Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את הכמיסה של שורת תאים קטבוליים תרמוגניים ואת יישומיה in vitro ופוטנציאלית in vivo. כדי להתחיל בהליך זה, הכין תרחיף תאים של סודיום אלגינאט והעבר אותו למזרק של חמישה מיליליטר. השלב הבא הוא שימוש במכשיר כמיסה כדי לייצר את מיקרו-חרוזי האלגינאט.

לאחר מכן מצפים את המיקרו-חרוזים בתמיסת poly L lysine פוליאניונית, ואת ליבת האלגינאט מסירים לאחר מכן כדי ליצור ממברנה חדירה באופן חלקי סביב תרחיף תאים. השלב הסופי הוא גידול משותף (co-culture) של התאים המעטפים עם שורות תאים אחרות או הזרקתם לרקמות השומן של עכברים. בסופו של דבר, ניתוח אימונו-דם מראה פעילות ליפוליטית גבוהה יותר באדיפוציטים שגודלו במשותף עם aldehyde dehydrogenase, במיקרו-קפסולות המכילות אדיפוציט חסר באנזים זה.

בעוד שאימונוהיסטוכימיה מעידה על השתלה מוצלחת של תאים עטופים לרקמות השומן של עכברים, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תרמוגנזה ורקמת apus. ניתן להחיל אותה גם על מודלים בעלי חיים קיימים אחרים כדי לספק מערכת מודל ניסויי בעלות נמוכה לבדיקת תת-אוכלוסיות של תאים in vivo. לצורך גילויים ביו-רפואיים, יש לבצע את כל ההליכים בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית ברמה 2 עם זרימה למינרית.

בתחילה, יש להסיר את המצע הישן מבקבוק תרבית התאים ולשטוף את הפרה-אדיפוציטים עם 10 milliliters של PBS. יש להסיר את ה-PBS ולסבב מחדש את התאים בשני milliliters של 0.25%tripsin EDTA. יש להוציא מנה של 10 microliter מתלי התאים ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר.

בהתאם להוראות היצרן, הוסיפו DMEM לתאים שנותרו כדי להגיע לכמות התאים האידיאלית, וסובבו במערך צנטריפוגה במהירות של 480 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר קביעת כמות התאים הדרושה על פי ההנחיות בטקסט הפרוטוקול, השעו את משקע התאים בנפח מתאים של תמיסת נתרקים של סודיום אלגינט בריכוז 2%. העבירו את תמיסות התאים עם הסודיום אלגינט למזרק של חמישה מיליליטר.

הסיר בועות אוויר מהתמיסה והפוך את המזרק כדי ליצור כיס אוויר של 1 מיליליטר. כדי להכין את התהליך לאנקפסולציה, הנח כלי זכוכית קטן המכיל 144 מיליליטר של תמיסת calcium chloride בריכוז 100 מילימולרית. תחת פיית המחט של מכשיר האנקפסולציה, חבר את האלקטרודה אל החומר העוטף כאשר הקצה נמצא במרחק של כ-2.5 סנטימטרים מעל פני תמיסת ה-calcium chloride.

מקם את המזרק המכיל את תמיסת התאים של סודיום אלגינאט בחוזקה במזרק המשאבה. חבר את צינור הגומי לפתח של המזרק. דחף את הבוכנה עד שתמיסת התאים של סודיום אלגינאט תגיע למחצית הדרך בתוך הצינור.

כווננו את המתח ל-5.4 kilovolts והגדירו את הקוטר ל-12.06 millimeters במשאבת המזרק. כווננו את המהירות לשלושה milliliters per hour. הפעילו את המשאבה, הפעילו את מכשיר הכלילה (encapsulate) ושמרו על מתח של 5.4 kilovolts.

סגרו את חלון המCה וסורגו רעידות מיותרות עד להשלמת היווצרות חלקיקי המיקרו-כדורים של האלגינאט. לאחר שכל התמיסה עברה דרך המחט, השאירו את המיקרו-כדורים של האלגינאט להתמצק בתמיסת calcium chloride למשך 20 דקות נוספות לפני הציפוי ב-polyanionic polylysine או PLL. לאחר שחלקיקי המיקרו-כדורים של sodium alginate התמצקו, הוציאו את הכלי המכיל את המיקרו-כדורים ממכשיר הכמיסה.

העבירו את המיקרו-beads לשפופרת צנטריפוגה של 50 milliliter. הסירו את תמיסת ה-calcium chloride ממשקע המיקרו-beads. שטפו את המיקרו-beads על ידי הוספת 30 milliliters של תמיסת 0.9% sodium chloride וניעור עדין של השפופרת ביד.

השאירו את המיקרו-בידס לשקוע בכוח הכבידה. לאחר מכן, השתמשו בפיפט של 25 מיליליטר כדי להסיר את תמיסת הנתרן כלוריד באופן זה. שטפו את המיקרו-בידס סך הכל שלוש פעמים.

בשלב הבא, הוסיפו את תמיסת ה-0.05% PLL למיקרו-בידס. השתמשו ב-10 milliliters של תמיסת PLL עבור כל milliliter אחד של תמיסת סודיום אלגינאט. ערבבו במכשיר vortex במהירות של 1000 rotations per minute למשך 10 דקות, זמן שבדרך כלל מספיק לציפוי ה-PLL.

לאחר אישור היווצרותו של ציפוי ה-PLL, הסר את תמיסת ה-PLL ושטוף את הקפסולות שלוש פעמים בתמיסת sodium chloride בריכוז 0.9% כפי שהודגם קודם לכן. כדי להסיר תחילה את הליבה החלופית מהמיקרובידס המצופים ב-PLL, הוסף 30 מיליליטר של תמיסת sodium citrate בריכוז 50 millimolar למבחנה בנפח 50 מיליליטר. המתן חמש דקות או עד להמסה מלאה של ה-sodium alginate. שטוף את הקפסולות שלוש פעמים בתמיסת sodium chloride בריכוז 0.9% כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר השטיפה השלישית, העבירו לנבובת 20 milliliters של מצע תרבית, וכל הקפסולות המכילות את התאים לבקבוק תרבית תאים; טיפלו בתאים המעוקפים תחת תנאי תרבית תאים סטנדרטיים. יש לתרבת את תאי המארח להליך זה בפלטות בעלות 24 בארות עד להגעה למצב של התמגשות (confluence). השתמשו במצע גידול לפיברובלסטים שהוכן כמתואר בפרוטוקול המלווה.

טקסט לתרבית של פרה-אדיפוקיטים. העבירו את המיקרוקפסולות לצלחת 24 בארות המכילה תאי מאכסן בשכבה רצופה (confluent), הוסיפו מיקרוקפסולות כדי להשיג שכבה אחת (monolayer) בכל בארה, והשרה את התמיינות הפרה-אדיפוקיטים באמצעות מדיום התמיינות 1. הדגירו למשך 48 שעות.

לאחר 48 שעות, יש להחליף את המצע למצע דיפרנציאציה מסוג Differentiation Medium Two. יש להחליף את המצע במצע Differentiation Medium Two טרי מדי 48 שעות. חלבונים מהתאים ינותחו מדי 48 שעות באמצעות Western blot.

ניתן לצפות בכל שלב של ייצור המיקרו-חרוזים תחת המיקרוסקופ. מיקרו-חרוז אלגינט מוצג בהגדלה של 20 x. לפני ציפוי PLL, לאחר הציפוי ב-PLL ולאחר המסת הגרעין בג'לטין. במחקר כמותי, הושוותה אקספרסיה של adipose triglyceride lipase או ATGL בין אדיפוציטים של 3T3-L1 שגודלו בתרבית משותפת עם מיקרו-קפסולות המכילות אדיפוציטים מסוג wild type או אדיפוציטים חסרי aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) שאינם תאיים.

ביטוי גבוה יותר של A TGL באדיפוציטים שגודלו בתרבית משותפת עם adipocyte המחסור ב-L DH one A one המכיל מיקרו-קפסולות מעיד על פעילות ליפוליטית גבוהה יותר. במחקר in vivo, תאים עטופים המסומנים ב-GFP הוזרקו למאגר השומן התוך-בטני של עכברים. לאחר 80 ימים, כרית השומן המוזרקת הראתה צבירי תאים עטופים בצבע שונה.

חתך של מאגר שומן תוך-בטני הטבוע בפראפין וצבוע בהמטוקסילין ואאוזין מראה מקבצים של תאים במיקרו-קפסולות מושתלות ואדיפוציטים של המאכסן. אותו חתך, בניתוח תחת אור פלואורסצנטי, מראה תאים מושתלים המסומנים ב-GFP בחלק הפנימי של קפסולות עגולות ושלמות. ביטוי ה-GFP מהווה גם אינדיקטור לחיוניות התאים לאחר פיתוחם.

טכניקה זו של אנקפסולציה סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המחלות המטבוליות לבחון טיפולים אפשריים עבור השמנת יתר, עמידות לאינסולין בסוכרת מסוג 2, דלקת וסרטן באורגניזמים מודל.