שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין את פעילותם של אנזימים דה-אוביקוויטיניים בתאים. זה מושג על ידי תרבית תאים לשטף גבוה וקצירתם כדי להקל על ייצור ליזט מרוכז כשלב שני. ליזה מכנית עדינה משמשת לייצור ליזאט השומר על תמונה מטבולית של הציטופלזמה של התא.

לאחר מכן, האנזימים מודגרים עם בדיקות שמקורן בהמגלוטינין על מנת לתייג את אנזימי דה יוביקוויטין על ידי תגובה עם שאריות ציסטאין באתר הפעיל, התוצאות מראות את פרופילי הפעילות של אנזימי דה יוביקוויטין רבים המבוססים על כתמים מערביים וזיהוי כימילומינסנט לאחר מכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כתמים מערביים רגילים, הוא שהיא מאפשרת למשתמש לדמיין את פעילותם של אנזימים מרובים. בניסוי אחד, הכינו אמצעי תרבית תאים על ידי עלי, ציטוט של 30 מיליליטר של דובה דוקוס, מדיום נשרים שונה, או DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר לתרבית.

התאים לניסוי מעבירים תאי M 17 או He A קפואים מאחסון חנקן נוזלי לכוס קטנה עם מים פושרים. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר מדיה. לאחר מכן, הוסף מעט מדיה לבקבוקון התא והעביר את התאים התלויים תוך חמש שניות מרגע ההפשרה.

צנטריפוגה את תרחיף התא ב-450 Gs למשך חמש דקות לקבלת כדור תא. לאחר מכן הוסף 20 מיליליטר מדיה לבקבוק T 75. הסר את המדיה מהתאים באמצעות יניקה.

הוסף חמישה מיליליטר של מדיה טרייה לכדור התא והשהה. העבירו את חמשת מיליליטר תרחיף התאים ל-20 מיליליטר של מדיה בבקבוק T 75 ודגרו 37 מעלות צלזיוס. החלפת המדיה כל שלושה ימים כדי לקצור את התאים.

הסר את המדיה באמצעות יניקה, היזהר לא לגעת בתאים. שטפו את התאים עם חמישה מיליליטר של מי מלח פוספט או PBS. הסר PBS באמצעות יניקה.

לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA לבקבוק T 75 ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, הוסף שישה מיליליטר של מדיה טרייה לבקבוק ולהחייאה. השעו את התאים.

העבירו את המתלה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-290 גרם למשך חמש דקות, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו חמישה מיליליטר PBS. הקש בעדינות על תחתית הצינור כדי לפרק את הכדור לפני צנטריפוזיה ב-290 גרם למשך חמש דקות. לאחר חזרה על שטיפת ה- PBS שלוש פעמים, הסר את ה- PBS הישן והשהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS טרי.

לאחר מכן מעבירים את התאים לצינור איינור ומסתובבים ב-290 GS למשך חמש דקות. כדי לבצע ליזה של תאים, יש למדוד את הנפח המשוער של הגלולה באמצעות פיפטה ולשקול חרוזי זכוכית ויחס מסה לנפח של אחד לאחד. הוסף מאגר ליזה לגלולה בנפח כפול מהגלולה.

לאחר מכן הוסף את חרוזי הזכוכית לגלולה וליזיס. חצץ את התאים בצינור האיינור בערבול מקסימלי למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס על ידי מערבולת בחדר קר. צנטריפוגה קצרה ב-200 GS למשך 30 שניות.

ליישב את החרוזים ולאסוף את הסופרנטנט. הוסף את אותו נפח של חרוזי זכוכית כמו קודם למערבולת העל, שוב בתסיסה מקסימלית למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוזיה קצרה ב-200 Gs למשך 30 שניות. כדי ליישב את חרוזי הזכוכית, אספו את הסופרנטנט.

לבסוף צנטריפוגה ב-5, 030 GS למשך חמש דקות. כדי להסיר את הגרעינים, הממברנות והתאים הבלתי שבורים, אספו את הסופרנטנט, שהוא ליזאט התא לגזירת רקמות, המבוצע על ידי חומצה נימית של סינקו, או ניתוח BCA. בצלחת 96 באר לקביעת ריכוז החלבון של הליזאט באמצעות קורא צלחות באר מטרי של צ'ול 96 כמפורט בפרוטוקול ערכת בדיקת החלבון BCA.

לאחר קביעת ריכוז החלבון, הביאו אליקוט המתאים ל-20 מיקרוגרם של חלבון כולל ל-50 מיקרוליטר באמצעות מים נטולי יונים. לאחר מכן הוסף לתמיסה שני מיקרוליטר של 1.35 מיקרומולר של טלפון סלולרי ויניל HAUB. התוצאה היא 20 מיקרוגרם ליזאט ל-50 ננו מולרית של בדיקה בתערובת התגובה הסופית.

זה בעודף טוחנת גדולה. כדי להבטיח תיוג של אנזימי דה יוביקוויטין פונקציונליים, השאירו את התמיסה לדגירה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף מאגר דגימה לאלי לפתרון.

עבור נפח תגובה של 52 מיקרוליטר השתמש ב-26 מיקרוליטר של שני x מאגר דגימה, 13 מיקרוליטר של ארבעה x מאגר דגימה, או 8.87 מיקרוליטר של שישה x מאגר דגימה. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. מצננים על קרח.

לפני העמסת הג'ל לביצוע הכתם המערבי טען תחילה ג'ל של 12, ובכן ארבעה עד 20% טריס גליצין עם 40 מיקרוליטר מהדגימה המוכנה. הפעל את הג'ל ב 95 וולט עד שחזית היונים תגיע לתחתית. לאחר מכן בצע העברה לילית של הג'ל על קרום פלואוריד DI או PVDF פולי גפן לאחר מכן.

העברה ראשית, דגרו את הממברנה בכתם השחור AMDO וסרקו את הממברנה כדי לקבל תמונה המציגה את כמות החלבון בכל נתיב. לאחר מכן יש לעכב את הממברנה ולדגור בחלב של 5% ב-PBS למשך שעה כדי לחסום. לאחר מכן, דגרו את הממברנה בנוגדנים הראשוניים נגד HA בריכוז של 1 עד 10,000 בחלב 5% ב-PBS, או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, בצע שלוש כביסות במשך חמש דקות כל אחת ב-PBS עם חומר ניקוי של 0.1% עד 20. לאחר מכן דגרו את הממברנה בחזרת עכבר פרוקסידאז בריכוז של 1 עד 10,000 בחלב 5% ב-PBS למשך שעתיים לפחות. בצע שלוש חפיפות כמו קודם, ולאחר מכן שטיפה אחת במשך חמש דקות ב-PBS.

לבסוף דגרו את הממברנה במגיב זיהוי כימילומינסנט למשך 10 דקות וגלו באמצעות גלאי זוהר. השתמש בהגדרת החשיפה האוטומטית בגלאי. העמסת החלבון נבדקה באמצעות הכתם השחור AM mito.

שלב בקרה זה מבטיח שההבדלים בפעילות נובעים מתהליכים תאיים בפועל ולא מעומס חלבון לא שווה. המסלולים המוצגים כאן מציינים כמויות חלבון שוות ששימשו בניסוי הראשון. בניסוי השני, כמויות חלבון לא שוות נטענו עקב ההבדלים הצפויים בפרופילי הפעילות של קווי התאים השונים.

זה נעשה כדי להבטיח זיהוי של פרופיל פעילות עבור תא M 17. ליזאטים מודגרים עם אתיל מייד, שהוא מעכב ציסטין ואמור להוביל לאות מופחת בכתם המערבי. הממברנות הודגרו בנוגדנים ראשוניים נגד HA.

פרוקסידאז צנון של סוס עכבר, ולאחר מכן זוהה באמצעות הדמיה כימית. תיוג מוצלח של הדיבוב באמצעות הגשושיות מביא לפרופיל בכל נתיב של הממברנה. עוצמת הרצועות במשקלים מולקולריים שונים תואמת את רמת הפעילות של אנזים הדאב.

ההבדלים ברמות הפעילות של דובים שונים על פני קווי תאים ניכרים כאשר משווים חלבונים דומים כגון U CHL אחד בתאי he a ו-M 17. לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פיצול תת-תאי על מנת לענות על שאלות כמו, כיצד תהליכים פתולוגיים משפיעים על פעילות האנזים יוביקוויטין באברונים הקשורים לממברנה?

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד למדוד את פעילות האנזים דה ubiquitinated באמצעות בדיקות מכוונות אתר פעיל.