Name: לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: למד לתפוס דינמיקת תיקון רקמות בזחלי דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם צילום time-lapse. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על תהליכי החלמה וחידוש רקמות ברזולוציית תא בודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למתקן שירות הליבה של בעלי החיים במעבדה הביולוגית של MDI על תחזוקת דג הזברה. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי פרסי פיתוח מוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מענקים מספרי P20GM104318 (עבור COBRE) ו-P20GM103423 (INBRE) ומשרד ההגנה - USAMRAA (W81XWH-BAA-1).

<ol><li>San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cellular+events+occur+during+wound+healing+and+organ+regeneration+in+the+sea+cucumber+Holothuria+glaberrima%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima.</a> BMC Dev Biol. 7, 115(2007).</li>
<li>Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+of+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tales of regeneration in zebrafish.</a> Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).</li>
<li>Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+questions%2C+new+tools%2C+and+some+answers+to+the+mystery+of+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration.</a> Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).</li>
<li>Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+research+today%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regeneration research today.</a> Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).</li>
<li>Seifert, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+shedding+and+tissue+regeneration+in+African+spiny+mice+%28Acomys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys).</a> Nature. 489, 561-565 (2012).</li>
<li>Goss, R. J., Grimes, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+downgrowths+in+regenerating+rabbit+ear+holes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes.</a> J Morphol. 146, 533-542 (1975).</li>
<li>Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ear+tissue+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparison of ear tissue regeneration in mammals.</a> J Anat. 149, 55-63 (1986).</li>
<li>Allan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+response+and+Msx1+expression+after+human+fetal+digit+tip+amputation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro.</a> Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).</li>
<li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li>
<li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Dev Biol. 315, 125-135 (2008).</li>
<li>Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+regeneration+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Mammalian regeneration and regenerative medicine.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).</li>
<li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li>
<li>Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+four+msx+homeobox+genes+during+fin+development+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish.</a> Development. 121, 347-357 (1995).</li>
<li>Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digit+tip+regeneration+correlates+with+regions+of+Msx1+%28Hox+7%29+expression+in+fetal+and+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice.</a> Development. 121, 1065-1076 (1995).</li>
<li>Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+development+of+skin+cells+and+cutaneous+sensory+axons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).</li>
<li>Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+fin+primordia+of+zebrafish+larvae+regenerate+by+a+similar+growth+control+mechanism+with+adult+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration.</a> Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).</li>
<li>Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+functional+analysis+of+zebrafish+larval+fin+fold+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration.</a> Dev Biol. 325, 71-81 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+part+A.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface.</a> Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).</li>
<li>Dahm, N. -V. a <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDahm%2C+N-Va+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%2C+Issue+975%22">Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975</a>. , reprint, Oxford University Press. 303(2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish%3A+2nd+Edition+Genetics%2C+Genomics+and+Informatics%22">The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics</a>. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).</li>
<li>Concha, M. L., Adams, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+cell+divisions+and+cellular+morphogenesis+in+the+zebrafish+gastrula+and+neurula%3A+a+time-lapse+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis.</a> Development. 125, 983-994 (1998).</li>
<li>Distel, M., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Heated+Incubation+Chamber+around+a+Microscope+Stage+for+Time-Lapse+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Bitplane. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Imaris+V+6.1.0+Reference+Manual%22">Imaris V 6.1.0 Reference Manual</a>. , (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Mateus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+and+tissue+dynamics+underlying+zebrafish+fin+fold+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration.</a> PLoS One. 7, e51766(2012).</li>
<li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-2+controls+directional+chain+migration+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons.</a> PLoS Biol. 7, e1000240(2009).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li>
<li>Tadrous, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+PSF+generation+for+3D+brightfield+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution.</a> J Microsc. 237, 192-199 (2010).</li>
<li>Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+in+vivo+time-lapse+imaging+at+cellular+resolution+by+stereomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy.</a> Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השיטה המוצגת מאפשרת התבוננות ריפוי פצעים והתחדשות רקמות בחיים זחלי דג הזברה עם in vivo הדמיה הזמן לשגות בסטראו brightfield, באמצעות הגדרה פשוטה יחסית. הליך זה מחייב היבטים מסוימים חשובים שצריכים לבדוק, אשר יהיה לייעל את התוצאה: 1) ריכוזי agarose נמוכים (~ 0.5%) יהיה הפחתת חסמי צמיחה של דג הזברה הזחל גדל ללא הרף, 2) הסרת agarose סביב הסנפיר חשובה לא כדי לטשטש את תהליך הריפוי, 3) לכידת agarose ברשת פלסטיק שומרת לעצמה את agarose ובעלי חיים במצב יציב לאורך כל ההליך, ו- 4) שליטה בסביבת טמפרטורה נכונה, שהוא חיוני לקיום זחל. יש לנו להתאים מחומם חדר דגירה 23,24, אשר מנצל אריזת בועות שהודבקה על גבי קרטון, ודוד כיפת קווי לשלוט על הטמפרטורה וזרימת אוויר נאותה עם תנודות מינימליות במהלךהליך הדמיה. ניתן להכין חדר פשוט וחסכוני זה כדי להתאים לכל מיקרוסקופ. תא דגירה מחוממת דומה כבר מנוצל גם לעכברי הדמיה ופיתוח חומוס 24,29. אנו מציעים כי זחלים-קטוע מראש הם רכובים על תמונה שלפני קטיעה, demounted לקטיעה, ושב ורכב לזמן לשגות הדמיה. למרות שזה אפשרי על מנת לבצע את הפעולות הבאות בשלב אחד בחדר ההדמיה הסופי, בניסיון שלנו מצאנו כי קטיעת סנפיר הזנב על coverslip זכוכית אינה אופטימלית, כפי שהוא קורע את הרקמה ולא לגרום לחתך נקי. שיטת הקטיעה מבוססת agarose באמצעות מחט מזרק תוארה במקור על ידי Kawakami ועמיתיו (2004) 16, והוא גם, בניסיון שלנו, אידיאלי לבצע קטיעות. כך, הסדרה די המסובכת של צעדים שהצגנו היא גם מוצדקת ומבטיחה תוצאת התחדשות אופטימלית. הראינו larv שדג הזברה אל ב -2 DPF ניתן הדמיה עד 1.5 ימים בagarose ופתרון Tricaine. אנו משמשים פתרון מותאם pH Tricaine (pH7) מוכן עם מלח אוקיינוס ​​מיידי, שאינו מפריע לבריאותו של הדגימה לתקופה ההדמיה הוצגה. אנחנו בעבר אך גם הוכיחו כי באמצעות Tricaine במדיום Danieau מאפשר זמן לשגות הדמיה של 2.5 DPF דג הזברה זחל על מיקרוסקופ confocal לפחות 2 ימים 30. לפיכך, תנאי חיץ אופטימליים יכולים להאריך בריאות זחל והאורך של הדמיה. לחלופין, ריכוזים נמוכים Tricaine עשויים לשמש להרדמה, או 2-פנוקסיתנול, שבו מצאו נסבל היטב בשלבי זחל ומבוגרים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 60 שעות. כדי להימנע מפגמים בהתחדשות סנפיר, ואנחנו פינינו את agarose מסנפיר הזנב לפני ההדמיה. הנתונים שלנו מראה כי בתוך 1.5 ימים הסנפיר כבר התאחה לכ -60%. קצב התחדשות זו עולה בקנה אחד עם מחקר קודם הגדרת 3 ימיםזה זמן ממוצע להתחדשות סנפיר זנב בדג זברה זחלים עד 6 DPF 16. שיטות אלטרנטיביות לagarose אולם יכולות להיות מנוצלת כדי לעלות את הדג להדמיה. לדוגמא, דקה פלזמה קרישי 31 או פרופילן אתילן פלואור (FEP) צינורות מצופים בmethylcellulose ומלא בריכוזים נמוכים מאוד agarose (0.1%) היה מומלץ למיקרוסקופיה גיליון אור 32 ועשויה להיות מתאים לשיטה שלנו שהוצגה. עם זאת, אנו לא ממליצים agarose methylcellulose ושל 0.1%, כפי שהם דורשים כי הדגימה הם רכובים בחלק התחתון של התא בשל חוסר המיצוק של תקשורת אלה. ריכוזים גבוהים מאוד של methylcellulose יתר על כן יפיקו כיסי אוויר המבוססים על הניסיון שלנו, ואלה עלולים להפריע להליך ההדמיה. אם תקשורת אלה העדיפו בשימוש בתא התחתון, חשוב שמרחק עבודה מתאים בין העדשה האובייקטיבית והדגימה הוא הווה. יש לציין כי מ &#39;ethylcellulose כמדיום הרכבה מומלצת רק לתקופה של עד היום 1, כפי שהוא עלול להפריע לבריאות זחל 32. ההרכבה הדגימה במכסה עלולה לגרום לסחף כלפי מטה הכבידה איטי. לכן מומלץ לחלקים מרובים תמונה בכל נקודת זמן, אשר גם יכול להיות מוקרנת למטוס בודד או רק תמונות שנמצאות במישור המוקד ניתן חילוץ להרכבת הסרט הסופי. הדמיה הדגימה בתא התחתון יכולה להיות מתודולוגיה חלופית, כדי למנוע סחף כלפי מטה פוטנציאלי. קרישי פלזמה יכולים להיות שימושיים כדי למנוע סחף, כמו הפלזמה תדבק השכבה העוטפת החיצונית (EVL, periderm) 31, ולכן עשוי לייצב את הדגימה. אולם זה צריך להיבדק, כמו גם איך דג הזברה זחל ארוך יכול להישמר בקרישי פלזמה מבלי להפריע לבריאות זחל או התחדשות סנפיר. הסרט שלנו הורכב ניצול חלקים בודדים (26 מיקרומטר)של Z- מחסנית נרשמה, שכיסה את העובי המלא של הסנפיר (~ 10 מיקרומטר) ואשר היווה z-סחף פוטנציאלי של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. על מנת לשמור על מידע 3-D, אפשר גם להקרין Z- ערימות לתמונות בודדות. כי זה עלול לגרום לטשטוש של התמונה, deconvolution brightfield עשויה להיות רצויה. תוכנה, כגון Deconvolve או X3 Autoquant יכולה להיות מנוצלת למטרה זו. לחלופין, אלגוריתמים מתמטיים (שתוארו בTadrous 33) יכולים להיות מיושמים להשגת פונקצית נקודת התפשטות יחס גבוה אות לרעש (SNR). קבלת יחס אות לרעש גבוהה מייצגת את אחד המכשולים העיקריים בdeconvolution brightfield. למרות ששיטה זו דורשת ניגודיות גבוהה ועובי מדגם דק, זה יהיה מתאים להדמיה של סנפיר הזנב בשל הרוחב המוקטן שלה. יתרון ברור של שיטת ההדמיה שהוצגה הוא שזה במהירות להתאמה לכל סטראו מצויד במצלמת CCDתוכנת הזמן לשגות ד ומציעה אלטרנטיבה בעלות נמוכה למערכות הדמיה confocal יקרות יותר. בעוד ששיטה זו לא לנצל הקרינה לגילוי תאים, ניתן להאריכה ליישומים כאלה על ידי ניצול מערכת אוטומטית לשליטת תריס ותוכנת deconvolution הודעה הדמיה-34. זה יאפשר למשתמשים לצפות בתהליכי תיקון נוסף פצע והתחדשות עם תא בודד או רזולוציה subcellular על פני תקופות זמן ארוכות יותר. הבהירות האופטית והקלות בה עוברי ודג זברה זחל יכולה להיות מטופלים, ואת יכולת ההתאמה של שיטה זו לכל סטראו הופכת אותו מתאימה להוראת ביולוגיה חוליות בסיסית במסגרת כיתתית. בשיטה זו ניתן להקנות לתלמידי הבנה טובה יותר של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים שבבסיס תיקון והתחדשות רקמות. תהליכים ביולוגיים אחרים שכבר נתפסו עם שיטה דומה הם פיתוח דג הזברה עוברי 23,34 ולבפונקציה (לא פורסם). שיטה זו מציעה גם את האפשרות לתיקון פצע ניטור והתחדשות בזחלים שכבר מניפולציות גנטית ופרמקולוגית.

יכולתו של אורגניזם לתאם תהליכי תיקון רקמות לאחר פציעה היא קריטית להישרדותו 1. בעוד שלכל בעלי החיים יש את היכולת לרפא את פצעיהם, מידת ההתחדשות של הרקמות שונה מאוד בין המינים. למיני בעלי חוליות כמו דג זברה, סלמנדרות וראשנים של צפרדעים יש יכולת יוצאת דופן לחדש רקמות שאבדו, כולל התוספות שלהם, חלקים מהעיניים, הלב ומערכת העצבים המרכזית 2-4. מיני יונקים, כמו העכבר הקוצני האפריקאי והארנבות, מסוגלים לחדש חורים באפרכסת שלהם 5-7, ובני אדם ועכברים מחדשים חלקים מהכבד שלהם כמו גם את קצות האצבעות שלהם במהלך שלבים 8-12 של העובר והנעורים. למרות שעדיין לא ברור היטב מדוע וכיצד מינים מסוימים מחדשים רקמות בצורה יעילה יותר מאחרים, נוכחותם של מסלולים גנטיים דומים מצביעה על כך שמנגנונים אלה עשויים להיות רדומים במינים ללא פוטנציאל התחדשות גדול 13,14. לפיכך, הבהרת מנגנוני תיקון והתחדשות רקמות במינים עם תוצאות התחדשות משביעות רצון תועיל להתחדשות בבני אדם.
בחרנו בסנפיר הזנב של דג הזברה כפרדיגמה כדי להדגים את התחדשותו באמצעות סטריאומיקרוסקופיה של שדה בהיר בזמן-lapse. סנפיר הזנב של זחל דג הזברה פשוט מבחינה אנטומית בהשוואה למבנים הבוגרים המורכבים יותר, המורכב מאפיתל דו-שכבתי ומקופל עם אקסונים סומטוסנסוריים המעצבנים את העור המקיף תאים מזנכימליים הממוקמים מדיאלית 15. למרות ההבדלים האנטומיים, התחדשות סנפיר זנב הזחל דומה במידת מה להתחדשות סנפיר בוגר מבחינת החתימות המולקולריות ותגובות הצמיחה 16,17. בהשוואה לסנפיר הבוגר, להדמיית התחדשות סנפיר זנב הזחל יש מספר יתרונות: 1) התחדשות סנפיר הזחל הושלמה תוך 2-3 ימים בלבד 16, 2) ניתן להרכיב זחלים באגרוז נמס נמוך, ו-3) זחלים אינם זקוקים להאכלה עד ~ 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) בשל נוכחות שק החלמון. זה הופך את זחלי דג הזברה לאידיאליים לצפייה בדינמיקה של תיקון רקמות in vivo.
השיטה המוצגת מאפשרת ללכוד דינמיקה מפורטת העומדת בבסיס התהליכים המוקדמים של התחדשות הסנפיר. מחקרים רבים השתמשו במיקרוסקופיה קונפוקלית מבוססת פלואורסצנטי כדי לחקור תהליכים ביולוגיים תאיים ותת-תאיים בדגי זברה עובריים וזחלים. עם זאת, מערכי הדמיה קונפוקליים מתוחכמים אינם נגישים לכולם ויקרים מאוד בהשוואה לטכניקות הדמיה אחרות. לעומת זאת, המתודולוגיה המוצגת משתמשת בסטריאומיקרוסקופ Discovery V12 המצויד בתוכנת Axiovision ובמודול זמן-lapse, ובכך מספקת אלטרנטיבה משתלמת יותר לציוד הדמיה יקר לבחינת התנהגויות רקמות. אנו מדגימים כי ניתן להשתמש בשיטה זו להדמיית התחדשות רקמות ברזולוציה זמנית גבוהה בעלות מינימלית. ההשלכות של שיטה זו יכולות להתרחב מעבר לביולוגיה בסיסית לקידום מחקרי התחדשות יונקים באמצעות תרביות איברים, לפיתוח טיפולי באמצעות מסכים פרמקולוגיים וגנטיים, והיא יכולה לשמש ככלי הוראה במסגרת כיתתית.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>Bullseye Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-GCA500</td><td></td></tr><tr><td>נמס</td><td>נמוך אגרוז פישר ביוריאגנטים</td><td>BP1360-100</td><td></td></tr><tr><td>1-פניל-2-תיאוריאה</td><td>אלפא Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>אינסטנט אוקיינוס אקווריום מלח</td><td>חנות לחיות מחמד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול (0.1% תמיסה)</td><td>סיגמא</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10505</td><td></td></tr><tr><td>2-פנוקסיאתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 35 x 15 מ"מ</td><td>BD פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 x 15 מ"מ</td><td>צלחת פטרי 351007</td><td></td><td></td>בז BD</tr><tr><td>100 x 25 מ"מ</td><td>בז BD</td><td>351013</td><td></td></tr><tr><td>5.75 אינץ 'בורושילאט צנרת</td> זכוכית <td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ זכוכית עליונה זכוכית תחתונה צלחת (זכוכית: 0.085-0.115 מ"מ)</td> <td>MatTek Corporation</td><td>D35-20-0-TOP</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost / Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72191-75</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>CS-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Phiferglass Phiferglass פחם מסך חרקים - 48 אינץ'</td> <td>הום דיפו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום גבוה</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader קצות פיפטה 20 ומיקרו; l</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים -</td><td>כלי מדע עדינים</td> בזווית חדה <td>14037-10</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל Luer-Lok&trade; מזרק חד פעמי&nbsp;</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"ל Luer-Lok&trade; מזרק חד פעמי</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>23 גרם מחטי מזרק</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabDoctor Mini Dry Bath</td><td>MidSci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Discovery.V12 מיקרוסקופ מורכב&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo S 3.5X מטרה</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm&nbsp;</td><td>תוכנת Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, מהדורה 4.8.2SP1 (12-2011)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות brightfield stereomicroscopy

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

סנפיר זנב הזחל של דג הזברה אידיאלי לחקר התחדשות רקמות בשל הארכיטקטורה הפשוטה של קפל סנפיר הזחל, המורכב משתי שכבות עור הסוגרות מזנכימה לא מובחנת, ומכיוון שסנפיר זנב הזחל מתחדש במהירות תוך 2-3 ימים. באמצעות מערכת זו, אנו מדגימים שיטה ללכידת דינמיקת התיקון של סנפיר הזנב הקטוע באמצעות סטריאומיקרוסקופיה של שדה בהיר של זמן-lapse. אנו מדגימים כי כריתת סנפיר גורמת להתכווצות פצע הקטיעה ולשחול של תאים סביב שולי הפצע, מה שמוביל לפינוי שלהם לאחר מכן. התחדשות הסנפירים ממשיכה מהכיוון הפרוקסימלי לדיסטלי לאחר עיכוב קצר. בנוסף, ניתן לראות צמיחה התפתחותית של הזחל בכל השלבים. השיטה המוצגת מספקת הזדמנות להתבוננות וניתוח התנהגויות בקנה מידה של רקמות שלמות כגון התפתחות וצמיחה של סנפירים בהגדרת מיקרוסקופ פשוטה, הניתנת להתאמה בקלות לכל סטריאומיקרוסקופ עם יכולות זמן-lapse.

הטכניקה המוצגת הינה מתאימה על מנת להבהיר את דינמיקת תיקון רקמות בתגובה לקטיעה. הסרט מוכיח כי קטיעת הסנפיר תחילה מפעילה השפעת ארנק מיתרים, מאופיינת בהתכווצויות באמצעות כבלים יקטינו שרירן שנמצאים בסנפיר פי 28 (איור 5, B). במקביל, תאים נמתחים מהפצע (ראה סרט). ההתכווצות ייתכן אפוא שאמצעי לגרש תאים שסביר להניח שנועדו לעבור מוות של תאים. התוצאות שלנו מראות עוד כי הצמיחה ההתפתחותי של הזחל מתרחשת באופן עצמאי של התחדשות (סרט), ואילו התחדשות סנפיר אינה יוזמת עד שלאחר קטיעה כ -14 שעות, כפי שנמדדה על ידי אורך סנפיר ואזור במהלך 36 שעות הזמן הבא קטיעה (איור 5 ג , D). צמיחת סנפיר משובי הכוללת לאחר 1.5 ימים הייתה כ -60% מאורך הסנפיר המקורי (איור 5E). יחדיו, תוצאות אלה ממחישות כי tr הקטיעה<html> iggers התכווצות סנפיר, שחול של תאים מהפצע, ותגובת משובי מתעכבים באופן זמני. בעוד תאי extruded הם צפויים עתידים לעבור מוות של תאים, הטבע של תאים אלה צריך להיות מובהרים נוספים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig1.jpg" /> קאמרי הרכבה טבעת 1. הדמיה איור () מוצג הינה טבעת פלסטיק שמחוברת לcoverslip עם גריז סיליקון. רשת פלסטיק מצורף לחלק הפנימי של החדר עם ארבע נקודות קטנות של שומן סיליקון. (ב) התא המכיל את הזחל רכוב מלא בפתרון Tricaine ושקופיות זכוכית מחוברת לחלק העליון. (C) רכוב זחל בן יומו 2 (חץ) מוצג בהגדלה גבוהה יותר כדי לתאר את גודלו ביחס לרשת.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig2.jpg" /> איור 2. קאמרי הדמיה עשה הרכבה מצלחות פטרי. () מוצג הינה צלחת זכוכית מסחרית זכוכית העליונה תחתונה פטרי עם רשת פלסטיק המצורפת לcoverslip הזכוכית. (ב) המוצג הנו קאמרי צלחת פטרי בהקמה עצמית עם חור שנקדח לתוך המכסה וcoverslip המצורף מבחוץ עם גריז סיליקון. הרשת והזחל הם רכובים בתוך החדר המכיל פתרון Tricaine. לאטום את החדר, גריז סיליקון מוחל על השפה העליונה, החיצונית של התא התחתון והמכסה העליון המצורף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <i<html> alt מ&quot;ג = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,654 / 52654fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. תכנית של קטיעה והרכבה של זחל להדמיה. (א) לקטיעה, למקם את הזחל הרדים על צלחת פטרי מצופה agarose ולקטוע סנפיר הזנב עם מחט מזרק. (ב) להרכבה, להעביר את הזחל עם טפטפת העברה לתוך צינור 1.5 מיליליטר מלא 42 ° C agarose הנוזלי ופיפטה ירידה המכילה את הזחל לחדר ההדמיה, כוון את הדגים ולכסות את הקרושה agarose עם מדיום עובר. (C) תגרד את agarose מסנפיר הזנב באמצעות קצה תרי microloader פיפטה או כלי דומה ולהחליף בינוני עובר עם מדיום חדש. תמונה (D) סנפיר הזנב תחת סטראו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ithin-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig4.jpg" /> איור 4. תא דגירה מחומם נבנה עצמית. (AC) המוצג הנו תא דגירה מחומם מקרטון, פלסטיק הבועות וסקוטש. דוד קווי כיפה (שנועד במקור לדגירת עוף) מחובר לתא באמצעות קלטת אלומיניום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52654/52654fig5.jpg" /> איור 5. דינמיקת התחדשות Fin. () תכנית של שיטת assay הקטיעה וכימות סנפיר זנב מנוצל כדי לקבוע את אורך הסנפיר (חץ אדום) ואזור (קווי המתאר אדומים של הסנפיר). קטיעת סנפיר זנב (ב) בתחילה מעוררת התכווצות של הסנפיר, ואחריו Regeתולדת רקמת nerative. הסנפיר גם עובר צמיחה התפתחותית, כפי שמעיד עליית גודל הרוחב. (C) המוצג הנו אורך הסנפיר כפונקציה של זמן, חושף התחלת צמיחת משובי ליניארי ב ~ 14 hPa. (ד) כימות של אזור הסנפיר חושפת לראשונה ירידה בגודל, שניתן לייחס להתכווצות של הסנפיר. אחרי ~ 14 שעות, מגדילה גודל הסנפיר בקצב ליניארי. (E) השוואה של אורך הסנפיר לפני הקטיעה ואחרי 36 שעות תערוכות ~ 60% לצמיחה מחודשת. בר סולם: 100 מיקרומטר קיצורים: קדם-מגבר, לפני קטיעה; שעות שלאחר קטיעה, hPa; regen, התחדשות; מגבר, קטיעה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/52654fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52654/movie1.mp4">סרט.</a> התחדשות סנפיר במהלך 36 הזמןhr. מוצג הוא סנפיר זנב של זחל ישן 2.5 יום במהלך ההתחדשות. צמיחת משובי שלאחר קטיעת 30 דקות החל היא הדמיה ב -30 דקות במרווחים על סטראו באמצעות עדשה אובייקטיבית 3.5x.

אנו מציגים פרוטוקול ללכידת הדינמיקה של התחדשות סנפיר זנב זחל דג הזברה בקנה מידה של רקמה שלמה באמצעות סטריאומיקרוסקופיה מבוססת שדה בהיר. טכניקה זו מאפשרת ללכוד את דינמיקת ההתחדשות ברזולוציית תא בודד. ניתן להתאים מתודולוגיה זו לכל סטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת CCD ותוכנת זמן-lapse.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

סרטון זה מדגים שיטה לתיעוד דינמיקת תיקון רקמות במיקרוסקופ סטריאוסקופיה באמצעות הדמיית time-lapse. הדבר מתבצע תחילה על ידי גידול עוברי דגי zebrafish לשלבי הלרבה, כאשר סנפיר הזנב התפתח למספיק גודל המאפשר ביצוע קל של קטיעות. בדרך כלל הדבר מושג לאחר הבקיעה.השלב השני הוא קטיעה של סנפיר הזנב באמצעות מחט של מזרק. השלב השלישי הוא הצמדת הזחלים לתא דימות והקלטת סרט time-lapse תחת מיקרוסקופ סטריאומטרי. השלב האחרון הוא כימות של התחדשות סנפיר הזנב באמצעות תוכנה לניתוח דימויים כגון Bit Plains S או התוכנה בקוד פתוח image J.שלום. המעבדה שלי חוקרת ריפוי פצעים והתחדשות רקמות תוך שימוש בדגי zebrafish כמודל.היום נדגים שיטה הלוכדת את הדינמיקה של תהליכים אלו בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה סטריאו בשדה בהיר. היום נדגים שיטה הלוכדת את התהליכים המוקדמים של התחדשות רקמה באמצעות סנפיר הזנב של זחלי דג הזברה. שיטת הדימיון המוצגת מספקת הזדמנות לצפות ולנתח התנהגויות במقياس של רקמה שלמה בהגדרת מיקרוסקופ פשוטה, הניתנת להתאמה בקלות לכל מיקרוסקופ סטריאו המצויד ביכולות צילום בשהיה (time-lapse).אם כן, נתחיל. גידול דגי זברה לשלבי הזחלת. ניתן לצפות באופן המיטבי בריפוי פצעים בסנפיר הזנב לאחר שלבי הבקיעה, שכן לסנפיר הזנב יש התפתחות מספקת עד זמן זה, וניתן לבצע קטיעות בקלות מבלי לפגוע בחוט השדרה או ברקמות אחרות.אספו את הביצים בקרבה ובסביבה מוגנת והדגרימו אותן באינקובטור בטמפרטורה של 28 degree Celsius למשך לילה. למחרת בבוקר, הסירו את העוברים המתים ושטפו אותם במדיום עבור עוברים המכיל תמיסת מלח אקווריום instant ocean בריכוז של 0.03%. במידת הצורך, הוסיפו לצלחת מדיום עבור עוברים עם 0.003% pheno thyroid כדי למנוע פיגמנטציה של הזחלים.לצורך הדגמה זו, נתנו לעוברים להתפתח באינקובטור עד יומיים לאחר ההפריה, כאשר הזחלים בקעו מהמקלויות (chorions) שלהם, כהכנה של תא הדמיה. בשלב זה, אנו מציגים שתי שיטות לבניית תא ההדמיה. שיטה אחת מורכבת מתא הדמיה העשוי מצינור PVC בדרגה המיועדת למי שתייה או מצינור טפלון, שניתן להשיג בכל חנות חומרי בניין.השתמשו בצינור בעל קוטר חיצוני של 25 millimeter וקוטר פנימי של 20 millimeter, שכן זהו הגודל המתאים להצמדת זכוכית כיסוי. חתכו את הצינור כדי ליצור טבעות בעובי של 10 millimeter באופן אחיד ככל האפשר. השתמשו בנייר זכוכית כדי להחליק את הקצוות ושטפו במים ובאתנול.הניחו לאוויר בתא להתייבש. שיטה שנייה כוללת שימוש בתא דימות עם תחתית זכוכית בטכנולוגיית מט (matte tech) מיוצרת מראש, בראש זכוכית, או הכנה של תא דימות מצלחית פטרי קטנה. כדי להכין תא דימות משלכם, השתמשו בצלחית פטרי של 35 או 50 מילימטר וקדחו חור של 10 מילימטר במכסה.בשלב הבא, מרחים גריז סיליקון על החלק החיצוני של לוחות הכיסוי ומצמידים לוח כיסוי ריבועי או עגול בגודל 25 על 25 מילימטר לחלק החיצוני באמצעות קצה פיפטה נקי, כדי להבטיח שתוצר הקיבוע יישאר מחובר היטב. במהלך הליך הדימות, מצמידים רשת פלסטיק עדינה לחלק הפנימי של לוח הכיסוי. ניתן לבצע זאת על ידי גזירת הרשת בהתאם לקוטר הטבעת הפנימית, ולאחר מכן גזירת מלבן קטן שגודלו פי שלושה מגודל הזחלים במרכז הרשת.קיבוע והדמיה של הזחלים לפני הפציעה. שלב זה מתאים לכימות מאוחר יותר של התחדשות הסנפיר. ראשית, הכין תמיסת agarose בריכוז 0.5% בעלת נקודת התכה נמוכה בתוך תווך עוברים (embryo medium) לצורך קיבוע הדגימה, על ידי העברת זחל שהורדם אל תמיסת ה-agarose שנשמרה בטמפרטורה של 42 °C.בתוך בלוק חימום, העבירו את ה larvae עם טיפה של agros לפטריית Petri קטנה ומקמו את ה larvae על צדם. באמצעות קצה של micro loader סגור, המתינו שה-aros יתמצק והוסיפו תמיסת trica. עברו למיקרוסקופ הסטריאו שבו ייעשה שימוש בהמשך.לצורך דימוי בשיטת time-lapse, אנו משתמשים במיקרוסקופ סטריאוסקופי zeiss discovery V 12 ובתוכנת Axio vision לצורך ההדגמה. ראשית, יש להתאים את הגדרות המיקרוסקופ על ידי בחירת העדשה וההגדלה המתאימות לדימוי. לאחר מכן, יש לבחור את מצב זיהוי המצלמה של המיקרוסקופ בתוכנת alvis.בחרו במצב חי (live mode) כדי לצפות בזחליים על המסך. פתחו את חלון המאפיינים כדי לזהות את הבהירות באופן אוטומטי או כדי לכוון ידנית את הניגודיות בבסיס התאורה האחורית של המיקרוסקופ. הסירו את הזחליים משדה הראייה ובחרו בתכונת תיקון ההצללה (shading correction).כדי למזער את רעשי הרקע, החזיר את הזחלים לשדה הראייה וצלם תמונה. שמור את התמונה כהכנה לפציעה. הסר את הזחלים מה-aros על ידי גירוד ה-aeros מהראש תחילה.דבר זה מאפשר לזחלים להחליק החוצה מה-aeros על ידי משיכה עדינה של הראש הרחק מה-aeros שנותר. הכינו פלטת aeros בריכוז 1.5% באמצעות תמיסת מלח instant ocean. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הניחו את הזחלים על צדם על ה-aros שהתמצק ובצעו קטיעה של החלק הדיסטלי של סנפיר הזנב באמצעות מחט של מזרק בכיל 23.קיבוע הזחלים לצילום בשיטת Time-lapse. נציג שתי שיטות לצילום בשיטת Time-lapse. בשיטה הראשונה, נראה כיצד לצלם את הזחלים בטבעת התא (chamber ring) לאחר קיבוע הזחלים.גרדו בזהירות את ה-agros שהתגבש מסביב לסנפיר הזנב הדיסטלי באמצעות טיפ של פפיט micro loader עם מכסה. פעולה זו מאפשרת ריפוי תקין של הפצע או רגנרציה של הרקמה. ללא קיבוע של הרקמה, השתדלו שלא לפגוע בסנפיר שוב ושוב. במהלך הליך זה, הסירו מהתא פסולת לא רצויה המפריעה להליך הדימוג על ידי החלפת התמיסה הישנה.באמצעות תמיסת Trica טרייה, מרחו גריז סיליקון על החלק העליון של התא ומלאו את טבעת התא בתמיסת Trica טרייה. הניחו זכוכית כיסוי בחלק העליון כדי לאטום את התא לפי שיטה שתיים. בשיטה זו, נראה לכם כיצד לצלם את הזחלים בצלחת פטרי בעלת מכסה מזכוכית.הצמידו את הzeboa-larvae למכסה, למסך כיס ומלאו את המכסה בתמיסת trica. גרדו את ה-agros מסנף הזנב.בשלב הבא, מרחו גריז סיליקון על השפה העליונה של התא התחתון ומלאו את התא בתמיסת trica. שפכו בזהירות את תמיסת ה-trica מהמכסה והפכו את המכסה כדי להטביל את הזחלים בתמיסת ה-trica שבתוך התא התחתון, פעולה שניתן לבצע בזווית קלה. כדי למנוע כיסי אוויר, התא ייאטם באמצעות גריז הסיליקון לצורך דימוי time-lapse, על מנת להבטיח שמירה על טמפרטורה תקינה של 28 degrees Celsius.הרכיבו תא דגירה מחומם העשוי מקרטון ומניילון בועות לצורך בידוד, והשתמשו כיפה עם גוף חימום, כזו המשמשת לדגירה של ביצי תרנגולת, כמקור חום. מקמו את תא הדגירה מסביב למיקרוסקופ וכווננו את הטמפרטורה ל-28 °C. למשך כ-10 עד 20 דקות, או עד שהטמפרטורה תתייצב, פתחו את חלקו הקדמי של תא הדגירה המחומם והניחו את תא הדימוג על המיקרוסקופ.העמידו את הדגימה כך שהזרימה (cover slip) תפנה כלפי מעלה לעבר העדשה. מקמו את סנפיר הזחלי בצורה כך ששני שלישים משדה הראייה יישארו ריקים, כדי להבטיח את לכידת הגדילה וההתחדשות של הסנפיר במהלך הליך ההדמיה. ללא צורך במיקום מחדש של הזחלים בחלון הרכישה הרב-ממדי (60 multi-dimensional acquisition) של התוכנה, בחרו באפשרות Z stack ו-time-lapse בלשונית Zack ובמצב slice mode.בחרו את עובי הפרוסה ולאחר מכן בחרו את מצב ההפעלה והעצירה (start stop). הגדירו את המיקומים העליון והתחתון של הערימה (stack) בטבלת צילומי הזמן (time-lapse). בחרו את המרווח ואת משך הסרט, ולאחר מכן לחצו על כפתור ההפעלה כדי להתחיל בהקלטה.במהלך השעה הראשונה, בדקו את גבולות ה-Z וה-X של הלרווה. במידת הצורך, reposition את הלרווה לאורך הזמן, שכן היא עלולה להזזה עקב הגדילה או הבדלים בהרכב האגר. שמרו את הקובץ בסיום הקלטת ה-time-lapse והמשיכו לשלב העיבוד המאוחר (post-processing) וניתוח נתוני הכימות.בסעיף זה, נדון בכמה דרכים לניתוח הנתונים שהופקו בשיטה אחת באמצעות תוכנת imas. ראשית, נדון באופן לקביעת צמיחת הסנפיר באמצעות תוכנת imas. פתחו את סרטון ה-time-lapse בתוכנת Amaris ושמרו את הקבצים בפורמט MRS.כדי לשפר את ביצועי התוכנה, בחרו בתצוגה האורתוגונלית כדי להציג את הסרטון כהקרנה. כדי למדוד את אורך הסנפיר, בחרו באפשרות להוספת נקודות מדידה חדשות בסרגל הכלים השמאלי העליון. תחת רשימת הגדרת ערכי הסטטיסטיקה הנראים, בחרו את ערכי הסטטיסטיקה שיוצגו במצב קו.בלשונית ההגדרות (settings), בחרו ב-pairs במאפייני התוויות (labels properties), בחרו ב-name ו-distance כדי להציג את המרחק בין נקודות A ו-B לצד קו המדידה, עברו למצב עריכה (edit mode) והחזיקו את מקש ה-shift לחוץ כדי לבחור את הנקודה הראשונה בסנפיר הדיסטלי. לאחר מכן, השתמשו באותה תצורה כדי לבחור את הנקודה השנייה בקצה הדיסטלי של ה-no accord. המרחק יוצג בתמונה וניתן לייצא אותו תחת לשונית הסטטיסטיקה (statistics).על ידי בחירה בכפתור הדיסק export all בפינה השמאלית התחתונה, ניתן לייצא את כל הנתונים. כחלופה לאפשרות נקודות המדידה, ניתן להשתמש בצופה הפרוסות (slice viewer) למדידת מרחקים במצב תצוגת פרוסה. גללו לעמדה הרצויה והקליקו על המיקום הראשון והשני באמצעות לחצן העכבר השמאלי, והמרחק יוצג.אפשרות זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת ייצוא נתונים. כעת נדון בקצרה כיצד לקבוע את שטח הסנפיר באמצעות התוכנה בקוד פתוח Image J. פתחו את סרטון ה-TimeLapse ב-Image J באמצעות תוסף המזהה את פורמט הקבצים של Zeiss Axio vision.לחלופין, טענו רצף קבצי TIFF לא דחוסים. פעולה זו תבטיח שמידע הקובץ יישמר תחת analyze select set scale להגדרת המרחק והפיקסלים והמרחק הידוע, במידה ואלה לא נשמרו בקובץ. כמו כן, הגדירו את יחידת האורך ל-micrometers.בסרגל הכלים, בחרו בכלי הבחירה החופשית (free hand selection tool) והקיפו את הפצע תוך לחיצה ממושכת על מקש העכבר השמאלי, בעודכם שורטטים לאורך שולי הפצע.לחצו על אפשרות המדידה (measure) תחת ניתוח (analyze) כדי להציג את תוצאות הייצוג של שטח הפצע. קטיעה של הסנפיר מובילה להתחדשות חלקית במהלך 36 שעות לאחר הקטיעה. מדידות השטח של הסנפיר מראות כי קטיעת הסנפיר גורמת לירידה ברקמת הסנפיר עד לשעה ה-14 בקירוב לאחר הקטיעה, ככל הנראה עקב מוות תאי, ולאחר מכן חלה התחדשות דלילה של האורך.השוואה בין הסנפיר הקטוע לסנפיר המשוחזר מראה עלייה של 2.48 מומש באורך הסנפיר בתוך 36 שעות. הקטיעה מעוררת תחילה אפקט של "שרוך חיסור" (purse string effect), המתאפיין בהתכווצויות באמצעות כבלי actin myosin הנוכחים בתאי קיפול הסנפיר, אשר נדחפים החוצה מפצע הקטיעה ומפונים לאחר מכן. אורך הגוף עולה בתחילה, אך הסנפיר אינו משתחזר.במהלך השלבים המוקדמים. כ-14 שעות לאחר הקטיעה, הסנפיר מתחיל לצמוח ממסמך ממסמך מקרוב למרוחק (proximal to distal). לסיכום, תוצאותינו מדגימות כי קטיעה מעוררת התכווצות של הפצע, שעשויה להיות חיונית לקידום פליטת תאים (cell extrusion).ברגע שהתהליך הושלם, הסנפיר מתחיל להתחדש. נראה כי מתרחש גדילה התפתחותית של הסנפיר. ללא קשר לתהליך זה, הצגנו שיטה המאפשרת תצפית על התהליכים הדינמיים של תיקון רקמות באמצעות זחלי zebrafish חיים.פרוצדורה זו דורשת היבטים מסוימים אותם בחנו כדי למטב את התוצאה. יתרון ברור של שיטת הדימות המוצגת הוא שהיא ניתנת להתאמה בקלות לכל מיקרוסקופ סטריאואופטי המצויד במצלמת CCD ובתוכנת TimeLapse. היא מהווה גם חלופה זולה למערכת דימות קונפוקלית יקרה יותר.בעוד ששיטה זו אינה משתמשת בפלואורסצנציה או בזיהוי תאים, ניתן להרחיבה ליישומים מעין אלו על ידי שימוש במערכת אוטומטית לבקרת רעידות (shutter control) ובתוכנת דה-קונבולוציה (deconvolution) לאחר הצילום, כדי לצפות בתהליכי תיקון פצעים והתחדשות ברזולוציה סוב-סלולרית. שיטה זו יכולה להעניק לסטודנטים הבנה טובה יותר של התהליכים הביולוגיים הבסיסיים העומדים בבסיס תיקון והתחדשות רקמות. השקיפות האופטית, הקלות שבה ניתן להשתמש בעוברים ובזחלי zebrafish וההתאמה של המערכת לכל מיקרוסקופ סטריאו, הופכות אותה למתאימה להוראת ביולוגיה בסיסית של חולייתנים במסגרת כיתתית.

capturing-tissue-repair-zebrafish-larvae-with-time-lapse-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

מקור: Volpe, B. A., ,  ואחרים בדיקת אבלציה והתחדשות לייזר מבוססת מיקרוסקופ קונפוקלי בתאים בין-נוירומאסטים של דג הזברה. J. Vis. exp.{{TAG_ 31}} (2020) } סרטון זה מדגים ניטור התאוששות תאים בין-עצביים בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, מעקב אחר מוות ותיקון תאים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בזמן-lapse.

ניטור התאוששות של תאים בין-נוירומסטים בלייזר בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר הוא מכשיר ממודר שנועדה אוריינט לרסן את הזחלים דג זברה. העיצוב מאפשרת חיתוך זנב ארוך טווח אוסף של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של ריפוי הפצע והתחדשות.

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לביצוע הדמיה חיה וניתוח כמותי של דינמיקת קולטן כימותרפיה בנויטרופילים של דגי...

הדמיה חיה של קולטני כימוקין בנויטרופילים של דגי זברה במהלך תגובות לפצעים

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

שיטה חדשנית לייצור מכשירים מיקרופלואידיים באמצעות למינציה של פוליאתילן טרפתלט (PET) מפחיתה משמעותית את העלות והמורכבות של לכידה והדמיה של עוברי דג זברה חיים מרובים.

תכני מיקרופלואידיקה למינציה פוליאתילן טרפתלט בעלות נמוכה עבור הדמיית דג זברה מרובה

למד לתפוס דינמיקת תיקון רקמות בזחלי דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו עם צילום time-lapse. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על תהליכי החלמה וחידוש רקמות ברזולוציית תא בודד.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

גלה סרטונים נוספים