הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

טומוגרפיה מתווכת פלואורסצנציה היא טכניקת דימוג רגישה ביותר להערכה כמותית של התפלגות הפלואורסצנציה. בעכברים תחת הרדמה, קיימות גששים פלואורסצנטיים ממוקדים רבים, המאפשרים דימוג של אנגיוגנזה, אפופטוזיס, דלקת ותהליכים אחרים. בסרטון זה, נראה כיצד מבוצע דימוג היברידי באמצעות FMT ו-Micro CT במכון שלנו.

בפרק הראשון, המכשירים, זהו ה-F-M-T-F-M-T, שפירושו fluorescence molecular tomography (טומוגרפיה מולקולרית פלואורסצנטית). טומוגרפיה פירושה שנוצרים תמונות בתלת-ממד. ה-FMT רגיש מאוד להדמיה של פלואורסצנציה פנימית בעכברים.

כעת הפאנל הקדמי פתוח כדי לחשוף את פנים ה-FMT. בתחתית מותקן לייזר על גבי מפעיל 2D. הלייזר מקרין אור אל תוך העכבר, שמוחזק במיטת עכברים שקופה חלקית.

מעל מיטת העכבר נמצא מערך של נורות LED כמקור אור חלופי, המאפשר ל-FMT לפעול כמכשיר רגיל להדמיית השתקפות. גלגל המסננים מותקן מתחת לעדשה, אשר לוכדת את האור עבור הגלאי בחלק העליון של המכשיר. זהו ה-micro ct שלנו.

מכשיר ה-micro CT מצויד בשני צינורות רנטגן ושני גלאי פאנל שטוחים, המאפשרים ביצוע סריקות באנרגיה כפולה. פרק שני, פרוטוקול סריקת micro CT FMT. הן ה-FMT והן ה-micro CT מיועדים להדמיית עכברים; לפני ההדמיה, העכברים מושנים באמצעות isof fluorine.

עבור סריקת ה-FMT, יש להסיר את פרוות העכבר, פעולה שמתבצעת ביעילות באמצעות קרם herring. חלק מזני העכברים עלולים לפתח פריחות כתוצאה משימוש בקרם deha. לפיכך, מומלץ לעקוב אחר שינויים בעור העכברים וליצור קשר עם צוות הווטרינריה לקבלת טיפול במידת הצורך.

בנוסף, יש לבדוק תחילה את רמת הסבירות (tolerance) על קבוצה קטנה של כל זן חדש של עכברים. כדי למנוע היפותרמיה, העכבר מונח על פד חימום. להזרקת חומר ניגוד, מוחדר קטטר לווריד הזנב בשל גודלו הרב.

תהליך זה הוא קשה למדי ודורש ניסיון מסוים. אם דם זורם חזרה אל תוך הקטטר, פירוש הדבר הוא שהקטטר ממוקם כראוי. ניתן להזריק חומרי ניגוד פלורסצנטיים וחומרי ניגוד ל-CT כדי למנוע עומס נפחי.

יש להזריק לכל היותר 5 mL לכל קילוגרם ממשקל הגוף, כלומר 150 µL עבור עכבר במשקל 30 g. לצורך הסריקה, העכבר מונח בתוך מיטת עכברים רב-מודאלית.

ייתכן שעל זנב העכבר שורטטו סימנים לצורך זיהוי. חשוב להימנע מסימונים own כאלה על הגוף, שכן הם עלולים להשפיע על הסריקה האופטית. מיטת העכבר סגורה והעומק הותאם כדי להחזיק את העכבר במיקום קבוע ובצורה הדוקה.

היו זהירים ועקבו אחר הנשימה, שכן הידוק מוגז של המיטה עלול לחנוק את העכבר. עכברי נוד (Nude mice) משמשים בדרך כלל למחקרים אונקולוגיים בשל הדיכוי החסוני שלהם. העובדה שהם חסרי פרווה היא תופעת לוואי מזל של המוטציה הגנטית.

לכן, ניתן לוותר על הליך הסרת הפרווה הממושך. יש לוודא שהעכבר נושם כראוי, ובמידת הצורך, יש להתאים את תושבת העכבר בהתאם. לאחר מכן, מניחים את תושבת העכבר בתוך ה-micro ct.

הצינורות המעבירים את גז הפלואור של ה-ISO מופעלים כדי לשמור על זרימת הגז בתוך המכשיר. לאחר מכן, ה-micro C נסגר כדי לאפשר את מיגון קרני ה-X. ה-micro C יתחיל בסריקה רק כאשר המכסה סגור.

באמצעות הכפתורים ב-micro CT, ניתן להניע את העכבר אל תוך המכשיר. במחשב הבקרה של ה-micro CT, משיגים תמונת topo gram שמוצגת על המסך, ומסדרים את הגדרות החלון (windowing settings) כדי לראות את העכבר בצורה טובה יותר. ניתן לקבוע סריקת ZUP אחת או יותר. מיקומן מסומן על ידי האזורים בצבע תכלת.

בדרך כלל סריקות ZUP אחת עד שלוש מספיקות. לאחר תחילת הסריקה, ההתקדמות מוצגת באמצעות פסי התקדמות בצבע כחול כהה. מיקרו CT עם פאנל שטוח סורק סריקות ZUP באופן עקיבי, דבר השונה מ-CT ספירלי קליני.

באמצעות הכפתורים, מיטת העכבר מוזזת קדימה. שוב, מכסה המגן נפתח וצינורות ההרדמה מוחלפים. המחזיק מוסר בזהירות ממיטת העכבר וצינור ההרדמה נמשך החוצה.

דבר זה נחוץ מכיוון שה-AN וה-FMT אינם תלויים בצינור הקטן הזה. במקום זאת, התא הקטן בתוך ה-FMT מוצף בגז אלחוש. כעת מביאים את מיטת העכבר עם העכבר אל ה-FMT ומכניסים אותה למחשב הבקרה של ה-FMT.

שדה הראייה של הסריקה מותאם, וכך גם צפיפות הדגימה. בדרך כלל נעשה שימוש בכ-120 נקודות. הסריקה מתחילה לאחר לחיצה על כפתור.

במעבר הראשון של ה-FMT נרכשת תמונת תאורה חודרת (trans illumination) או תמונת עירור עבור כל נקודת מקור לייזר. בסרטון זה, הפעולה מוצגת במצב הקפנה מהירה. בדרך כלל הפעולה אורכת כחמש דקות.

ניתן לראות כי הרבה פחות אור עובר דרך פלג הגוף העליון בהשוואה לפלג הגוף התחתון. זאת מכיוון שאיברים בעלי נפח דם יחסי גבוה יותר, כגון הלב, הכבד והכליות, מרוכזים יותר בפלג הגוף העליון. דם הוא הבולע העיקרי של אור בתחום האינפרא-אדום הקרוב.

בסבב השני מריצים את אותן נקודות המקור עם מסנן שונה, המאפשר רק לאור פלואורסצנטי לעבור פרק שלוש, שמן אינטראקטיבי וסגמנטציה. כדי למזג את הנתונים משני המכשירים, נעשה שימוש בסמנים המובנים במיטת העכבר.

הסמנים נראים גם בתמונת השתקפות שהתקבלה באמצעות ה-FMT. הסמנים הם למעשה חורים פשוטים ואינם דורשים מילוי בחומר פלואורסצנטי או בחומר ניגוד ל-CT. במכון שלנו, פיתחנו תוכנה המבצעת את זיהוי הסמנים והמיזוג באופן אוטומטי.

צורת העכבר, כמו כן מפות בלידה ופיזור הטרוגניות, מוערכות באופן אוטומטי באמצעות נתוני ה-micro CT כפי שמתואר בפרסום האחרון שלנו ב-Theranostics. פרמטרים אלו חשובים לשחזור פלואורסצנציה כמותי. כדי למדוד את ההתפלגות הביולוגית של הפלואורסצנציה, נדרשת סגמנטציה של איברים.

אנו יוצרים סגמנטציה כזו באופן אינטראקטיבי באמצעות תוכנה בשם imulitic preclinical שפותחה במכון שלנו, כפי שמוצג בהמשך. סגמנטציה כזו מוצגת בהמהירות מואצת, ואדם מנוסה יכול לבצע אותה בערך ב-10 עד 20 דקות. ראשית, טוענים את מערך נתוני ה-CT.

ניתן לבחון זאת בתלת-ממד באמצעות רינדור של פני שווי-ערך (ISO surface). על ידי שינוי הגדרות החלון, ניתן לשנות את ערך ה-ISO. לדוגמה, כדי להציג את העצמות של גוף העכבר כולו יחד עם מיטת העכבר, טוען את השכבה העליונה (overlay).

האות בדוגמה זו מופיע בשלפוחית השתן. כעת השכבה העליונה של ההדמיה כבויה, כדי להתמקד בסגמנטציה האנטומית.

בסריקות microt של דגימות טבעיות, ניתן לאתר את הריאה בקלות בשל הניגוד השלילי החזק לרקמות הרכות האחרות. המבנה הגדול בתוך הריאה הוא הלב. נבצע תחילה סגמנטציה של הריאה.

כל הווקסלים שמתחת לערך מסוים מופרדים באמצעות סף (thresholding). אלו מופיעים בצבע ירוק. הריאה היא אזור מחובר, שניתן להפרידו באמצעות פעולת מילוי.

בדומה לכלי דלי הצבע. בתוכנת ציור, ניתן להפריד את הפח מהריאה באמצעות גזירה ומילוי. ניתן לבצע סגמנטציה של איברים קעורים, כגון שלפוחית השתן, על ידי שרטוט קווים חופשיים (scribbles) כדי להגדיר את גבולות האיבר.

יש להוסיף שרטוטים נוספים עד להשגת דיוק מספק. ניתן לבצע סגמנטציה של איברים שאינם קמורים, כגון המעי, חלק אחר חלק. הכבד מופיע כאזור הומוגני ובעל מבנה מורכב יותר.

מכיוון שזה מורכב ממספר אונות, ניתן לשמור את הסגמנטציה לדיסק ולהטעינה לתוכנה. באמצעות סגמנטציה כזו, ניתן לשייך את האות הפלואורסצנטי לאיברים. התוכנה מחשבת כמויות אלו ושומרת אותן כגיליון נוסף; עבור סריקות לונגיטודיות, יש לבצע את הסגמנטציה מחדש עבור כל נקודת זמן, מכיוון שהמרווחים בדרך כלל ארוכים מדי כדי להשאיר את העכבר תחת הרדמה בעמדה קבועה.

לפיכך, הסגמנטציה היא משימה סיזיפית כאשר מעורבים עכברים רבים ונקודות זמן רבות. כדי לכמת את התוצאות, טענו שכבה עליונה (overlay) וסגמנטציה. לחצו על set Batch settings כדי שהתוכנה תזכור את ההגדרות הנוכחיות.

כעת, לחצו על batch statistics כדי להורות לתוכנה לחשב את הערכים עבור כל האזורים בכל סריקות ה-micro CT FMT. פעולה זו תימשך מספר שניות. לאחר מכן, הסטטיסטיקות יישמרו בקובץ גיליון אלקטרוני אחד.

דבר זה נוח כיוון שהמשתמש אינו נדרש למזג עשרות קבצים בעצמו. על בסיס קובץ זה, ניתן לחשב את עקומות האיברים. פרק ארבע, תוצאות מייצגות.

כדי לבחון שהמיזוג פועל כראוי, השתמשנו בפנטום aros. הוספנו מעט אבקת titanium exide לצורך פיזור. כדי ליצור צורה לא סדירה, הסרנו חלקים מסוימים.

מספר הכלות קטנות מלאות בחומר ניגוד לפלואורסצנציה ול-CT נבנו בתוך הפנטום. מכיוון שה-FMT אינו מכיר את הצורה האמיתית של האובייקט ומניח צורה מפושטת, השחזור אינו מדויק עבור אובייקטים בעלי צורות לא סדירות. לפיכך, יישמנו שחזור נוסף המשתמש בצורה הנגזרת מנתוני ה-micro city.

כפי שניתן לראות, לוקליזציית האות בפנטום טובה בהרבה. כדי לבחון את הנתונים in vivo, נעבור על נקודות הזמן של הדימות. זהו הסריקה המוקדמת (pre-scan).

כל מה שאנו רואים כעת הוא למעשה רק רעש וארטיפקטים. אם נעבור לנקודת הזמן הבאה, זו שלאחר ההזרקה, נראה אות חזק הרבה יותר, אך הגדרות החלון (windowing) קשיחות מדי. באמצעות דיאלוג הגדרות החלון, ניתן להתאים את הגדרות החלון.

אנו רואים את מרבית האות בשלפוחית השתן. אם נעבור לנקודת הזמן הבאה, 0.2 שעות לאחר ההזרקה, נראה אות מחוץ לעכבר. זאת מכיוון שהעכבר השתיב את הפלואורסצנציה על מצע העכבר.

על ידי התאמה נוספת של החלון (windowing), ניתן לראות אות מסוים בעמוד השדרה ובברכיים. כעת נעבור לנקודת זמן של 0.4 שעות לאחר ההזרקה; האות משקיים נעלם כעת, ואנו רואים פלואורסצנציה בעמוד השדרה ובברכיים בנקודות הזמן הבאות, שש שעות ו-24 שעות לאחר ההזרקה. אנו רואים את אותה התוצאה.

כעת נעבור לאף הבא. הסריקה המקדימה אינה מראה דבר תחת הגדרות חלון אלו. הסריקה שבוצעה 15 דקות לאחר ההזרקה מראה אות חזק מהשלפוחית וכן הלאה.

במחקר זה, מצאנו ריכוזים גבוהים בשלפוחית השתן זמן קצר לאחר ההזרקה, כתוצאה מההפרשה הכלית המהירה של גשושית זו. יתרה מכך, האות בעמוד השדרה עולה במהירות ונשאר יציב יחסית לאורך נקודות הזמן המאוחרות יותר של הדמיה. פרק חמישה, סיכום.

לסיכום, הצגנו פרוטוקול דימות רב-מודאלי המשלב את היתרונות של פלואורסצנציה, טומוגרפיה מולקולרית ומיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת. נתוני ה-micro CT האנטומיים מאפשרים שחזור פלואורסצנציה משופר באמצעות שימוש במבנה הגוף של העכבר. יתרה מכך, נתונים אלו מועילים ליצירת סגמנטציה של איברים, הנחוצה להפקת מדידות כמותיות מנתוני הדימות.