. ללא קיבוע של הרקמה, השתדלו שלא לפגוע בסנפיר שוב ושוב. במהלך הליך זה, הסירו מהתא פסולת לא רצויה המפריעה להליך הדימוג על ידי החלפת התמיסה הישנה.

באמצעות תמיסת Trica טרייה, מרחו גריז סיליקון על החלק העליון של התא ומלאו את טבעת התא בתמיסת Trica טרייה. הניחו זכוכית כיסוי בחלק העליון כדי לאטום את התא לפי שיטה שתיים. בשיטה זו, נראה לכם כיצד לצלם את הזחלים בצלחת פטרי בעלת מכסה מזכוכית.

הצמידו את הzeboa-larvae למכסה, למסך כיס ומלאו את המכסה בתמיסת trica. גרדו את ה-agros מסנף הזנב.

בשלב הבא, מרחו גריז סיליקון על השפה העליונה של התא התחתון ומלאו את התא בתמיסת trica. שפכו בזהירות את תמיסת ה-trica מהמכסה והפכו את המכסה כדי להטביל את הזחלים בתמיסת ה-trica שבתוך התא התחתון, פעולה שניתן לבצע בזווית קלה. כדי למנוע כיסי אוויר, התא ייאטם באמצעות גריז הסיליקון לצורך דימוי time-lapse, על מנת להבטיח שמירה על טמפרטורה תקינה של 28 degrees Celsius.

הרכיבו תא דגירה מחומם העשוי מקרטון ומניילון בועות לצורך בידוד, והשתמשו כיפה עם גוף חימום, כזו המשמשת לדגירה של ביצי תרנגולת, כמקור חום. מקמו את תא הדגירה מסביב למיקרוסקופ וכווננו את הטמפרטורה ל-28 °C. למשך כ-10 עד 20 דקות, או עד שהטמפרטורה תתייצב, פתחו את חלקו הקדמי של תא הדגירה המחומם והניחו את תא הדימוג על המיקרוסקופ.

העמידו את הדגימה כך שהזרימה (cover slip) תפנה כלפי מעלה לעבר העדשה. מקמו את סנפיר הזחלי בצורה כך ששני שלישים משדה הראייה יישארו ריקים, כדי להבטיח את לכידת הגדילה וההתחדשות של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. ללא צורך במיקום מחדש של הזחלים בחלון הרכישה הרב-ממדי (60 multi-dimensional acquisition) של התוכנה, בחרו באפשרות Z stack ו-time-lapse בלשונית Zack ובמצב slice mode.

בחרו את עובי הפרוסה ולאחר מכן בחרו את מצב ההפעלה והעצירה (start stop). הגדירו את המיקומים העליון והתחתון של הערימה (stack) בטבלת צילומי הזמן (time-lapse). בחרו את המרווח ואת משך הסרט, ולאחר מכן לחצו על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בהקלטה.

במהלך השעה הראשונה, בדקו את גבולות ה-Z וה-X של הלרווה. במידת הצורך, reposition את הלרווה לאורך הזמן, שכן היא עלולה להזזה עקב הגדילה או הבדלים בהרכב האגר. שמרו את הקובץ בסיום הקלטת ה-time-lapse והמשיכו לשלב העיבוד המאוחר (post-processing) וניתוח נתוני הכימות.

בסעיף זה, נדון בכמה דרכים לניתוח הנתונים שהופקו בשיטה אחת באמצעות תוכנת imas. ראשית, נדון באופן לקביעת צמיחת הסנפיר באמצעות תוכנת imas. פתחו את סרטון ה-time-lapse בתוכנת Amaris ושמרו את הקבצים בפורמט MRS.

כדי לשפר את ביצועי התוכנה, בחרו בתצוגה האורתוגונלית כדי להציג את הסרטון כהקרנה. כדי למדוד את אורך הסנפיר, בחרו באפשרות להוספת נקודות מדידה חדשות בסרגל הכלים השמאלי העליון. תחת רשימת הגדרת ערכי הסטטיסטיקה הנראים, בחרו את ערכי הסטטיסטיקה שיוצגו במצב קו.

בלשונית ההגדרות (settings), בחרו ב-pairs במאפייני התוויות (labels properties), בחרו ב-name ו-distance כדי להציג את המרחק בין נקודות A ו-B לצד קו המדידה, עברו למצב עריכה (edit mode) והחזיקו את מקש ה-shift לחוץ כדי לבחור את הנקודה הראשונה בסנפיר הדיסטלי. לאחר מכן, השתמשו באותה תצורה כדי לבחור את הנקודה השנייה בקצה הדיסטלי של ה-no accord. המרחק יוצג בתמונה וניתן לייצא אותו תחת לשונית הסטטיסטיקה (statistics).

על ידי בחירה בכפתור הדיסק export all בפינה השמאלית התחתונה, ניתן לייצא את כל הנתונים. כחלופה לאפשרות נקודות המדידה, ניתן להשתמש בצופה הפרוסות (slice viewer) למדידת מרחקים במצב תצוגת פרוסה. גללו לעמדה הרצויה והקליקו על המיקום הראשון והשני באמצעות לחצן העכבר השמאלי, והמרחק יוצג.

אפשרות זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת ייצוא נתונים. כעת נדון בקצרה כיצד לקבוע את שטח הסנפיר באמצעות התוכנה בקוד פתוח Image J. פתחו את סרטון ה-TimeLapse ב-Image J באמצעות תוסף המזהה את פורמט הקבצים של Zeiss Axio vision.

לחלופין, טענו רצף קבצי TIFF לא דחוסים. פעולה זו תבטיח שמידע הקובץ יישמר תחת analyze select set scale להגדרת המרחק והפיקסלים והמרחק הידוע, במידה ואלה לא נשמרו בקובץ. כמו כן, הגדירו את יחידת האורך ל-micrometers.

בסרגל הכלים, בחרו בכלי הבחירה החופשית (free hand selection tool) והקיפו את הפצע תוך לחיצה ממושכת על מקש העכבר השמאלי, בעודכם שורטטים לאורך שולי הפצע.

לחצו על אפשרות המדידה (measure) תחת ניתוח (analyze) כדי להציג את תוצאות הייצוג של שטח הפצע. קטיעה של הסנפיר מובילה להתחדשות חלקית במהלך 36 שעות לאחר הקטיעה. מדידות השטח של הסנפיר מראות כי קטיעת הסנפיר גורמת לירידה ברקמת הסנפיר עד לשעה ה-14 בקירוב לאחר הקטיעה, ככל הנראה עקב מוות תאי, ולאחר מכן חלה התחדשות דלילה של האורך.

השוואה בין הסנפיר הקטוע לסנפיר המשוחזר מראה עלייה של 2.48 מומש באורך הסנפיר בתוך 36 שעות. הקטיעה מעוררת תחילה אפקט של "שרוך חיסור" (purse string effect), המתאפיין בהתכווצויות באמצעות כבלי actin myosin הנוכחים בתאי קיפול הסנפיר, אשר נדחפים החוצה מפצע הקטיעה ומפונים לאחר מכן. אורך הגוף עולה בתחילה, אך הסנפיר אינו משתחזר.

במהלך השלבים המוקדמים. כ-14 שעות לאחר הקטיעה, הסנפיר מתחיל לצמוח ממסמך ממסמך מקרוב למרוחק (proximal to distal). לסיכום, תוצאותינו מדגימות כי קטיעה מעוררת התכווצות של הפצע, שעשויה להיות חיונית לקידום פליטת תאים (cell extrusion).

ברגע שהתהליך הושלם, הסנפיר מתחיל להתחדש. נראה כי מתרחש גדילה התפתחותית של הסנפיר. ללא קשר לתהליך זה, הצגנו שיטה המאפשרת תצפית על התהליכים הדינמיים של תיקון רקמות באמצעות זחלי zebrafish חיים.

פרוצדורה זו דורשת היבטים מסוימים אותם בחנו כדי למטב את התוצאה. יתרון ברור של שיטת הדימות המוצגת הוא שהיא ניתנת להתאמה בקלות לכל מיקרוסקופ סטריאואופטי המצויד במצלמת CCD ובתוכנת TimeLapse. היא מהווה גם חלופה זולה למערכת דימות קונפוקלית יקרה יותר.

בעוד ששיטה זו אינה משתמשת בפלואורסצנציה או בזיהוי תאים, ניתן להרחיבה ליישומים מעין אלו על ידי שימוש במערכת אוטומטית לבקרת רעידות (shutter control) ובתוכנת דה-קונבולוציה (deconvolution) לאחר הצילום, כדי לצפות בתהליכי תיקון פצעים והתחדשות ברזולוציה סוב-סלולרית. שיטה זו יכולה להעניק לסטודנטים הבנה טובה יותר של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים העומדים בבסיס תיקון והתחדשות רקמות. השקיפות האופטית, הקלות שבה ניתן להשתמש בעוברים ובזחלי zebrafish וההתאמה של המערכת לכל מיקרוסקופ סטריאו, הופכות אותה למתאימה להוראת ביולוגיה בסיסית של חולייתנים במסגרת כיתתית.