Name: לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למדו להרחיב תאי גזע סרטניים בלבלב באמצעות טכניקת תרבית עצמאית בעזרת תרבית כדוריות גידול. שיטה זו מאפשרת לבחון את ההשפעות המטבוליות של תרופות חדשות המכוונות לתאי גזע סרטניים ולפתח אסטרטגיות טיפול מותאמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר הנוכחי נתמכה על ידי ERC מתקדם החוקר גרנט (Pa-CSC 233,460), השביעית תכנית המסגרת של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) במסגרת הסכם מענק לא 256,974 (EPC-TM-NET) ולא 602,783 (CAM-פאק ), Subdirección גנרל דה Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación תי-המרפא (PS09 / 02,129 &amp; PI12 / 02,643), ופרוגרמת Nacional de Internacionalización דה לה אני + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio דה Economía y Competitividad, ספרד). א Lonardo נתמכה על ידי רוש מלגה. מ &#39;שפי נתמכה על ידי predoctoral מלגת תכנית La Caixa.

<ol><li>Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KrasG12D-driven+genetic+mouse+model+of+pancreatic+cancer+requires+glypican-1+for+efficient+proliferation+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis.</a> Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Rahib, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+cancer+incidence+and+deaths+to+2030%3A+the+unexpected+burden+of+thyroid%2C+liver%2C+and+pancreas+cancers+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States.</a> Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).</li>
<li>Burris, H. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+survival+and+clinical+benefit+with+gemcitabine+as+first-line+therapy+for+patients+with+advanced+pancreas+cancer%3A+a+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial.</a> J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+plus+gemcitabine+compared+with+gemcitabine+alone+in+patients+with+advanced+pancreatic+cancer%3A+a+phase+III+trial+of+the+National+Cancer+Institute+of+Canada+Clinical+Trials+Group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group.</a> J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+III+randomized+comparison+of+gemcitabine+versus+gemcitabine+plus+capecitabine+in+patients+with+advanced+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer.</a> J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).</li>
<li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li>
<li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li>
<li>Gourgou-Bourgade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+FOLFIRINOX+compared+with+gemcitabine+on+quality+of+life+in+patients+with+metastatic+pancreatic+cancer%3A+results+from+the+PRODIGE+4%2FACCORD+11+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial.</a> J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+%26+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Stem cells & pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).</li>
<li>Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+stem+cells--insights+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives.</a> Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).</li>
<li>Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+cancer+stem+cells%3A+a+new+target+for+anti-cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy.</a> Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of pancreatic cancer stem cells.</a> Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Gallmeier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ataxia+telangiectasia-+and+Rad3-related+function+abrogates+the+in+vitro+and+in+vivo+tumorigenicity+of+human+colon+cancer+cells+through+depletion+of+the+CD133%28%2B%29+tumor-initiating+cell+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction.</a> Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).</li>
<li>Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors.</a> Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).</li>
<li>Mueller, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+targeted+treatment+to+eliminate+tumorigenic+cancer+stem+cells+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%2FActivin+signaling+drives+self-renewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+is+a+marker+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target.</a> Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li>
<li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+reveals+Lgr5%2B+stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li>
<li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li>
<li>Shaw, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+LKB1+mediates+glucose+homeostasis+in+liver+and+therapeutic+effects+of+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin.</a> Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).</li>
<li>Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+and+cancer%3A+doses%2C+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li>
<li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li>
<li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability%3A+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li>
<li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44%2BCD24-%2Flow+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2%2B+human+breast+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li>
<li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518(2013).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2%2Fneu-transformed+mammary+tumorspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li>
<li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li>
<li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rodent+neurogenic+regions%3A+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells%2C+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li>
<li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%27side+population%27+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+autofluorescence%3A+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li>
</ol>

יש הסופרים שום עניין מתחרה לחשוף.

עם הופעתה ולאחר מכן אימות של מושג CSC לגידולים רבים, תחום פיתוח תרופות צבר תאוצה חדשה, עם הפוטנציאל לפיתוח טיפולים יעילים יותר בסרטן ובהמשך הפחתת סיכון להשנות מחלה. עם זאת, בתחום CSC הוא עדיין במצב מוקדם יותר וצריכים להיות מושגים במונחים של הבנת מקור CSC והתפשטות, ותפקידם בעיצוב ארכיטקטורת הגידול וקידום גרורות. בהקשר זה, השימוש במבחני CSC לשחזור ומשמעותיים, כמו גם את הפרשנות מושכלת של נתונים המתקבלים מהווה מרכיב חיוני לקידום ההבנה של הביולוגיה CSC שלנו. מהרבה נקודות מבט ביולוגיות, היווצרות הכדור התפתחה כassay יקר מאוד; בכל זאת משתמשים צריכים להיות מודעים למגבלותיה כדי לפרש כראוי תוצאות הניסויים שלהם. היבט חשוב לשקול עוד לפני ההערכה של פורם תחוםנתונים tion הוא המקור של המדגם נחקר, שכן התוצאות המתקבלות מדגימות שמקורם בחולה טריות יכולות להיות שונות באופן משמעותי מאלה המתקבלים משורות תאי הסרטן שהוקמו. מבחני היווצרות כדור קלאסיים כרוכים בזריעת תאים בצפיפות משובט בצלחות ultralow-התקשרות והערכת היווצרות כדור בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו / או הגורם בסיסי צמיחת פיברובלסטים (ב-FGF) מועשר, אבל בינוני סרום ללא 21, 34. הרכב בינוני התרבות הוא גם נושא חשוב לשקול. מניסיוננו מצאנו כי DMEM / F12 בתוספת B27, bFGF וגלוטמין בהעדר הסרום היה בינוני אופטימלי לגדול, להתרחב ולשמור על CSC בתנאים שלא עברו התמיינות. מצאנו כי במצב זה תרבות (בינוני והשעיה) התאים לבטא כמויות גבוהות של סמני תא גזע סרטני (כולל CD133 +, CD44 + וCD24 +) ואינו מבטאים את החלבונים הקשורים בידול (CK-20 וCK-19). אחת מהנחות היסוד למבחנים אלה הוא שכל תחום הוא משובט, כלומר, כדור אחד כתוצאה מהתרחבות של תאי גזע בודדים. עם זאת, התחומים הם במהות מבנים דינמיים שנוטים הפתיל אפילו בצפיפות זריעה נמוכה 35. תאי ציפוי הוא שלב קריטי בפרוטוקול והצפיפות של תא אחד / טוב בהחלט יכול לעקוף את הבעיה הצבירה. אבל גם לאבות מסודרים מכאן ולהבא, זה תוצאות באופן קבוע בהיווצרות כדור נמוכה מאוד בשל פעילות היווצרות כדור פנימית נמוכה ויכול גם להיות מיוחס לגירוי autocrine מוגבל בשל תופעות דילול. מניסיוננו אנו ציינו כי רק 30% מתאים מצופים מסוגלים ליצור כדורים. אנו ממליצים להשתמש בלפחות 100 תאים / טובים כדי להשיג תוצאות עקביות לשחזור. שיטות אחרות לתרבות CSC צמיחה מבוססות על תרבויות 3D מוצקות או חצי מוצק (למשל, מבוססת על מ &#39;atrigel, קולגן או methylcellulose). שיטות אלה היו בשימוש כדי להגביל את הניידות תא ותא צבירה לאחר 36. עם זאת, כל אחד ממטריצות אלה נושא מגבלות שלהם. לדוגמא, matrigel הוא קרום מסיס מרתף מבודד מEngelbreth-הולם-סוואן (EHS) גידול ואף לחלץ דומה סביבת גידול תאית המורכבת הנמצאת ברקמות רבות, הוא מכיל גורמי גדילה מוגדרים יותר או פחות מרובים אשר לעתים קרובות הופך מכניסטית לימודים לאלמנטי רגולציה ספציפיים קשים מאוד. נקודת השיקול נוספת היא שפונקציות תא קיבולת וגזע יוצרי תחום אינן תנאים להחלפה 34. בעוד תאי גזע ואב מסוימים הוכחו תערוכה כישלון להרכיב תחום יכולת 37, ליצור כדורים במבחנה אינו שולל in vivo תפקוד גזע / אב. לדוגמא, תאי גזע שקטים יכולים פשוט לא להגיב לרמזים תאיים הניתנים על ידינבחר בתנאי תרבות חוץ גופית. כך, לטווח ארוך במבחנה וביכולת התחדשות עצמית vivo של אוכלוסיות תאים מטוהרים, מעדיף בpassaging הסידורי, יש לבחון על מנת להוכיח או להפריך תפקוד תא גזע. בהקשר זה, את היכולת מכאן ולהבא ובו זמנית כדי להפיץ אוכלוסיות מגוונות של תאי גזע ואב הוא היבט קריטי של assay יוצרי תחום והופך assay זה יקר מאוד לשדה CSC; כל עוד המגבלות שלה נשמרות במוח לפרשנות של נתונים המתקבלים. מבחני יוצרי כדור היו בשימוש נרחב לזהות למפרע תאי גזע המבוססים על היכולת שלהם לחידוש עצמי ובידול ברמת התא הבודד במבחנה. הגילוי של סמנים המאפשרים בידוד הפוטנציאלי של תאי גזע וצאצאיהם מהנישה שלהם in vivo מאפשר התכונות הפונקציונליות של אוכלוסיות מטוהרים להיות מוגדרות. גombination של assay היווצרות הכדור וFACS הוא אסטרטגיה מוצלחת לבודד תאים מרקמות מוצקות או להעשיר תת-אוכלוסיות ספציפיות של PDAC בתרבות. לדוגמא, ביטוי בו זמני של EpCAM, CD24 וCD44 מגדיר תת-אוכלוסייה של CSCS מסוגל: התחדשות עצמית, להבדיל וליזום גידול, המשקף את ההטרוגניות של הגידול המקורי. הרמן ואח &#39;. הראה כי תאי CD133 + דיבוק יכולת שגשוג מוגבר וCSC כולל 15. סמנים אחרים יש גם שימשו לאפיון של CSCS: הביטוי (dehydrogenase-1 אלדהיד) ALDH- 1 קשור לתאים סרטניים מאוד בסרטן לבלב 38; תאים מסוגלים להוציא את צבע DNA Hoechst 33342, אוכלוסיית צד בשם תאים (SP), יש את היכולת המוכחת ליזום גידולים 39. לאחרונה הראו כי תא autofluorescence subcellular מאפיין אוכלוסייה מובחנת של תאים אנושיים עם תכונות CSC בלעדיות על פני סוגים שונים של גידול40. למרות שאף אחד מסמנים אלה מופיע לאפיין אוכלוסייה טהורה של CSCS סלקטיבי, יותר ומורכבים יותר שילובים של סמנים צריכים לשמש כדי לטהר FACS אוכלוסיות מעודנות יותר של תאים. שאלות רבות עדיין נותרו על התפקיד המדויק של CSCS במקור, ההתקדמות, והעמידות לתרופות של גידולים. לדוגמא, דרך אחת להתייחס לשאלה של התפתחות משובט להגדיר אם וכיצד CSC אחד יוזם גידול, יכול להיות לנתח דגימות מטופל בשלבים שונים של המחלה, ובמיוחד אחרי המספרים של CSCS במהלך ואחרי הטיפול. על ידי מענה על שאלות אלה, אנחנו יכולים לעשות התקדמות משמעותית של הידע שלנו על CSCS בגידולים מוצקים ולפתח טיפולים תרופתיים למניעת התקדמות גידול והישנות סופו של דבר.

אדנוקרצינומה ductal לבלב (PDAC) היא אחד מהגידולים מוצקים האגרסיביים ביותר. זה כרגע 4 th המוות הקשורים לסרטן הנפוץ ביותר בחברה מערבית, והוא צפוי לעלות ל -2 הגורם השכיח ביותר בעשור הקרוב (~ 400,000 מקרי מוות בשנה בעולם) 3 הורגש תכונת זמן אבחון 90% מהחולים בהווה עם מחלה מתקדמת, שבו יש 5 שנות הישרדות של פחות מ -5%. שיעור הישרדות זה נותר ללא שינוי ב -50 השנים האחרונות מאכזב למרות פעילות מחקר אינטנסיבית יותר ויותר 4. של יתרת 10% מהחולים שיש להם פוטנציאל מחלת ריפוי &quot;דרך כריתה כירורגית, 80% ימותו מהישנות בתוך 5 שנים. במשך שנים רבות את רמת הטיפול למחלה מתקדמת הייתה טיפול יחיד gemcitabine, אבל זה רק מקנה יתרון הישרדות שולי 5. שיפורים קטנים בהישרדות לטווח קצר הושגו על ידי התוספתשל erlotinib 6 או 7 capecitabine, אולם יתרון ההישרדות הוא בסדר הגודל של שבועות עם חציון ההישרדות הכוללת עדיין ~ 6 חודשים. לאחרונה, תוצאות מעודדות יותר צמחו לgemcitabine / NAB -paclitaxel 8 ושילוב FOLFIRINOX משטר 9,10. טיפולים אלה משפרים הישרדות החציוני על ידי צנוע חודשים 2 ו -4 בהתאמה, אבל הם רעילים ביותר וניצולים לטווח ארוך עדיין יוצא דופן. למרות שהטיפול מציע את הפוטנציאל לשיפור, אלה הם רעילים למשטרים שחולים רבים אינם מגיבים או רק להראות שיפור מצטבר בהישרדות כוללת. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף להשלים טיפולים הנוכחיים ולפתח רומן, גישות טיפוליות multimodal הסבירות ביותר. הטרוגניות גידול זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי ההטרוגניות הסרטן אינה מוגבלת רק לwithi subclones אבולוציונית נפרדn כל גידול 11, אלא גם מונע על ידי פנוטיפי והטרוגניות פונקציונלית וגמישות בתוך כל subclone 12. מה שנקרא תאי גזע סרטני (CSCS) או תאי קידום גידול אחראים להטרוגניות intraclonal 13-16. באופן ספציפי, CSCS מייצג קבוצת משנה של תאי סרטן, שעבורו אנו ואחרים סיפקנו ראיות חותכות, עד לתא הבודד, שהם מייצגים את השורש של מחלה על ידי מתן עלייה לכל progenies המובחן בתוך כל subclone סרטן 17. יותר מכך, תאים אלה הם חיוניים להתנהגות גרורתי וגם מהווים מקור חשוב להישנות מחלה לאחר טיפול, אפילו עם תרופות יעילות יחסית מסוגלת גרימת רגרסיה ראשונית גידול (למשל, -paclitaxel NAB) 15,18-20. חשוב לציין כי CSCS אינו מיצג בהכרח תאי גזע בתום לב, ואין הם נובעים מתאי גזע רקמות במקרים רבים, אלא שהם צריכים ACQuired תכונות מסוימות של תאי גזע. רוב אלה תפקודי מוגדרים, לדוגמא CSCS מצויד ביכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת הופכת אותם עמידה לכימותרפיה קונבנציונלית, ולהראות עליית הפולשנות שמקדמת פעילות גרורתי. פנוטיפים תאי גזע סרטניים פונקציונליים פנוטיפ הפונקציונלי של CSCS מבוסס על היכולת שלהם להגדרה עצמית, לחדש, אשר יכול להיבדק במבחנה באמצעות היווצרות כדור סידורי ומבחני הקמת המושבה בהתאמה. אפילו יותר מכך, CSCS מסוגל דוב התחדשות עצמית בtumorigenicity vivo אשר יכול להיבדק על ידי הגבלת דילול במבחני vivo כקריאת הנתונים הפונקציונליות האולטימטיבית, רצוי במהלך השתלה סידורי מעידה על tumorigenicity לטווח ארוך הבלעדי. יתר על כן, יש הטרוגניות בתוך תא CSC, עם תת-אוכלוסייה מובחנת של CSCS נושא את היכולת הבלעדית ללהצמיח גרורות שאינה רקתוצאה ישירה שלהם בלעדי בtumorigenicity vivo. ואכן, CSCS metastastitic לרכוש את היכולת להתחמק הגידול הראשוני, לשרוד anoikis וסופו של הדבר translocate וזרע אתרים משניים. ניתן לבדוק את היכולות הפונקציונליות המתקדמות אלה במבחנה באמצעות מבחני שונה פלישה וin vivo באמצעות מבחני גרורות. מיקוד תאי גזע סרטני אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות משכנעות כי טיפולים המתמקדים בגידול בכמות גדולה של תאי PDAC מובחנים, אפילו בשילוב עם סוכני מיקוד סטרומה, אין להם השפעה גדולה על התקדמות גידול ותוצאה שלאחר מכן, אלא אם כן בשילוב עם אסטרטגית CSC מיקוד 21, 22. לפיכך, המבוסס על הפונקציות חיוניות של CSCS בהתקדמות מחלה והתנגדות לטיפול, תאים אלה צריכים לסמן רכיב חיוני לכל גישת טיפול חדשנית 18,20, אבל ידרשו הבנה הרבה יותר מעמיקה oF מכונות רגולציה של CSCS. למרות CSCS וprogenies המובחן יותר שלהם לשאת מדינות קרקע גנטיות זהות ביחס לשינויים גנטיים, CSCS להפגין ביטוי גנים שונה ובכך epigenetically נחוש פרופילי שמודולים שתפו עם תאי גזע pluripotent. רוב הגנים מעורבים בתאי גזע pluripotent מניבה מושרה (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) לא רק קשור לסרטן, אבל הביטוי שלהם הוא בעיקר מוגבל לתא CSCS. יתר על כן, את הרלוונטיות הפונקציונליות של CSCS על ידי ניסויי פסד של פונקציה באמצעות כלים גנטיים למיקוד CSCS כעת מבוססים היטב את מושג CSC לכמה סוגי הסרטן 23-25. בעוד שרוב הגישות אלה מבוססים על מודלים של עכברים, ולכן הם לא בקלות להעברה למרפאה, הם מספקים הוכחה של קונספט להרלוונטיות קלינית הפוטנציאלית של מיקוד CSCS בשילוב עם תאי גידול בתפוצה רחבה. לומד תאי גזע סרטניים וביtro לזהות עקב אכילס שלהם על מנת לזהות דרכים חדשות וקליני רלוונטיות למיקוד CSCS, התכונות שלהם הם למדו באופן קבוע במבחנה והיווצרות כדור נמצאת בשימוש נרחב בהקשר זה. פותח במקור ללימוד ביולוגיה של תא גזע נורמלי, לרבות חידוש עצמי ויכולת הבחנה, assay זה היה מאוחר יותר מותאם ללמוד CSCS במבחנה והיה בשימוש כבר חוקר CSCS מבודד מPDAC 20. מצאנו כי תחומי גידול שנוצרו מתאי PDAC אנושיים ראשוניים לשאת את כל התכונות הייחודיות של CSCS, לכן מציין שהם מכילים CSCS לבלב בתום לב 21. לפיכך, assay תחום גידול מייצג כלי רב עוצמה למסך לטיפולים יעילים יותר במבחנה, אבל תוצאות צריכה להיות מוערכות יותר במחמיר יותר במבחני vivo. ואכן, יש להתייחס אל הנתונים שנוצרו עם assay זה במבחנה בזהירות רבה כמו הassay הדואר יכול להיות כפוף לשגיאה משמעותית. פרוטוקולים סטנדרטיים ביותר, כולל ספירה אוטומטית של תחומים נוצרו, יש להקים כדי להבטיח נתונים לשחזור וחיזוי. בהקשר זה, לאחרונה בשימוש assay זה מסך CSCS לבלב נגזר מקבוצה מגוונת של PDACs האנושי הראשוני, והראינו כי תאים אלה הם פגיעים מאוד לתכנות מחדש על ידי חילוף חומרים מטפורמין מתחם נגד סוכרת. בעבר, מטפורמין כבר הוכיח לעכב התפשטות תאים סרטנית על ידי הפעלה עקיפה של קינאז מופעל-AMP חלבון (AMPK) איתות ועיכוב הבא של mTOR 26, וכתוצאה מכך סינתזת חלבון מופחתת ותא התפשטות 27. בנוסף להשפעות אלה על אוכלוסיית הגידול בתפוצה רחבה, אנו ואחרים מצאנו כי מטפורמין יכול למקד ולמעשה לחסל את תת-האוכלוסיה CSCS במספר גידולים מוצקים כגון שד, סרטן הוושט, סרטן הלבלב וגליובלסטומה 28-31 &lt;/ Sup&gt;. לפיכך, מטפורמין מייצג אסטרטגיה טיפולית חדשה ומבטיחה ובטוחה לכמה סוגי סרטן עם צורך רפואי כיום. יתר על כן, באמצעות יצירת מרחב כדרך להעשיר לCSCS, הראו שההשפעות העיקריות של מטפורמין על CSCS הלבלב היו עצמאית של הפעלת AMPK והסתמך בעיקר על הרעילות של המיטוכונדריה הצנועה שלה (באמצעות בלימה שלי מורכב), שככל הנראה הייתה קטלני לקבוצת משנה של CSCS בלבד. לזה האחרון שהיינו מסוגל להעריך ייצור צריכת החמצן וROS המיטוכונדריה הסלולרי שלהם כמדדי הרעילות של התרופה ברמה התאית. בהמשך לכך, במבחנה נתונים אלה ניתן היו לאמת במודלים של עכברים פרה-קליניים ואכן הביאו ממושך הישרדות 31 באופן משמעותי. המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת לדור המהיר של פרופילי רגישות התרופה לCSCS, כוללים מחקרים על ההשפעות שלהם על חילוף חומרים CSC. עכשיו אנו מספקים הוארכו פרטים ניסיוניים על com מנוצלplementary במבחנה ובנהלי vivo.

<table><tbody><tr><td>תא ספירה/המוציטומטר&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Co</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>CASY מונה תאים ומנתח למדידת התפשטות וכדאיות</td><td>Roche Innovatis</td><td>AG CASY דגם TTC 45,60,150 &mu; מ</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissociator&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>צינורות GentleMACS C&nbsp;</td><td>Miltenyi Co</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחות חיבור נמוכות במיוחד&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות 100 מ"מ&nbsp;</td><td>מסננת BD Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Cell&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל&nbsp;</td><td>בז BD</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי מפוליפרופילן 50 מ"ל&nbsp;</td><td>בז BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות סטריליות 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>אפנדורף</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי סטריליות, כלי 10 ס"מ&nbsp;</td><td>353003</td><td></td> <td>מחטי קורנינג</td></tr><tr><td>26 גרם&nbsp;</td><td>מזרק BD Falcon</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>100 ul המילטון&nbsp;</td><td>מזרק המילטון Co</td><td>81075</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג IV&nbsp;</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>7909</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, 100X&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>מטפורמין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>D150959-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין, 200 מ"מ, 100X&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>100mM תמיסת נתרן פירובט&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>מדיום בדיקת סוסון ים&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Cell-TAK דבק תאים ורקמות&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין, 0.05%&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 50x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה בסיסי של פיברובלסטים&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium/F12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 1x Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Carboxy-DCFDA(5-(ו-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>C-369</td><td></td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 70% (נפח/נפח)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>IsoVet, בראון</td><td>571105.8</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>35620</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה</td><td>&nbsp; Puritan medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF96e FluxPak עם לוחות תאים, קליברנט ומחסניות</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>XF96e מנתח שטף חוץ-תאי</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator עם קלט CO2;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>מעוקלים</tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>רסיס</tr><tr><td>קליפר</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

אדנוקרצינומה ductal לבלב (PDAC) מכילה תת-קבוצה של תאים סרטניים באופן בלעדי גזע סרטני (CSCS) אשר הוכחו לנהוג ייזום גידול, גרורות והתנגדות לradio- וכימותרפיה. כאן אנו מתארים מתודולוגיה ספציפית לculturing CSCS לבלב האנושי ראשוני כתחומי גידול בתנאי מעגן-עצמאי. תאים גדלים בתנאים שאינם חסיד סרום ללא כדי להעשיר לCSCS תוך progenies המובחן יותר שלהם אינו שורד ומתרבה בשלב הראשוני לאחר זריעה של תאים בודדים. assay זה יכול לשמש כדי להעריך את אחוז CSCS הנוכחי באוכלוסייה של תאים סרטניים. שני הגודל (אשר יכול לנוע 35-250 מיקרומטר) ומספר תחומים גידול שנוצרו מייצגים פעילות CSC טיפחה בשני אוכלוסיות בתפזורת של תאים סרטניים בתרבית או גידולים טריים שנקטפו ומתעכלים 1,2. שימוש assay זה, מצאנו לאחרונה כי מטפורמין סלקטיבי ablates pancreatCSCS IC; ממצא זה אומת לאחר מכן נוסף על ידי הוכחת ביטוי מצומצם של גנים / סמני משטח הקשורים pluripotency ומופחת בtumorigenicity vivo של תאים שטופל במטפורמין. כצעד הסופי לפיתוח פרה-קליני שטופלנו עכברי נושאי גידולים הוקמו עם מטפורמין ומצאנו ממושכים הישרדות באופן משמעותי. מחקרים קליניים בודקים את השימוש במטפורמין בחולים עם PDAC נערכים כיום (לדוגמא, NCT01210911, NCT01167738, וNCT01488552). מכניסטי, מצאנו כי מטפורמין גורם למשבר אנרגיה חמור בCSCS ידי שיפור מיני חמצן מגיבים ייצור (ROS) וצמצום פוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריה. לעומת זאת, אינו CSCS לא בוטל על ידי טיפול במטפורמין, אלא עבר עצירת מחזור התא הפיכה. לכן, המחקר שלנו משמש כדוגמא מוצלחת לפוטנציאל של היווצרות כדור במבחנה ככלי מיון לזהות תרכובות שעלולים להיות יעד CSCים, אך טכניקה זו תדרוש נוספת במבחנה ובאימות vivo לחסל תגליות שווא.

מטפורמין סלקטיבי מטרות CSCS לבלב בדקנו ראשון השפעות התפקודיות של טיפול מטפורמין על יכולת התחדשות עצמית במבחנה של CSCS. לצורך כך, ערכנו מבחני היווצרות כדור באמצעות תאים ראשוניים אדם לבלב סרטן מבודד מרקמות PDAC במהלך ניתוח כריתה. הבחנו כי מטפורמין חזק ירד בגודל של כדורים נוצרו (איור 1 א). זה היה ככל הנראה על ידי עיכוב התפשטות progenies של CSC, שעדיין מייצג את חלק הארי של תאים הנמצאים בתחומים שהם מועשרים רק לCSCS. ואכן, תחומים יותר מתורבתים ללא passaging נרחב יותר הרחבת progenies המובחן יותר יהיה. כך מצאנו מטפורמין כדי להקטין באופן משמעותי את מספר התחומים יצרו למעשה ללא קשר לגודלם, המתרחש באופן תלוי מינון מציע עיכוב חזק של יכולת ההתחדשות העצמית של Cמאמנים (מידע לא מוצג). מצאנו מטפורמין שב -3 מ&quot;מ ירד מספר תחומים נוצר (איור 1) באופן משמעותי. כדי ללמוד יותר מחמיר ההשפעות ארוכת הטווח של מטפורמין על יכולת ההתחדשות העצמית של CSCS, אנחנו לאחר מכן passaged תחומים העיקריים נוצרו לתחומים שניוניים ושלישונית. למרות שטופלו רק תחומים עיקריים עם מטפורמין, ההיווצרות של תחומים בקטעים השני והשלישי הייתה באופן דרסטי ויותר ויותר מופחת, לסבך את טיפול מטפורמין אכן בלתי הפיך בוטל רוב CSCS (איור 1 ג). כך, הנתונים שלנו הראו השפעות טיפול משמעותיות למטפורמין על יכולת ההתחדשות העצמית של CSCS לבלב העיקרי ובכך עודדו אותנו לבצע מכניסטית נוסף, כמו גם מחקרי in vivo. מטפורמין מעכב צריכת חמצן מיטוכונדריאלי וגורם ייצור ROS מאז metformin הוצג לפעול כרעל המיטוכונדריה על ידי באופן חלקי עיכוב אני פעילות מורכבת, אנחנו הבאים בחנו את ההשפעות אקוטיות של מטפורמין על צריכת חמצן סלולרית בתאים שמקורם תחום. לשם כך, אנו נבחרו תאים נגזרים משני גידולים עיקריים PDAC נציג ומדדנו את צריכת החמצן לאורך זמן לאחר הזרקה רציפה של 3 מ&quot;מ מטפורמין (שלוש זריקות) וrotenone 1 מיקרומטר (זריקה אחת). כפי שניתן לראות באיור 2 א, הזרקת מטפורמין ביאה לירידה מהירה ותלוי-מינון בצריכת חמצן, שהייתה שונות משמעותי בין הגידולים השונים. חישבנו את פעילות המיטוכונדריה שייר על טיפול מטפורמין על ידי הזרקת rotenone, מורכב חזקה אני מעכב, אשר מסוגל עיכוב צריכת חמצן במיטוכונדריה לחלוטין. רגישות למטפורמין במונחים של צריכת חמצן במיטוכונדריה מתואמת עם היכולת שלה לגרום לייצור ROS המוגדר כעקירה של הממוצע של popuויסות לאחר טיפול מטפורמין (איור 2, פנל משמאל), שניתן לכמת (איור 2, פנל מימין) בקלות. כצפוי, התאים הראשוניים שהיו רגישים ביותר לעיכוב של צריכת חמצן גם הראו העלייה החזקה ביותר בייצור ROS על טיפול מטפורמין. לפיכך, חילוף חומרים במבחנה ניסויים אלה מראים כי CSCS מטרות מטפורמין על ידי עיכוב התלות שלהם בתפקוד המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך עלייה שלאחר מכן בייצור ROS המיטוכונדריה וסופו של דבר אינדוקציה של אפופטוזיס. מטפורמין הדוכנים PDAC התקדמות in vivo לבסוף בחנו את ההשפעות של מטפורמין in vivo באמצעות xenografts רקמה נובע מחולים שונים עם PDAC. צפינו ירידה משמעותית בהתקדמות גידול לעכברים שטופל במטפורמין לעומת קבוצת הביקורת, אך לא גידולי Disa לחלוטיןppeared (איור 3). בהמשך לכך, במהלך תקופת מעקב כל הגידולים ארוך טווח הישנות סופו של דבר המצביעה על התנגדות מטפורמין של תאים ששרדו את השלב הראשון של טיפול. עם זאת, הטיפול במטפורמין, אפילו כשהם מיושמים כסוכן יחיד, הרחיב באופן משמעותי את הישרדות בכל העכברים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> איור 1. מטפורמין סלקטיבי מטרות CSCS. () מטפורמין ירידה בגודל של כדורים. נציג תמונות של תחומים המתקבלות לאחר הטיפול עם המינונים המצוין של מטפורמין במשך 7 ימים (פנל מימין). כימות של גודל כדור (n≥6) (פנל משמאל), המספרים שצוינו בציר abscissas מייצגים גידול בודד. יכולת היווצרות כדור בנוכחות או עדר של מטפורמין במשך 7 ימים (n≥6), המספרים שצוינו בabscissas (ב)ציר מייצג גידול בודד. גרף נציג יכולת התחדשות עצמית CSC בתחומים שניוניים ושלישונית של תאי סרטן לבלב עיקריים (C). טופלו התחומים רק במהלך היווצרות כדור הדור הראשון עבור הסכום כולל של 7 ימים (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> איור 2. צריכת חמצן מטפורמין הטיפול מעכב וגורם ROS ייצור. () בנוסף מטפורמין מעכבים צריכת חמצן (OCR) של תאים שמקורם בתחום. טופלו שני תחומים משניים PDAC שונים עם מטפורמין ושינויי OCR נמדדו על ידי ניתוח שטף תאי. הזרקת Rotenone שימשה כביקורת לצריכת OCR המיטוכונדריה.ציר ה- X מייצג את שיעור צריכת החמצן בpmol של חמצן / שעה מנורמלות על ידי תכולת החלבון בכל טוב. תחומי PDAC (ב &#39;) בשימוש בטופלו במשך שעה 8 עם מטפורמין וייצור ROS הוערך על ידי cytometry זרימה באמצעות carboxy-DCFDA. עזבתי זרימת נציג, cytometry מגרשים. נכון, סיכום של נתונים משלושה ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> איור 3. מטפורמין דוכנים PDAC התקדמות in vivo. שתי רקמות xenograft PDAC שונות הושתלו לעכברים דיכוי חיסוניים וטיפול הוקצה לאחר לקחת גידול ראשוני אומת. (150 מ&quot;ג / קילוגרם גוף טופלו עכברים עם מטפורמין (Met) הוסיפו למים שתיית ווילהילחם; בהתבסס על 5 מיליליטר של צריכת מים ליום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

ניתן להרחיב תאי גזע של סרטן הלבלב (CSCs) במבחנה באמצעות טכניקת תרבית כדור בלתי תלויה בעיגון, המייצגת כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה של CSC ויכולה לשמש כצעד ראשון לפיתוח טיפולים חדשניים ממוקדי CSC. כאן ניתנת המתודולוגיה להרחבה, ניתוח ומיקוד של CSCs בלבלב.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא להרבית תאי גזע סרטניים in vitro באמצעות טכניקה של תרבית בלתי תלויה במצע (Anchorage independent), ולאחר מכן לבחון את ההשפעות המטבוליות של טיפולים חדשניים המכוונים לתאי גזע סרטניים. דבר זה מושג תחילה על ידי פירוק דגימת רקמה של אדנוקרצינומה של הלבלב אנושית לתליה של תאים בודדים. בשלב השני, רקמת הגידול מעובדת בעזרת אנזימים ולאחר מכן נזרעה על פלטת ג'לטין. כדי להסיר את אוכלוסיית תאי הפיברובלסט, תאי הסרטן המבודדים נזרעים לאחר מכן בפלטת ריבוי בארות בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment), ומטופלים בתרופה הנבדקת כדי להעריך את הפעילות המטבולית ואת היווצרות ספרואידי הגורם (tumor spheres).בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתרופה הנחקרת בעכברים עם מערכת חיסונית מוחלשת הנושאים השתלות קסנוגרפט ממקור חולה (patient derived xenografts) כדי לתקף את השפעות התרופה in vivo. שיטה זו מהווה כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה של תאי גזע סרטניים ומשמשת כצעד ראשון בפיתוח טיפולים חדשים המכוונים לתאי גזע סרטניים. מי שידגימו את הפרוצדורה הם אני, חוקר זוטר במרכז לתאי גזע בסרטן והזדקנות במכון לסרטן השד, וטיני קרוז, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי, לצורך בידוד תאי גזע סרטניים מאדנוקרצינומה של תעלות הלבלב בתוך קבינה סטרילית לבטיחות ביולוגית.השתמש בסקלפל ובפינצטה סטריליים כדי לקצץ את הגידול האנושי בתוך צלחת תרבית של 60 על 15 מילימטר המכילה 1 מיליליטר של PBS סטרילי, והוסף עוד 3 עד 4 מיליליטר של PBS לפי הצורך עד שהרקמה תהיה מפורקת לחלוטין. העבר את תגלי השביעות של הרקמה לשפופרת קונית סטרילית והוסף PBS עד לנפח סופי של 5 מיליליטר. לאחר מכן, בצע הומוגניזציה מכנית לדגימה באמצעות צנטריפוגת דיסוציאציה ועשה עיכול לרקמה ההומוגנית באמצעות collagenase בטמפרטורה של 37 °C.לאחר סבב צנטריפוגה של שעה, יש לבצע רסוספנזיה לתאים על ידי תליית המשקע ב-10 milliliters של מצע מלא. סננו את תליית התאים דרך מסננת של 40 micrometer והספח את התאים שוב לצנטריפוגה. הפעם, בצעו רסוספנזיה למשקע ב-5 milliliters של CK. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את בופר הליזה של כדוריות הדם האדומות באמצעות צנטריפוגה ותלו את המשקע במצע תאי גזע סרטניים.לאחר מכן, דגרו את התאים בצלחת מצופה ג'לטין בטמפרטורה של 37 °C כדי להסיר את רוב תאי הפיברובלסטים הנצמדים במהירות. לאחר שעה, אספו את העילאי (supernatant) וכמתו את מספר תאי סרטן הלבלב החיוניים כדי להקל על יצירת ספירות גידולים עבור העשרת תאי גזע סרטניים; דללו את התאים בנפח המתאים של מצע גידול לתאי גזע סרטניים עד לריכוז סופי של 2×10³ תאים ל-mL, וקררו אותם על קרח למשך מספר דקות.לאחר הוספת 500 µL של PBS לשורות הראשונה והאחרונה של פלטת תאים בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment) של 24 בארות, השביהו מחדש את התאים באמצעות פיפט והעבירו 1 mL של תאים לכל בארה מהבארות הריקות בפלטה. טפלו ארבע בארות של תאים בתרופה הנבדקת ולפחות ארבע בארות של ביקורת שלילית באמצעות ה-vehicle. לאחר מכן, הדגרירו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2 למשך שבוע.בכל יום שני, הוסף לכל אחת מהבארות טיפול רענן במנשאת התרופה. ביום החמישי או השביעי, העריך את מספר ספירות הגידול שהיווצרו באמצעות סופר תאים אוטומטי המאפשר זיהוי של מבנים גדולים יותר לצורך אריזה סדרתית של ספירות הגידול. ביום השביעי, השתמש במסנן תאים של 40 micrometer כדי לאסוף את הספירות.בשלב הבא, סבבו את הכדורים במערכת צנטריפוגה והדגירו אותם ב-1 mL של trypsin למשך 20 דקות ב-37 °C כדי לפרק את המשקע לסuspended של תאים בודדים. לאחר מכן, הרחיבו את התאים למשך שבעה ימים נוספים כפי שהודגם זה עתה, כדי להכין את הכדורים למדידת ייצור רדיקלי חמצן פעילים או ROS לאחר הפירוק. כפי שהודגם, סבבו את הכדורים במערכת צנטריפוגה והשעיקו מחדש את המשקע ב-HBSS המכיל את הגשושית המתאימה. לאחר דגירה של 20 דקות בחושך ב-37 °C, הניחו את התאים על קרח עד לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה כדי להכין את הכדורים למדידת צריכת החמצן שלהם.ראשית, יש לצפות פלטת תרבית תאים של 96 בארות בחומר דביק לתאים ורקמות למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לפרק את הספירות (spheres) באמצעות טריפסין כפי שהודגם. לאחר מכן, יש לשטוף את הפלטה שתיים עד שלוש פעמים במים כדי להסיר את שאריות החומר הדביק, ולזרוע את התאים הבודדים בריכוז של 3 × 10⁵ תאים לבאר.ב-150 µL של תווך לבדיקת צריכת חמצן המכיל גלוקוז וסודיום פירובט, הדבק את התאים לתחתית הבארות באמצעות סבב צנטריפוגה עד להגעה ל-100 ×g. הנח לצנטריפוגה לעצור כאשר הבלם כבוי. לאחר מכן, הפוך את כיוון הפלטה וחזור על סבב הצנטריפוגה.כעת דגרו את התאים למשך 30 דקות ב-37 °C ללא פחמן דו-חמצני. בינתיים, טענו את כניסות מחסנית הבדיקה A, B ו-C. הזרקו בהתאמה 25 µL של ריכוזים של 3, 6 ו-9 mM של התרופה הנבדקת, ואת כניסה D טענו עם 25 µL של ריכוז 1 µM של מעכב המיטוכונדריה rone.כאשר התאים מוכנים, יש לכייל את המחסנית ולהטעין את פלטת תרבית התאים. לבסוף, הרץ את הבדיקה לפי הפרוטוקול הסטנדרטי של ערבוב ומדידה. בניסויים מייצגים אלו, טיפול של תאי גזע של סרטן הלבלב במטפורמין הפחית משמעותית את גודלם ומספרם של ספרואידי התסביב (tumor spheres). יתרה מכך, הפחתות אלו נצפו גם בתרביות ספרואידים משניות ושלישיות.גם כאשר רק תרבית ספירות ראשונית טופלה במטפורמין, דווח כי מטפורמין פועל כמעכב מיטוכונדריאלי. ואכן, בניסוי זה, נצפה כי התרופה גורמת לירידה מהירה ותלוית-מינון בצריכת החמצן בתאי הגידול, דבר המתואם עם יכולתה להשרות ייצור של ROS. באופן משמעותי, עכברים שטופלו במטפורמין הראו הפחתה קצרה אך משמעותית בהתקדמות של אדנוקרצינומה של הלבלב בהשוואה לבעלי חיים מקבוצת הביקורת.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע דיסוציאציה של גידולי אדם טריים, לבודד תאי סרטן ראשוניים, להקים תרבית ליצירת ספירות ולהעריך את הפעילות המטבולית של תאי גזע של סרטן הלבלב.

studying-pancreatic-cancer-stem-cell-characteristics-for-developing

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטן בתאי גזע (CSCs) זוהו במספר מחלות ממאירות. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת תזרים cytometric ניצול אלדהיד דהידרוגנז הפעילות CD44 ו CD24 ביטוי לבודד CSCs מ xenografts אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי. תאים אלה קיימא לאחר מכן ניתן להשתמש במחקרים פונקציונלי אנליטית.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

מאמר זה מתאר את הטכניקה לבידוד תאי גזע סרטניים של הלבלב (CSC) מרקמת אדנוקרצינומה של צינור הלבלב האנושי (PDAC). CSCs אלה משמשים לחקר ההשפעות הפונקציונליות של טיפול תרופתי על יכולת ההתחדשות העצמית במבחנה של CSCs לפיתוח טיפולים יעילים יותר בסרטן.

בידוד תאי גזע PDAC: שיטה לבידוד תאי גזע סרטניים מגידולי לבלב

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לפיתוח ספרואידים של תאי גזע סרטניים בלבלב במבחנה. הבדיקה יכולה לשמש ככלי סינון לזיהוי תרכובות שעלולות להתמקד בתאי גזע סרטניים.

בדיקת היווצרות כדור: שיטת מבחנה לזיהוי תאי גזע של סרטן הלבלב וטיפולי מסך

הבנת תפקידם של תאים דמויי גזע סרטניים בהישנות גידול ועמידות לטיפולים הפכה לנושא בעל עניין רב בעשור האחרון. מאמר זה מתאר את הבידוד והאפיון של תת-אוכלוסייה של תאים דמויי גזע סרטניים מקווי תאי קרצינומה קשקשית בראש ובצוואר (HNSCC).

בידוד ואפיון של ראש וצוואר קשקש Cell Carcinoma-אוכלוסיית מאפייני תאי גזע לאחר

המטופל-התרבויות הנגזרות של הלבלב אדנוקרצינומה הם מודל תלת מימדי מבוסס במהירות המייצגים תאים סרטניים אפיתל הגידול עם נאמנות גבוהה, המאפשר מחקר טרנסלtional לתוך זה ממאירות קטלני. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות כדי ליצור ולהפיץ אורגנואידים, כמו גם לבצע מאמר ביולוגי רלוונטי באמצעות מודלים אלה.

בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

בהקשר הקליני, חולים עם סרטן הלבלב מקומי יעברו כריתת לבלב ואחריו טיפול אדג'ובנטי. פרוטוקול זה שדווח כאן נועד לבסס שיטה בטוחה ויעילה של מידול תרחיש קליני זה בעכברים עירומים, באמצעות השתלה אורתוטופית של סרטן הלבלב ואחריו כריתת לבלב דיסטלית וכריתת טבור.

מודל עכבר כריתה אורתוטופי של סרטן הלבלב

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו - in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

אלושתלים אורתוטופיים סינגניים של אדנוקרצינומה צינורית הלבלב (PDAC) משחזרים את הביולוגיה, הפנוטיפים והתגובות הטיפוליות של תת-סוגי מחלות. בשל התקדמות הגידול המהירה והניתנת לשחזור, הם נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים. כאן, אנו מראים שיטות עבודה נפוצות ליצירת מודלים אלה, הזרקת תרביות PDAC מורין סינגני לתוך הלבלב.

Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts למודל סרטן הלבלב

תאים מטאפלסטיים של הלבלב הם מבשרי תאים ממאירים המעוררים גידולים בלבלב. עם זאת, בידוד תאי לבלב שלמים הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. התאים יכולים לשמש לריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) או לתרבית משותפת דו-ממדית או תלת-ממדית.

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנות מחדש של אדנוקרצינומה צינורית לבלב (PDAC) ותאי אפיתל צינור לבלב נורמליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). אנו מספקים הליך אופטימלי ומפורט, שלב אחר שלב, החל מהכנת lentivirus ועד הקמת קווי iPSC יציבים.

תכנות מחדש של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב לפלוריפוטנציה

למדו להרחיב תאי גזע סרטניים בלבלב באמצעות טכניקת תרבית עצמאית בעזרת תרבית כדוריות גידול. שיטה זו מאפשרת לבחון את ההשפעות המטבוליות של תרופות חדשות המכוונות לתאי גזע סרטניים ולפתח אסטרטגיות טיפול מותאמות.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

גלה סרטונים נוספים