Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאנקפסולציה של תאים קטבוליים, הצורכים שומנים לייצור חום ברקמת השומן התוך-בטנית ומגבירים את פיזור האנרגיה בעכברים שמנים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את האנקפסולציה של קו תאים קטבולי תרמוגני ויישומיו במבחנה ופוטנציאלית in vivo. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תרחיף תאי נתרן אלגינט והעבירו אותו למזרק של חמישה מיליליטר. השלב הבא הוא להשתמש במכשיר אנקפסולציה כדי לייצר את המיקרו-חרוזי האלגינט.

לאחר מכן המיקרו-חרוזים מצופים בתמיסת פולי ליזין פולי אוני, וליבת האלגינט מוסרת לאחר מכן ליצירת קרום חדיר למחצה סביב תרחיף תאים. השלב האחרון הוא תרבית משותפת של התאים העטופים עם קווי תאים אחרים או להזריק אותם לרקמות השומן של עכברים. בסופו של דבר, ניתוח דם חיסוני מראה פעילות ליפוליטית גבוהה יותר באדיפוציטים שגודלו יחד עם אלדהיד דהידרוגנאז, שומן אחד חסר המכיל מיקרו-קאפ.

בעוד שאימונוהיסטוכימיה מראה השתלה מוצלחת של תאים עטופים ברקמות השומן של עכברים, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תרמוגנזה ורקמת אפוס. ניתן ליישם אותו גם על מודלים קיימים אחרים של בעלי חיים כדי לספק מערכת מודל ניסיוני בעלות נמוכה לבדיקת תת-קבוצה של תאים in vivo. עבור תגליות ביו-רפואיות, יש לבצע את כל ההליכים בארון בטיחות ביולוגית ברמה שתיים עם זרימה למינרית.

כדי להתחיל, הסר את המדיום הישן מבקבוק תרבית התאים ושטוף את הפרה-אדיפוציטים עם 10 מיליליטר PBS. הסר את ה-PBS והשהה מחדש את התאים בשני מיליליטר של 0.25% טריפסין ב-EDTA. הסר 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים וספור תאים באמצעות ציטומטר המו.

על פי הוראות היצרן, הוסף DMEM לתאים הנותרים כדי לקבל את הכמות האידיאלית של תאים וצנטריפוגה ב -480 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר קביעת כמות התאים הדרושה בהתאם להוראות בטקסט הפרוטוקול, אנו משעים את כדור התא בנפח מתאים של תמיסה נטו נתרן אלגין 2%. העבירו את תמיסת תאי הנתרן אלגינט למזרק של חמישה מיליליטר.

הסר את כל בועות האוויר בתמיסה והפוך את המזרק ליצירת כיס אוויר של מיליליטר אחד. כדי להתכונן למעטפת, הניחו קטנה המכילה 144 מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד של 100 מילי-מולרי. מתחת לזרבובית המחט של מכשיר העטיפה, חבר את האלקטרודה למעטפת עם הקצה כ -2.5 סנטימטרים מעל פני תמיסת הסידן הכלורי

הנח את המזרק המכיל את תמיסת תאי הנתרן אלגינט בחוזקה במשאבת המזרק. חבר את צינור הגומי לפתח המזרק. דחוף את הבוכנה עד שתמיסת תאי הנתרן אלגינט נכנסת לאמצע הצינור.

כוונן את המתח ל -5.4 קילו-וולט והגדר את הקוטר ל -12.06 מילימטרים על משאבת המזרק. התאם את המהירות לשלושה מיליליטר לשעה. הפעל את המשאבה, הפעל את המעטפת ושמור על המתח על 5.4 קילו-וולט.

סגור את חלון מכסה המנוע והימנע מרעידות מיותרות עד להשלמת היווצרות המיקרו-חרוזים האלגיניים. לאחר שכל התמיסה עברה דרך המחט, מצק את המיקרו-חרוזים בצורת כדור אלגינט בתמיסת הסידן כלוריד למשך 20 דקות נוספות לפני הציפוי בפוליליזין פוליאניוני או PLL. לאחר שהמיקרו-חרוזים בצורת כדור תא נתרן אלגינט התמצקו, הסר את הכוס המכילה את המיקרו-חרוזים ממכשיר האנקפסולציה.

העבירו את חרוזי המיקרו לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. הסר את תמיסת הסידן כלוריד מכדור המיקרו-חרוז. שטפו את המיקרו-חרוזים על ידי הוספת 30 מיליליטר של תמיסת נתרן כלורי 0.9% וניעור עדין של הצינור ביד.

אפשר למיקרו-חרוזים לשקע על ידי כוח הכבידה. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להסיר את תמיסת הנתרן הכלורי באופן זה. שוטפים את המיקרו-חרוזים בסך הכל שלוש פעמים.

לאחר מכן, הוסף את תמיסת ה-PLL של 0.05% למיקרו-חרוזים. השתמש ב-10 מיליליטר של תמיסת PLL עבור כל מיליליטר אחד של תמיסת נתרן אלגינט. מערבולת ב -1000 סיבובים לדקה למשך 10 דקות, מה שבדרך כלל מספיק לציפוי PLL.

לאחר אישור היווצרות מעיל ה-PLL, הסר את תמיסת ה-PLL ושטוף את הכמוסות שלוש פעמים בתמיסת נתרן כלורי של 0.9% כפי שהוצג קודם לכן, כדי להסיר תחילה את הליבה החלופית מהמיקרו-חרוזים המצופים PLL, הוסף 30 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט של 50 מילי-מולרית לצינור של 50 מיליליטר. המתן חמש דקות או עד שכל הנתרן אלגינט יתמוסס. שטפו את הכמוסות שלוש פעמים בתמיסת נתרן כלורי 0.9% כפי שהוצג קודם לכן.

לאחר השטיפה השלישית ב-20 מיליליטר של מדיום תרבית להעברת הצינור, כל הכמוסות המכילות את התאים לבקבוק תרבית תאים מטפלות בתאים העטופים בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. יש לתרבית את תאי המארח להליך זה ב-24 צלחות באר עד להתלכדות. השתמש במדיום גידול פיברובלסטים שהוכן כמתואר בפרוטוקול הנלווה.

טקסט לתרבית קדם-אדיפוציטים. העבר את המיקרו-כובעים לצלחת 24 הבארות המכילה תאים מארחים מתלכדים, הוסף מיקרו-כובעים כדי להשיג חד-שכבתי בכל באר לגרום להתמיינות קדם-אדיפוציטים עם התמיינות. בינוני אחד דגירה למשך 48 שעות.

לאחר 48 שעות, שנה את המדיה לבידול. בינוני. שנית, החלף את המדיה בבידול חדש. בינוני.שתיים. כל 48 שעות ינותחו חלבונים מהתאים על ידי כתם מערבי.

ניתן לצפות בכל שלב בייצור המיקרו-חרוזים תחת המיקרוסקופ. מיקרו-חרוז אלגינט מוצג בהגדלה של פי 20. לפני ציפוי PLL, לאחר קידוד עם PLL ולאחר המסת ליבת הג'ינט במחקר כמותי, ביטוי של שומן, טריגליצריד ליפאז או A TGL הושווה בין שלושה T, שלושה L, אחד אדיפוציטים בתרבית משותפת עם סוג בר תאי או אלדהיד דהידרוגנאז אחד A, אחד חסר שומן המכיל מיקרו-קאפ.

הביטוי הגבוה יותר של A TGL באדיפוציטים שגודלו יחד עם L DH אחד A עם מחסור בציטים המכילים מיקרו-קאפ מעיד על פעילות ליפוליטית גבוהה יותר. במחקר in vivo, תאים עטופים עם תווית GFP הוזרקו לתוך דפו השומן התוך בטני של עכברים. 80 יום לאחר מכן, כרית השומן שהוזרקה בחרה אשכולות דהויים של תאים עטופים.

קטע משובץ פרפין של מצבור השומן התוך בטני המוכתם בהמט, טואין ואאוזין מראה אשכולות של תאים עטופים במיקרו-קאפ מושתלים ותאים מארחים. אותו קטע שנותח באור פלואורסצנטי מראה תאים מושתלים עם תווית GFP בחלק הפנימי של קפסולות עגולות שלמות. הביטוי של GFP הוא גם אינדיקטור לכדאיות התא לאחר התפתחותו.

טכניקת אנקפסולציה זו סללה לחוקרים בתחום המחלות המטבוליות לחקור טיפולים אפשריים להשמנה, עמידות לאינסולין בסוכרת מסוג 2, דלקת וסרטן ואורגניזמים מודאליים.