לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא להרחיב תאי גזע סרטניים במבחנה באמצעות טכניקת תרבית עצמאית של אנקורג', ולאחר מכן לבדוק את ההשפעות המטבוליות של טיפולים חדשים המכוונים לתאי גזע סרטניים. זה מושג על ידי פירוק תחילה של דגימת רקמת אדנוקרצינומה בלבלב אנושי לתרחיף תא בודד. בשלב השני, רקמת הגידול מתעכלת עוד יותר עם אנזימים ולאחר מכן נזרעת על צלחת ג'לטין כדי להסיר את אוכלוסיית תאי הפיברובלסטים, תאי הסרטן המבודדים נזרעים לאחר מכן בצלחת מרובת בארות צמודה נמוכה במיוחד, ומטופלים בתרופה המעניינת כדי להעריך את הפעילות המטבולית והיווצרות כדורי הגידול.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתרופה המעניינת בעכברים בעלי מערכת חיסונית מוחלשת הנושאים xenografts שמקורם בחולה כדי לאמת את השפעות התרופה in vivo. שיטה זו היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה של תאי גזע סרטניים ומשמשת כצעד ראשון לפיתוח טיפולים חדשים ממוקדי תאי גזע סרטניים. מי שידגים את ההליך יהיו אני, חוקר זוטר במרכז לתאי גזע בסרטן והזדקנות במכון לסרטן השד וטיני קרוז, דוקטורנטית מהמעבדה שלי לבודד תאי גזע סרטניים מאדנוקרצינומה של צינור הלבלב בארון בטיחות ביולוגית סטרילי.

השתמש באזמל סטרילי ובמלקחיים כדי לטחון את הגידול האנושי בצלחת תרבית בגודל 60 על 15 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של PBS סטרילי, והוסף עוד שלושה עד ארבעה מיליליטר של PBS לפי הצורך עד שהרקמה מתנתקת לחלוטין. העבירו את תרחיף הרקמה לצינור חרוטי סטרילי והוסיפו PBS לנפח סופי של חמישה מיליליטר. לאחר מכן הומוגניזציה מכנית של הדגימה עם צנטריפוגת דיסוציאציה ולעכל את הרקמה ההומוגנית עם קולגנאז ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר שעה צנטריפוגה, התאים מתחדשים, משעים את הגלולה ב -10 מיליליטר של מדיום שלם. סנן את תרחיף התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר וסובב שוב את התאים. הפעם, החייאת הגלולה בחמישה מיליליטר של CK לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, הסר את מאגר הליזה של כדוריות הדם האדומות על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה במדיום תאי גזע סרטניים.

לאחר מכן דגרו את התאים על צלחת מצופה ג'לטין ב-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר את רוב תאי הפיברובלסטים הנצמדים במהירות. לאחר שעה, שחזר את הסופרנטנט וכמת את מספר תאי סרטן הלבלב ברי קיימא כדי להקל על היווצרות כדור הגידול לסרטן. העשרת תאי גזע מדללת את התאים בנפח המתאים של מדיום תאי גזע סרטניים לריכוז סופי של פי שניים פי 10 לשלושה תאים למיליליטר, ומצננת אותם על קרח למשך מספר דקות.

לאחר מכן, לאחר הוספת 500 מיקרוליטר של PBS לשורות הראשונות והאחרונות של 24 צלחת תאים עם חיבור נמוך במיוחד, השעו מחדש את התאים על ידי פיפטה וזרעו מיליליטר אחד של תאים לבאר לתוך הבארות הריקות של הצלחת. טפל בארבע בארות תאים בתרופה המעניינת ולפחות ארבע בארות בקרה שליליות עם רכב. לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שבוע אחד.

אחת ליומיים, הוסיפו טיפול טרי לרכב שלנו לכל אחת מהבארות. ביום החמישי או השביעי, העריכו את מספר כדורי הגידול שנוצרו עם מונה תאים אוטומטי המאפשר זיהוי מבנים גדולים יותר לאריזה סדרתית של כדורי הגידול. ביום השביעי, השתמש במסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לקצור את הכדורים.

לאחר מכן, סובבו את הכדורים ודגרו אותם במיליליטר אחד של טריפסין למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לפרק את הכדור לתרחיף תא בודד. לאחר מכן הרחב את התאים למשך שבעה ימים נוספים כפי שהודגם זה עתה כדי להכין את הכדורים למדידת מיני החמצן התגובתי שלהם או ייצור ROS לאחר דיסוציאציה כפי שהודגם זה עתה, סובב את הכדורים והשהה מחדש את הכדור ב-HBSS המכיל את הגשושית המתאימה. לאחר דגירה של 20 דקות בחושך ב-37 מעלות צלזיוס, הניחו את התאים על קרח עד לניתוח על ידי זרימה ציטומטרית כדי להכין את הכדורים למדידת צריכת החמצן שלהם.

ראשית מצפים צלחת תרבית תאים של 96 בארות עם דבק תאים ורקמות למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נתק את הכדורים והטריפסין כפי שהודגם. לאחר מכן שטפו את הצלחת פעמיים-שלוש במים כדי להסיר את צלחת ההדבקה העודפת, התאים הבודדים בשלוש פעמים 10 עד התאים החמישיים לבאר.

ב -150 מיקרוליטר של צריכת חמצן מדיום המכיל גלוקוז ונתרן פירובט מדביקים את התאים לתחתית הבארות על ידי צנטריפוגה עד שמגיעים ל-100 פעמים G. נותן לצנטריפוגה לעצור עם ההפסקה. לאחר מכן הפוך את כיוון הצלחת וחזור על הסיבוב.

כעת דגרו על התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני. בינתיים, טען את יבוא מחסניות הבדיקה. A, B ו-C.להזריק 25 מיקרוליטר של ריכוז של שלושה, שישה ותשעה מילי-מולרי של התרופה המעניינת בהתאמה, ולייבא D בריכוז של 25 מיקרו-ליטר של מעכב המיטוכונדריה rone.

כאשר התאים מוכנים, כייל את המחסנית וטען את לוחית תרבית התאים. לבסוף הפעל את הבדיקה עם הפרוטוקול הסטנדרטי של ערבוב ומדידה בניסויים מייצגים אלה, טיפול בתאי גזע של סרטן הלבלב עם מטפורמין הפחית מאוד את גודל ומספר כדורי הגידול. יתר על כן, הפחתות אלה הוצגו על ידי תרבויות ספירה משניות ושלישוניות.

גם כאשר רק תרבית הכדור הראשונית טופלה במטפורמין, מטפורמין פועל על פי הדיווחים כמעכב מיטוכונדריאלי. ואכן, בניסוי זה, התרופה נצפתה כגורמת לירידה מהירה ותלוית מינון בצריכת החמצן בתאי הגידול המתואמת עם יכולתה לגרום לייצור ROS. חשוב לציין, עכברים שטופלו במטפורמין מציגים ירידה קצרת טווח אך משמעותית בהתקדמות אדנוקרצינומה בלבלב בהשוואה לחיות ביקורת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתק גידולים אנושיים טריים. לבודד תאי סרטן ראשוניים, להגדיר כתרבית היווצרות כדור, ולהעריך את הפעילות המטבולית של תאי גזע של סרטן הלבלב.