Name: שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד שיטה לוויזואליזציה של פעילות אנזימי deubiquitinating בתאים תרביתיים באמצעות חיישנים מבוססי hemagglutinin. הטכניקה מאפשרת זיהוי מרובה של פעילויות אנזימים ומסייעת באיתור מטרות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות למעבדה שלי באוניברסיטת מינסוטה למתן דגימות רקמת חוט השדרה העכבר שהיו בשימוש. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לתכנית ביטחון סרטן השחלות מחקר (OCRP) OC093424 לMB, על ידי חקר הסרטן וקהילה קרן רנדי מכונת גילוח לMB ועל ידי השחלות ברית סרטן מינסוטה (MOCA) לMB. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. תמוגה הצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר סוכרוז במים ללא יונים (DI) כדי להפוך את פתרון מניות 2 M. סנן פתרון 2 M של סוכרוז באמצעות ואקום מונע 0.22 מיקרומטר פלואוריד polyvinylidene מסנן (PVDF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dithiothreitol (DTT) במי DI לעשות פתרון 500 מ&quot;מ מניות וחנות בתנאים אנאירוביים. לפזר מגנזיום כלוריד (MgCl 2) במי DI לעשות פתרון מניות 100 מ&quot;מ. לפזר אדנוזין טריפוספט disodium מימה (ATP) במי DI לעשות פתרון מניות 50 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור פתרון טריס בpH 7.4 ידי המסת hydrochloride Trizma במי DI והתאמת pH באמצעות נתרן הידרוקסידי (NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב חלקים מפתרונות המניות במים די כדי להפוך את מאגר תמוגה עם ריכוז סוכרוז של 250 מ&quot;מ, ריכוז DTT של 1 מ&quot;מ, MgCl 2 ריכוז של 5 מ&quot;מ, ריכוז ה- ATP של 1 מ&quot;מ וריכוז טריס של 50 מ&quot;מ . לדוגמא, לערבב 535.3 μl של טריס, 500 μl של MgCl 2, 1.25 מיליליטר של סוכרוז, 20 μl של DTT, 200 μl של ה- ATP ו7.4947 מיליליטר של מים די כדי להפוך את 10 מיליליטר של חיץ תמוגה. זה יכול לשמש לכ -20 ניסויים. </li></ol> 2. תאים culturing לניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את התקשורת על ידי aliquoting 30 מיליליטר של DMEM + 10% בסרום שור עוברי (FBS) לצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי M17 או הלה קפוא מאחסון חנקן נוזלי לכוס קטנה עם מים פושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור חרוטי 50 מיליליטר. ראשית, להוסיף קצת תקשורת לבקבוקון התא. לאחר מכן להעביר את תאי resuspended בתוך 5 שניות של הפשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 450 XG במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. הוסף 20 מיליליטר של תקשורת לתוך בקבוק T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהתאים באמצעות יניקה. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת טריות לתא גלולה וגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא 5 מיליליטר ל -20 מיליליטר של תקשורת בבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. ChAnge התקשורת בכל 3 ימים. </li></ol> קציר 3. סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה באמצעות יניקה, נזהר שלא לגעת בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS). הסר PBS באמצעות יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 מיליליטר של חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מיליליטר של תקשורת טריות לבקבוק וresuspend התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 290 × גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS. לטפוח בעדינות את החלק התחתון של הצינור כדי לשבור את גלולה. צנטריפוגה ב 290 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS וresuspend התאים 1 מיליליטר של PBS הטרי. העברה לצינור Eppendorf (1.5 מיליליטר). ספין ב290 XG במשך 5 דקות. </li></ol> 4. תא תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח המשוער של גלולה באמצעות פיפטהd לשקול את חרוזי זכוכית במסה: יחס נפח של 1: 1. להוסיף פעמיים הנפח של גלולה במאגר תמוגה. הערה: להוסיף למאגר לפני הוספת חרוזי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים בצינור Eppendorf בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 ° C על ידי vortexing בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזים. לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית כמו קודם לsupernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת שוב בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 5,030 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים. לאסוף את supernatant, המהווה את lysate התא. </li></ol> Homogenization 5. רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך המוני: נפח של 1: 9 פתרון של רקמת חוט השדרה עכבר למאגר תמוגה. הערה: שיטה זו ישימה למגוון שונהדגימות רקמה אף אוזן גרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמות באמצעות הגדרה של רמה 2 על homogenizer למשך 30 שניות כדי לוודא שאין גושים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב5,030 XG במשך 3 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant, המהווה את lysate. </li></ol> Derivatization 6. לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חומצת bicinchoninic (BCA) בניתוח צלחת 96-היטב כדי לקבוע את ריכוז החלבון של lysate הרקמות באמצעות קורא צלחת 96-היטב colorimetric כמפורט בפרוטוקול ערכת assay חלבון BCA פירס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא aliquot המתאים עד 20 מיקרוגרם של חלבון הכולל 50 μl באמצעות מים מיוננים דה (DI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 1.35 מיקרומטר של sulfone HA-UB-ויניל (VS) לפתרון דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. התוצאה 20 מיקרוגרם של lysate 50 ננומטר של בדיקה בתערובת התגובה הסופית. זה בעודף טוחנת גדול כדי להבטיח תיוג של ממכן פונקציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניncubate המדגם במאגר המדגם של Laemmli במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס. לתגובת שימוש נפח 52 μl 26 μl של חיץ מדגם 2x, 13 μl של חיץ מדגם 4x או 8.87 μl של חיץ מדגם 6x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב על קרח לפני טעינת ג&#39;ל. </li></ol> 7. מערבי כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון 4-20% ג&#39;ל טריס-גליצין 12 גם עם 40 μl של המדגם מוכן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 95 V עד חזית היון מגיעה לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע העברת לילה של הג&#39;ל על קרום difluoride polyvinylidene (PVDF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום בכתם השחור amido ולסרוק membane לקבל תמונה המציגה את כמות החלבון בכל מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain קרום דגירה ב 5% בחלב PBS עבור שעה 1 לחסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום בנוגדן אנטי HA העיקרי בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS או לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך 4 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף Fאו 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום בperoxidase חזרת עכבר בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS לפחות 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף במשך 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה 1 למשך 5 דקות בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקרום במגיב איתור chemiluminescent במשך 10 דקות ולזהות באמצעות גלאי chemiluminescent. השתמש בחשיפה האוטומטית הגדרה בגלאי. </li></ol>

<ol><li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-+based+ubiquitin-specific+%28USP%29+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li>
<li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+deubiquitination%3A+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li>
<li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li>
<li>Rolén, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li>
<li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li>
<li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Parkinson%E2%80%99s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li>
<li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Amyloid+%28A%CE%B2%29+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li>
<li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li>
<li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li>
<li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li>
<li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+%CE%B1-Synucleinopathy+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאז ubiquitination היא פעילות סלולרית בסיסית, הבנת מנגנוני הרגולציה יכולה להיות המפתח לחושף את תהליכי המחלה ופתולוגיה. השימוש בHA מתויג בדיקות אתר מכוונות פעילים נגזרות UB דיווחו כאן מספקת שיטה קלה, אבל זה אפשרי מאוד ללימוד פירוק חלבונים בתיווך UB. שיטה זו היא מהירה יותר וזול יותר מאשר לימוד כל אחד מממכן בנפרד. בשיטה זו, תמוגה של התאים מושגת באמצעים מכאניים - באמצעות חרוזי הזכוכית. שיטה עדינה זה של תמוגה שומרת תמ...

מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) משמשת כאחד ממסלולי השפלה המרכזיים בתא היונקים. מצעים מחויבים לפירוק בפרוטאזום מתויגים קוולנטית עם פולימרים של היוביקוויטין (UB) 1. לפני המצע הממוקד נכנס לפרוטאזום לשפלה, יש להסיר את תג פולי-יוביקוויטין. כיתה של אנזימים המכונים deubiquitinating אנזימים (dubs) אחראית לפינוי והמיחזור של מולקולות יוביקוויטין 2. זה כבר חזה מהגנום האנושי שיש כמעט מאה ממכן עובד בתא 3. עם מספר כה גדול של ממכן שליטה תהליכים תאיים בתיווך UB, לומד אנזימים אלה מציב אתגר מאז טכניקות mRNA לא נותנים מידע על פעילות ומערבית סופג רק נותן מידע על רמות ביטוי. השימוש בhemagglutinin השפעת (HA) מתויג, UB-נגזר בדיקות אתר מכוונות פעילים מאפשר לmod קוולנטייםification של ממכן הפונקציונלי ולכן נותן להדמיה ישירה של הפעילות של אנזימים אלה על כתם מערבי 4. יש בדיקות קבוצה תגובתי תיאול C-מסוף המשמשת כמצע להתאבדות שאריות ציסטאין אתר הפעיל 5. עם בדיקות אלה, ניתן ללמוד את הפעילות וביטוי פוטנציאל של ממכן רבים תחת שני מצבים פתולוגיים ופיסיולוגיים של התא. שינויים בפעילות DUB היו מעורבים במגוון של מצבים פתולוגיים כגון פרקינסון, אלצהיימר, אנמיה וסוגי סרטן שונים 6-10. טכניקה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר המחלה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים את היישום של טכניקה זו בתאי הלה וM17 שכבר lysed באמצעות חרוזים זכוכית. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בשיטה זו בדגימות רקמת חוט השדרה עכבר. המידע שהתקבל מטכניקה זו יכול לשמש כנקודת פתיחה לזיהוימטרות טיפוליות, כמו גם דגמי ההקמה לחקר תנאי מחלה שונים. השירות האמיתי של טכניקה זו הוא ביכולתה לספק מידע על ממכן מרובה בassay אחד.

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125 (הומוגנייזר)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>מסננים מונעי ואקום 0.22 ומיקרו; m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה ו-le; 106 ומיקרו; m (~140 מסננת ארה"ב)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL-דיתיותרייטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>טריזמה הידרוכלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td> של Dulbecco <td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית רקמות 75 ס"מ2 עם פילטר 250 מ"ל 120/cs</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד HA המיוצר בעכבר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>יוביקוויטין ויניל סולפון (HA-tag)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימת SDS של Laemמלי (פי 4, מפחית)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>פירס BCA חלבון ערכת בדיקה</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

לאחרונה מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום הייתה מעורבת בפתולוגיות שונות כולל מחלות ניווניות וסרטן. לאור זאת, טכניקות ללימוד מנגנון הרגולציה של מערכת זו הן חיוניות להבהרת התהליכים התאיים ומולקולריים של המחלות הנ&quot;ל. השימוש בבדיקות היוביקוויטין hemagglutinin נגזר המתוארות במאמר זה משמש ככלי רב ערך למחקר של מערכת זו. מאמר זה מפרט שיטה המאפשרת למשתמש לבצע מבחני שנותנים להדמיה ישירה של deubiquitinating פעילות אנזים. אנזימי Deubiquitinating לשלוט השפלה proteasomal ולשתף הומולוגיה פונקציונלית באתרים הפעילים שלהם, המאפשר למשתמש לחקור את הפעילות של אנזימים רבים בassay אחד. מתקבל lysates דרך הפרעה תא מכאנית עדינה וטופחו עם בדיקות מכוונות אתר פעיל. אנזימים פונקציונליים מתויגים עם הבדיקות תוך אנזימים פעילים יישארו מאוגד. על ידי הפעלהנינג assay זה, המשתמש מקבל את המידע משני הפעילות וביטוי פוטנציאל של אנזימי deubiquitinating מרובים באופן מהיר וקל. השיטה הנוכחית היא באופן משמעותי יעילה יותר באמצעות נוגדני פרט למאה האנזימים deubiquitinating חזו בתא האנושי.

תאי M17 והלה תרבותיים נקצרו בשיטה מפורטת ב( קציר Cell 3.) פרוטוקול ורקמת חוט השדרה עכבר הושגה. תא גלולה / רקמת חוט השדרה הוצבה בצינור עם חיץ תמוגה המתואר בסעיף הכנת מגיב. כדורי תא היו lysed באמצעות חרוזים זכוכית (איור 1 א) ודגימות רקמת חוט השדרה עכבר היו הומוגני באמצעות homogenizer (איור 1). לאחר תמוגה או הומוגניות, המדגם centrifuged אז ב5,030 XG להסיר את חרוזי זכוכית ו / או קרומים רצופים ואברונים (איור 2). שתי שיטות אלה הם אמצעים...

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמיות של פעילותם של אנזימים שעברו דה-יוביקוויטינציה בתאים. מטרה זו מושגת על ידי גידול תאים לצפיפות גבוהה וקצירתם כדי לאפשר הפקה של ליזאט מרוכז כשלב שני. נעשה שימוש בליזיס מכנית עדינה כדי להפיק ליזאט השומר על התמונה המטבולית של ציטופלזמת התא.בשלב הבא, מדגרירים את האנזימים עם גששים המופקים מהמאגלוטינין כדי לסמן את אנזימי ה-deubiquitin באמצעות תגובה עם שארית הציסטאין באתר הפעיל; התוצאות מראות את פרופילי הפעילות של אנזימי deubiquitin רבים על בסיס Western blotting וגילוי כימילומנסיטי עוקב. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו Western blotting רגיל הוא שהיא מאפשרת למשתמש להדמיא את הפעילות של אנזימים מרובים. בניסוי אחד, הכינו מצע לתרבית תאים על ידי מזיגת 30 milliliters של DMEM (modified eagles medium) בתוספת 10% fetal bovine serum לתוך מבחנה קונית של 50 milliliters לצורך תרבית.עבור התאים לניסוי, העבירו תאי M 17 או תאי he קפואים מאחסון בחנקן נוזלי לכלי זכוכית קטן עם מים פושרים. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנה קונית של 50 milliliter המכילה 30 milliliters של מצע גידול. בשלב הבא, הוסיפו מעט מצע גידול למבחנה של התאים והעבירו את התאים לאחר השהיה (resuspension) בתוך חמש שניות מההפשרה.סבב את תרחיף התאים בצנטריפוגה ב-450 Gs למשך חמש דקות כדי לקבל משקע של תאים. לאחר מכן, הוסף 20 milliliters של מצע לתוך בקבוק T 75. הסר את המצע מהתאים באמצעות שאיבה.הוסף 5 mL של מצע טרי למשקע התאים וערבב עד להומוגניזציה. העבר את 5 mL של תגלי התאים ל-20 mL של מצע בבקבוק T 75 והדגר ב-37 °C. החלף את המצע מדי שלושה ימים עד לקציר התאים.הסיר את המצע באמצעות שאיבה, תוך הקפדה שלא לגעת בתאים. שטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של phosphate buffered saline או PBS. הסר את ה-PBS באמצעות שאיבה.בשלב הבא, הוסיפו שלושה מיליליטרים של tripsin EDTA לבקבוק ה-T 75 והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש דקות. לאחר ההדגרה, הוסיפו לבקבוק שישה מיליליטרים של מצע טרי ובצעו רספנסיה (resuspend) לתאים.העבר את התו сусפנזיה למבחנה קונית של 15 מיליליטר וסבב בצנטריפוגה ב-290 Gs למשך חמש דקות, הסר את הנוזל העליון והוסף חמישה מיליליטר של PBS. הקיש בעדינות על תחתית המבחנה כדי לפרק את המשקע לפני סבב בצנטריפוגה ב-290 Gs למשך חמש דקות. לאחר חזרה על שטיפת ה-PBS שלוש פעמים, הסר את ה-PBS הישן וסספנד מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS טרי.לאחר מכן, העבירו את התאים לתוך מבחנת Eppendorf וסובבו ב-290 g למשך חמש דקות. כדי לבצע ליזיס של התאים, מדדו את הנפח המשוער של המשקע באמצעות פיפטה ושקלו חרוזי זכוכית ביחס מסה לנפח של אחד לאחד. הוסיפו למשקע תמיסת ליזיס בכמות שדומה לפי שניים מנפח המשקע.לאחר מכן, הוסיפו את חרוזי הזכוכית אל המשקע ואת בופר הליזיס (lysis buffer). בצעו ליזיס לתאים בתוך מבחנת ה-Eppendorf בעוצמת ערבוב מקסימלית למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C באמצעות וורטקס בחדר קר. סבבו בצנטריפוגה לזמן קצר ב-200 g למשך 30 שניות.כדי לשקע את החרוצים ולאסוף את הנוזל העליון. הוסף לנזל העליון את אותו נפח של חרוצי זכוכית כפי שנעשה קודם לכן, ערבב שוב ב-vortex בעוצמה מרבית למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן סבב קצר בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך 30 שניות. כדי לשקע את חרוצי הזכוכית, אסוף את הנוזל העליון.לבסוף, סבבו בצנטריפוגה ב-5,030 GS למשך חמש דקות. כדי להסיר את הגרעינים, הממברנות והתאים שלא התבקעו, אספו את העלייה (supernatant), המהווה את ליזט התאים עבור דריבטיזציה של רקמה, המבוצעת באמצעות חומצה סינימית, או לצורך אנליזת BCA. העבירו לפלטת 96 בארות כדי לקבוע את ריכוז החלבון של הליזט באמצעות קורא פלטות קולורימטרי של 96 בארות, כפי שמוגדר בפרוטוקול של ערכת בדיקת חלבון BCA.לאחר קביעת ריכוז החלבון, השלם אליקוט המקביל ל-20 micrograms של חלבון כולל ל-50 microliters באמצעות מים דאיוניים. לאחר מכן, הוסף לתמיסה שני microliters של 1.35 micromolar של HAUB vinyl cell phone. התוצאה היא 20 micrograms של ליזט ל-50 nano molar של גשש בתערובת התגובה הסופית.כמות זו היא בעודף מולרי גדול. כדי להבטיח תיוג של אנזימי דה-יוביקוויטינציה (dubs) פעילים, יש להשאיר את התמיסה לדגירה למשך שעה אחת ב-37 °C. לאחר מכן, יש להוסיף לתמיסה באפר דגימה מסוג Laemmli.עבור נפח תגובה של 52 µL השתמש ב-26 µL של תמיסת דגימה בריכוז 2x, ב-13 µL של תמיסת דגימה בריכוז 4x, או ב-8.87 µL של תמיסת דגימה בריכוז 6x. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות ב-95 °C. קררו על קרח.לפני העמסת הג'ל לביצוע ה-western blot, העמס ראשית במגש של 12 בארות בג'ל tris glycine בריכוז של 4% עד 20% כמות של 40 µL מהדגימה שהוכנה. הרץ את הג'ל במתח של 95 V עד שהחזית היונית תגיע לתחתית. לאחר מכן, בצע העברה של הג'ל למשך לילה לממברנת polyvinylidene fluoride או PVDF בהתאם להנחיות.ראשית, הדגרו את הממברנה בצבע השחור AMDO וסרקו אותה כדי לקבל תמונה המציגה את כמות החלבון בכל נתיב. לאחר מכן, נקו את הממברנה והדגרו אותה ב-5% milk ב-PBS למשך שעה אחת לצורך חסימה. בשלב הבא, הדגרו את הממברנה בנוגדן ראשוני anti HA בריכוז של 1:10,000 ב-5% milk ב-PBS, למשך לילה ב-4 °C או למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, בצעו שלושה שלבי שטיפה של חמש דקות כל אחד ב-PBS עם 0.1% חומר דטרגנט tween 20. לאחר מכן, הדגירו את הממברנה ב-mouse horseradish peroxidase בריכוז של 1:10,000 ב-5% חלב ב-PBS למשך שעתיים לפחות. בצעו שלושה שלבי שטיפה כפי שנעשה קודם לכן, ואחריהם שלב שטיפה אחד למשך חמש דקות ב-PBS.לבסוף, הדגרירו את הממברנה בתמיסת גילוי כימולומינסנטית למשך 10 דקות ובצעו גילוי באמצעות גלאי לומינסנציה. השתמשו בהגדרת חשיפה אוטומטית בגלאי. בדיקת עומס החלבון בוצעה באמצעות צבע AM mito black.שלב בקרה זה מבטיח כי ההבדלים בפעילות נובעים מתהליכים תאיים ממשיים ולא מטעינה לא שווה של חלבון. הנתיבים המוצגים כאן מצביעים על כך שנעשה שימוש בכמויות חלבון שוות בניסוי הראשון. בניסוי השני, הוטענו כמויות חלבון לא שוות בשל ההבדלים הצפויים בפרופילי הפעילות של קווי התאים השונים.פעולה זו בוצעה כדי להבטיח זיהוי של פרופיל פעילות עבור תא M 17. ליזאטים שהודגרו עם ethyl maide, שהוא מעכב ציסטין ואמור להוביל לאות מופחת ב-Western blot. הממברנות הודגרו עם נוגדן ראשוני anti HA.נוגדן עכבר נגד פרוקסידאז חזרית (horse radish peroxidase), ולאחר מכן זיהוי באמצעות דימוי כימילומנסנטי. תיוג מוצלח של ה-dubs באמצעות הגששים מביא לפרופיל בכל נתיב בממברנה. עוצמת הפסים במשקלים מולקולריים שונים תואמת את רמת הפעילות של אנזים ה-dub.ההבדלים ברמות הפעילות של dubs שונים בין קווי תאים הופכים גלויים כאשר משווים חלבונים דומים, כגון U CHL one, בתאי he a ו-M 17. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הפרדה תת-תאית (subcellular fractionation), כדי לענות על שאלות כגון: כיצד תהליכים פתולוגיים משפיעים על פעילות אנזים העוביקוויטין באברונים הקשורי ממברנה?לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי אופן מדידת הפעילות של אנזים דה-יוביקוויטינציה באמצעות גששים המכוונים לאתר הפעיל.

method-for-measuring-activity-deubiquitinating-enzymes-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים...

זיהוי של חלבון Ubiquitination

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

פרוטוקול זה מסביר כיצד למדוד את ההשפעה של שונות גנטית הקשורה להפרעות נוירו-התפתחותיות על פעילות האנזים דאוביקוויטילציה על ידי שילוב טיהור חלבונים רקומביננטיים עם מבחני מחשוף שרשרת יוביקוויטין.

מדידת הפעילות האנזימטית של אנזימים דאוביקוויטילציה הקשורים להפרעה נוירו-התפתחותית באמצעות בדיקת מחשוף שרשרת יוביקוויטין במבחנה

הניסוי המשמש כאן מציג שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב טכנולוגיות בדיקה כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות של הרפואה הסינית המסורתית לבין מטרות חלבון.

סינון תרכובות ברפואה הסינית המסורתית לעיכוב פעילות UCHL3 על בסיס עגינה מולקולרית וטכנולוגיית בדיקת אנזים דה-ביקוויטינציה

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

למד שיטה לוויזואליזציה של פעילות אנזימי deubiquitinating בתאים תרביתיים באמצעות חיישנים מבוססי hemagglutinin. הטכניקה מאפשרת זיהוי מרובה של פעילויות אנזימים ומסייעת באיתור מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

גלה סרטונים נוספים