בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק

המטרה הכוללת של סרטון זה היא לתאר כיצד להכין מדיום מותנה בעצם, ולבדוק את פעילותו במבחנה. זה מושג על ידי קצירת שבבי עצם מהלסת התחתונה של חזיר באמצעות מגרד עצם. השלב השני הוא טיפול בחום, דה-מינרליזציה או לא לעשות דבר לשבבי העצם לפני הדגירה שלהם במדיום תרבית למשך 24 שעות.

לאחר מכן, נאסף המדיום המותנה בעצם המכיל את כל הגורמים המשתחררים משבבי העצם. השלב האחרון הוא לעורר תאים עם המדיום המותנה בעצם או לדגור מראש חומר ביולוגי עם המדיום המותנה בעצם ותאי זרע עליו לאחר תקופת הדגירה. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-PCR כמותי בזמן אמת כדי להראות שינויים בביטוי הגנים של התאים לאחר הטיפול.

שימוש בשתלי עצם אוטולוגיים לבד או בשילוב עם ביו-חומרים אחרים ממריץ את התחדשות העצם בפגמים בעצם סביב השתל, ובכך מבטיח תוצאות טובות לטווח ארוך. סרטון זה מציג בדיקה ביולוגית במבחנה, השימושית בקביעת התגובה הגנטית של תאים מסיביים לביו-מולקולות במצב העצם. מדיום מצב עצם בינוני יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטראומה, הלסתות והשיניים, כגון מדוע עצם אוטולוגית היא המטרה של השתל הסטנדרטי בהתחדשות העצם.

הכנת מדיום מצב מעצם מעובדת, כמו השתלת עצם אוטומטית שטופלה בחום או מטריצת עצם מעובדת יכולה להיות קשה לסטנדרטיזציה. לכן, חשוב לדייק. כדי להתחיל, השיגו לסתות תחתונות טריות מקצב מקומי והניחו אותן על משטח יציב.

לאחר מכן, השתמש בפריאוסטאום כדי לשחרר דש פריוסטאום בעובי מלא תוך הקפדה מיוחדת לא להשאיר אף אחת מהרקמות הרכות מחוברות לעצם. לאחר הסרת הפריאוסטאום, אחזו בחוזקה במגרד העצם והשתמשו בתנועות ארוכות כדי לקצור שבבי עצם מהצד הבוקאלי של הלסת התחתונה. השליכו את כל שבבי העצם שאורכם קטן ממילימטר אחד.

מנע את התייבשות שבבי העצם על ידי כיסויים מהירים במדיום תרבית בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. לאחר שנאספו מספיק שבבי עצם, הכינו אצווה לבקרה תרמית על ידי פיסטור חמישה גרם משבבי העצם. מפסטרים את הצ'יפס על ידי חימום למשך 30 דקות בחום של 80 מעלות צלזיוס או חיטוי למשך 20 דקות בחום של 121 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הכינו בקרה דה-מינרלית על ידי הוספת חמישה גרם של שבבי עצם לתמיסה מולרית אחת של חומצה הידרוכלורית והנחתם על שייקר למשך ארבע עד שש שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שוטפים את שבבי העצם שוב ושוב במדיום תרבית עד שמגיעים ל- pH ניטרלי. מניחים חמישה גרם שבבי עצם טריים וחמישה גרם מכל אחד מתכשירי הבקרה בכלים נפרדים, ומוסיפים 10 מיליליטר תרבית טרייה לכל מנה.

לאחר מכן דגרו את הדגימות באווירה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות על מנת ליצור את המדיום המותנה למחרת. מוציאים את המדיה מכל מנה ומניחים אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה העצם ממוזגת בכוח הכבידה פי 200 למשך 10 דקות כדי להסיר כל פסולת.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והעביר אותו דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרון, אחסן את עלי קוואדים קפואים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים. התחל בזריעת תאים מזנכימליים אנושיים כגון תאי עצם או פיברובלסטים של רצועות חניכיים וחניכיים לתוך צלחת של 12 לווייתנים בריכוז של 30,000 תאים לסנטימטר מרובע. מכסים את התאים במצע גידול ונותנים לתאים להיצמד לצלחת למשך הלילה למחרת בבוקר.

השליכו את מדיום התרבות ושטפו את התאים עם PBS חם מראש ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לעורר את התאים על ידי הוספת מדיום תרבית ללא סרום חם מראש עם ובלי מדיום מותנה של 20% עצם. אם בודקים גם את יכולת הספיגה של חומר ביולוגי, הוסף את המדיום המותנה בעצם, כולל כל בקרות לצינורות המכילים את החומר הביולוגי המעניין, ודגר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן שטפו את החומר הביולוגי במרץ עם PBS חם מראש וזרעו תאים מזנכימליים אנושיים בריכוז של 30,000 תאים לסנטימטר רבוע על החומר. דגרו את התאים לבד או את אלה שנזרעו על החומרים הביולוגיים באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות CS למשך 24 שעות. ואז השליכו את מדיום התרבות.

שטפו את התאים עם PBS חם מראש וחלצו את התאים RNA באמצעות פרוטוקול בידוד RNA סטנדרטי. לאחר בידוד ה-RNA, הכינו דגימות CD NA של כל קבוצת טיפול על ידי התחלה בריכוזים שווים של ה-RNA המופק והפעלת תגובת טרנסקריפטאז הפוכה על כל דגימה. לאחר מכן בצע PCR כמותי בזמן אמת על הדגימות כדי לחפש רמות של גנים נבחרים באמצעות הפריימרים והתנאים המפורטים בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לבסוף, חשב את איכות המדיום המותנה בעצם על סמך רמות ביטוי הגנים היחסיות על ידי נורמליזציה לרמות סף המחזור של הגנים לגן משק הבית Gabb dh בשיטת דלתא דלתא CT. להלן כמה תוצאות אופייניות המראות את השינויים בביטוי הגנים של פיברובלסטים דרך הפה שנחשפו למדיום מותנה בעצם במשך 24 שעות. שני גנים אדרנלין ופנט טרקס ושלושה היו מווסתים באופן משמעותי ל-40% מהרמות המקוריות, בעוד שאינטרלוקינים 11 ו-33, יחד עם N-A-D-P-H אוקסידאז 4 ו-prote glycan 4 היו כולם מווסתים פי 200.

מעניין לציין כי ממברנות מחסום קולגן המשמשות להגנה על שבבי העצם מהרקמה הרכה שמסביב סופגות הרבה מהמדיום המותנה בעצם שאחראי לשינויים בביטוי הגנים. ממברנות הקולגן, לעומת זאת, לא הצליחו לספוג את הגורמים השולטים בביטוי אינטרלוקין 33. לכן, ביטוי אינטרלוקין 33 אינו מוסדר בהגדרה זו.

ניתן להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן כדי לחקור את התגובה של סוגים שונים של תאים הכוללים התחדשות עצם. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול להכנת מדיום מצב מעצם תהליך וחומרי מילוי עצם אחרים. הרלוונטיות הקלינית של בדיקה ביולוגית זו נותרה לא ברורה.

התגובה התאית ל-BCM in vivo היא ככל הנראה מורכבת יותר וכוללת ספקטרום גדול של גנים ותאי מטרה שונים המרחיבים את אלה המוצגים כאן. עם זאת, הבדיקה הביולוגית שלנו מספקת תובנות ראשונות לגבי ההרכב המורכב לכאורה של מולקולות RAF בעצם והתגובה התאית במבחנה.