Name: Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב גין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: למדו שיטת טרנספקציה עדינה לתאי RAW264.7 עם גני לוציפראז מדווחים ללא הפעלת תגובות חיסוניות. פרוטוקול זה מאפשר מחקר ביולוגיה תאית ומאקרופאג'ים תוך שמירה על מצב מנוחה של התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR). STC מחזיקה בפרס מחקר לדוקטורט מה-CIHR וקרן מייקל סמית'. EYS מחזיקה במלגת CIHR. תוכנית ההכשרה להשתלות CIHR סיפקה גם מלגות לתארים מתקדמים ל-STC, EYS ו-SS.

1. פלסמיד דנ&quot;א טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה- DNA פלסמיד באמצעות ערכת maxiprep פי הפרוטוקול של היצרן. פלסמיד דנ&quot;א הגלול ב500 μl של TE חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פנול: כלורופורם: מיצוי אלכוהול isoamyl והמשקעים isopropanol להסרת מזהמי חיידקי שייר. הנוכחות של LPS מפריעה transfection 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1, pH 8) לפלסמיד דנ&quot;א ולנער במרץ במשך 15 שניות. פנול גורם לכוויות בעור חמורות והוא הרדמה כך כוויות לא תמיד הרגישו עד שניזק חמור. בצע פנול: מיצוי isoamyl במנדף ולנקוט באמצעי זהירות: כלורופורם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 5 דקות על RT. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT. העבר את 350 μl של שלב מימי העליון לתוך צינור 1.5 מיליליטר אוסף חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl של TE חיץ לצינור המכיל את השלב האורגני הנמוך. לנער במרץ במשך 15 שניות. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 5 דקות על RT. העבר את 350 μl של שלב מימי העליון לאותו צינור איסוף 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70 μl של 3 נתרן אצטט M (pH 5.2) ומערבבים היטב. להוסיף 700 μl של isopropanol 100%. מערבבים היטב דגירה 10 דקות ב RT. צנטריפוגה ב 13,000 XG במשך 10 מינת 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 75% אתנול לגלולה. דגימות מערבולת לערבב וצנטריפוגות ב XG 5000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant. ה- DNA הוא בגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הכובע של הצינור ואוויר יבש גלולה ב RT עבור 5 - 10 דקות. גלולה צריכה להיות שקופה. הוסף 500 μl של TE חיץ לresuspend גלולה DNA. חום ב50 - 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפזר את גלולה DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר (A260) ו -280 ננומטר (A280) עם ספקטרומטר. חשב את הריכוז של ה- DNA על ידי הכפלת ערך A260 ב -50 ng / μl. להעריך את האיכות של ה- DNA על ידי calculatinז יחס A260 / A280. ה- DNA באיכות גבוהה צריך לתת יחס A260 / A280 של 1.8-2.0. </li></ol> 2. culturing תא וזריעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי RAW264.7 תרבות DMEM בתוספת 9% בסרום עוברי עגל (FCS / 9% DMEM) ב37 ° C, חממה 5% CO 2. במהלך כל קטע, לנתק את התאים מהצלחת ידי pipetting הרציף בעזרת פיפטה פסטר. מעבר התאים כל 2 ימים, וזרע 1.5-2,000,000 תאים על צלחת טופלה תרבית רקמת 10 סנטימטרים כמניות. להפשיר מלאי חדש של תאים בכל 5-6 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום transfection, זרע 200,000 תאים לכל גם בצלחת 24 גם בנפח של 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה התאים במשך 4 שעות בחממת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Transfect גם עם מגיב שומנים מבוססי (שלב 3.1) או מגיב מבוסס polyamine חלבון / (שלב 3.2). </li></ol> 3. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection שומנים מבוסס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את reagen transfectionלא לRT בחושך. לחמם את מדיום סרום ללא וDMEM / 9% FCS 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד 50 μl של מדיום סרום ללא בצינור 1.5 מיליליטר. הוסף 2 μl של מגיב transfection עם קצה פיפטה מתחת לפני השטח של הנוזל. מערבולת 6 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התערובת מגיב / DNA בחושך ב RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה 30 דקות, להסיר את המדיה מהבאר ולהוסיף 250 μl של FCS DMEM / 9% הטריים היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להוסיף 250 μl של DMEM / 9% FCS לתערובת מגיב / DNA. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 300 μl של התערובת מדוללת היטב כל אחד. דגירה של 2-4 שעות ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון transfection ולהוסיף 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה של 24-48 שעות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור לפני גירוי תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון / transfection מבוסס polyamine: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הסרום ללאבינוני וFCS / 9% DMEM 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.75 μl של מגיב transfection ל18.75 μl של מדיום סרום ללא. בקצרה מערבולת לערבב. לדגור על RT במשך 5 דקות. הוסף 0.5 μl של 1 מיקרוגרם / μl DNA לדילול מגיב transfected. לדגור על RT במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה 10 דקות, להסיר את התקשורת מכל טוב של הצלחת 24 גם ולהוסיף 250 μl FCS / 9% DMEM הטרי היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, להוסיף 250 μl של FCS / 9% DMEM לתוך התערובת מגיב / DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 270 μl של התערובת מדוללת לטוב. דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור 2 - 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון transfection ולהוסיף 500 μl של FCS / 9% DMEM. דגירה של 24-48 שעות ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 4. גירוי תא וAssay בלוציפראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת בהיטב עם 250 μl של FCS / 9% DMEM הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LPS או LPS + IL-10 בריכוזים הרצויים לטוב. להחזיר את הצלחת לC ° 37, חממת 5% CO 2. לעורר ל2-6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון גירוי על ידי שאיפה, לשטוף עם קרח הקר PBS, ולהוסיף 200 μl של 1x פסיבי תמוגה הצפת. רוק בRT למשך 30 דקות. לגרד ולהעביר את lysate לצינורות 1.5 מיליליטר ולהסיר פסולת תא על ידי צנטריפוגה ב -20,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 40 μl של lysate פינה (supernatant) לצלחת לבנה, ברורה תחתונה 96-גם לקביעת אותות לוציפראז על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את האות בלוציפראז עם luminometer פני כל ספקטרום האור הנראה. </li></ol> ניתוח נתונים 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הגחלילית: יחס Renilla ידי חלוקת ערכים אישיים של לוציפראז גחלילית על ידי הערכים של לוציפראז Renilla מכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שינוי הקיפול על ידי חלוקת גחלילית: יחס Renilla של מטופלים היטב על ידיכי הבאר שלא טופלה. </li></ol>

<ol><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).</li>
<li>Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+transient+transfection+of+a+murine+macrophage+cell+line+RAW+264.7%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7.</a> Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).</li>
<li>Kim, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+ingest+and+are+activated+by+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA.</a> Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).</li>
<li>Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+activation+of+the+RAW264.7+macrophage+cell+line+by+transfected+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA.</a> Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).</li>
<li>Jiang, W., Pisetsky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+HMGB1+release+from+RAW+264.7+cells+by+transfected+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA.</a> Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).</li>
<li>Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+inducible+gene+expression+by+signal-dependent+transcriptional+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation.</a> Cell. 138 (1), 129-147 (2009).</li>
<li>Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+inhibits+lipopolysaccharide+induced+miR-155+precursor+stability+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation.</a> PLoS One. 8 (8), e71336(2013).</li>
<li>Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Effects+of+lipopolysaccharide+on+transfection+efficiency+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells.</a> Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).</li>
<li>Berghaus, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+primary+murine+macrophage-lineage+cells+and+RAW+264.7+cells+to+ligands+of+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).</li>
<li>Fiszer-Kierzkowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+DNA+carriers+may+induce+cellular+stress+response+and+change+gene+expression+pattern+in+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול מתואר כאן אינו אך ורק להתמקד ביעילות transfection, אבל מטרתו לאזן בין היעילות ושימור של המדינות הפיזיולוגיות של התאים. באופן ספציפי, ההליך שלנו מצליח למזער את הרעילות של מגיב transfection ולמקסם את האות בלוציפראז. שלב קריטי אחד בפרוטוקול הוא הבריאות של התאים. תרבויות פרא אינן מתאימות לtransfection שינוייהם הפיסיולוגיה, וculturing הרציף של תאי RAW264.7 לתקופה ארוכה של זמן יכול גם לשנות את הפנוטיפ ותפקוד ...

Transfection של חומצות גרעין בתאים יש יישום מגוון במחקר מדעי. דוגמאות כוללות (1) גני כתב כדי ללמוד את התפקיד של גורמים גנטיים שונים בביטוי גנים, (2) פלסמידים ביטוי חלבון לביטוי יתר של החלבון של עניין, ו- (3) קטן מפריעים RNA לdownregulate ביטוי גנים. על ידי מניפולציה של רמת הביטוי של גנים מסוימים ומדידת השפעת ההפרש של מניפולציות כאלה, חוקרים יכולים להסיק את פונקציות הגן במערכות ביולוגיות שנבחרו. לא כל שיטות transfection לספק את אותה יעילות transfection, ואפילו באותה השיטה transfection לא transfect כל סוגי התאים באופן שווה 1. לפיכך, שיטות transfection שונות פותחו כגון שיטת סידן זרחה, dextran DEAE, transfection השומנים קטיוני, transfection פולימר שאינו השומנים קטיוני, electroporation, וnucleofection 2,3. Transfection למקרופאגים הוא ESPEקשה cially בשל העובדה שמקרופאגים הם phagocytes המקצועי, כי הם מאוד רגישים לחומרים זרים ובם חיידקים נגזרו DNA (מפוגל) 4. מבוא של דנ&quot;א זר מפעיל את המסלול-כמו אגרת קולט 9 (TLR9) שמוביל לייצור של ציטוקינים ו5,6 תחמוצת חנקן. מקרופאגים מופעלים אלה עשויים להיות אז פחות מגיבים לטיפול שהחוקרים מתכוונים לבדוק. המעבדה שלנו באופן שגרתי transfects שורת תאי מקרופאג RAW264.7 עם גני כתב בלוציפראז, ופתחנו פרוטוקול כי הוא חזק מספיק כדי להיות אות בלוציפראז גבוהה משמעותי מרקע, אבל גם עדין מספיק למקרופאגים להישאר במצב המנוחה שלהם. ההתנהגויות של תאי transfected הוערכו על ידי גן כתב גחלילית בלוציפראז מחסה אזור האמרגן של IκBζ (pGL3- IκBζ). ביטוי IκBζ הוא שהוגברו על ידי שפת רכיב קיר תא החיידקopolyssacharide (LPS) 7,8, וdownregulated ידי ציטוקינים אנטי-דלקתיים, Interleukin-10 (IL-10) 8. כדי להסביר את שונות בין transfection בארות, אנחנו שיתוף transfect פלסמיד שליטה המכיל את הגן בלוציפראז Renilla (למשל, phRL-TK) למטרות נורמליזציה. הפרוטוקול המתואר הוא מותאם לאחר בדיקת פרמטרים שונים, כולל תזמון של transfection, סוג של חומרים כימיים transfection, כמויות של חומרים כימיים transfection ושל פלסמיד דנ&quot;א, כמו גם יחס של מגיב transfection לפלסמיד דנ&quot;א. שני ריאגנטים transfection הכלולים בפרוטוקול זה הם (1) מגיב transfection שומנים מבוסס ו( 2) חלבון / מגיב transfection מבוסס polyamine.

<table><tbody><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210007</td><td>כל ערכת maxiprep תעבוד</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל</td><td>Life Technologies</td><td>15593-049</td><td>כיתה ביולוגיה מולקולרית. פנול רעיל אז עבדו במכסה האדים, אם אפשר. השתמש בשכבה האורגנית השקופה התחתונה אם נוצרות שתי שכבות של נוזל במיכל.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30243.01</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td>מושבת ב-56 מעלות; C אמבט מים למשך 45 דקות לפני השימוש.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>יש לחמם לטמפרטורת החדר לפחות לפני השימוש.</td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה XtremeGene HP DBA</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td>יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>5x מאגר ליזה פסיבי</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>30 מ"ל כלול במערכת הבדיקה Dual Luciferase Reporter</td></tr> מערכת <tr><td>הבדיקה Dual Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr></tbody></table>

transfecting תאי raw264.7 עם לוציפראז כתב ג&#39;ין

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

העברה של חומרים גנטיים רצויים לתאים היא הליך בלתי נמנע במחקרים ביו-רפואיים. בעוד שתוארו שיטות רבות, סוגים מסוימים של תאים עמידים לרבות מהשיטות הללו ומניבים יעילות טרנספקציה נמוכה1, מה שעלול לעכב את המחקר בסוגי תאים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הליך טרנספקציה אופטימלי להכנסת גנים מדווחים של לוציפראז כ-DNA פלסמיד לקו תאי המקרופאגים RAW264.7. מתוארים שני סוגים שונים של ריאגנטים טרנספקציה (מבוססי שומנים ומבוססי פוליאמין), והערות חשובות ניתנות לאורך הפרוטוקול כדי להבטיח שתאי RAW264.7 ישתנו באופן מינימלי על ידי הליך הטרנספקציה וכל נתוני הניסוי המתקבלים הם התוצאות הישירות של הטיפול הניסיוני. בעוד שיעילות הטרנספקציה עשויה שלא להיות גבוהה יותר בהשוואה לשיטות טרנספקציה אחרות, ההליך המתואר חזק מספיק לזיהוי אות לוציפראז ב-RAW264.7 מבלי לשנות את התגובה הפיזיולוגית של התאים לגירויים.

איור 1 משווה את יעילות transfection של שני ריאגנטים transfection בRAW264.7. מגיב השומנים מבוססי בדרך כלל נתן שיעור transfection כ -25% ואילו transfection מבוסס polyamine חלבון / הביא כ -5% יעילות (איור 1 א). ההבדל ביעילות transfection נצפה גם באותות בלוציפראז בתאי RAW264.7 transfected עם כתב אמרגן pGL3-IκBζ (איור 1). תוספת של LPS לתאי transfected אלה הגדילה את אות גחלילית בלוציפראז, אינדיקציה ישירה של פעילות שעתוק המוגברת של כתב א...

טרנספקציה לקו תאי המקרופאגים, RAW264.7, קשה בשל התגובה הטבעית של התא כנגד חומרים זרים. תיארנו כאן הליך עדין אך חזק להעברת גנים מדווחים על לוציפראז לתאי RAW264.7.

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג&#39;ין

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספקציה של מבני דוח לוציפרז (Luciferase) לתאי raw 2 6 4 0.7 מבלי להפעיל את התאים. דבר זה מושג תחילה על ידי קצירה של תאי raw 2 6 4 0.7 מלוח מלאי באמצעות פיפוט עדין וזריעת התאים לתוך לוח 24 בארות שעבר טיפול לתרבית רקמה. השלב השני הוא ביצוע קו-טרנספקציה של פלסמיד דוח Firefly luciferase ושל פלסמיד renilla luciferase בקרה אל תוך התאים.פלסמידים אלו חייבים להיות נקיים מאנדוטוקסינים. בשלב הבא, התאים מעוררים באמצעות הטיפולים הרצויים, ולאחר מכן מבצעים ליזיס של התאים והעברה ללוחית 96 בארות לבנה בעלת תחתית שקופה. השלב הסופי הוא מדידת פעילות של firefly luciferase ולאחר מכן מדידת פעילות luciferase כדי לחשב את יחס ה-firefly.בסופו של דבר, נעשה שימוש בשינוי הקיפול (fold change) בהשוואה לבקרת הביקורת ללא גירוי כדי להראות את השפעת הגירויים על ה-Lucifer reporter, אשר נמצא במתאם עם רמת הביטוי של הגן הנחקר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טרנספקציה רגילה למשך לילה, הוא שהתאים שעברו טרנספקציה נשמרים במצב מנוחה עם נזק מינימלי לתאים. ה-plaid DNA ששימש לטרנספקציה הוצא בעבר באמצעות ערכה מסחרית ל-maxi prep והומס מחדש ב-500 microliters של te buffer.כיוון שנוכחותו של הליפופוליסכריד (LPS), רכיב של דופן התא הבקטריאלי, מפריעה לתהליך הטרנספקציה, יש להסיר ש

transfecting-raw2647-cells-with-a-luciferase-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה...

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

שיטה זו מתארת סינתזה in vitro בתפוקה גבוהה של mRNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped), מפלסמיד ליניארי המכיל את הגן של לוסיפראז Gaussia (GLuc). ה-RNA מטוהר, וחלק מה-RNA ללא הכיסוי עובר תהליך כיסוי אנזימטי באמצעות אנזים הכיסוי של נגיף ה-Vaccinia. בשלב הסופי, ה-mRNA מוחדר (transfection) לתאי HeLa, ותעליל התרבית של התאים נבדק לפעילות לוסיפראז.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ויסות התרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח. תאים לא נגועים ונגועים בנגיף הודבקו יחד עם mRNA המקודד עבור לוציפראז גחלילית (Fluc) ו Renilla luciferase (Rluc), כאשר mRNA Fluc מכיל רצף מוביל 5' Poly(A). עם הוספת מצעים ביולומינסנטיים על תאים lysed, למדוד את האות משני luciferases כדי לזהות את היתרון התרגומי של mRNA Fluc בתאים נגועים בנגיף, המוענק על ידי רצף מוביל.

בדיקת כתב לוציפראז לחקר ויסות תרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

תאי גליומה GL261 מספקים מודל שימושי של בעלי חיים בעלי יכולת חיסונית של גליובלסטומה. מטרות פרוטוקול זה הן להדגים טכניקות מתאימות לניטור צמיחת גידול תוך גולגולתי באמצעות הדמיית ביולומינסנציה in vivo, ולאמת את התועלת של תאי GL261 שעברו שינוי בלוציפראז לחקר אימונולוגיה של גידול וגישות אימונותרפיות לטיפול בגליובלסטומה.

הדמיה פליטת אור של דגם עם מערכת חיסון בבעלי חיים לגליובלסטומה

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את התקנת תרגום mRNA ב-poxvirus תאים נגועים באמצעות מבחנה מבוסס RNA המבוסס לוציפראז כתבת הכתב. ניתן להשתמש באותו שיטת לימוד בקרת תרגום על ידי cis-אלמנטס של mrna, כולל 5 '-אזור בלתי מתורגם (utr) ו-3 '-utr. ניתן גם לבדוק מצבי שונה של ייזום תרגום באמצעות שיטה זו.

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

כאן, אנו מתארים שיטה לוויזואליזציה מבוססת תאים, לוקאליזציה תת-תאית וניתוח כמותי של מוקדים מועשרים בפולי(ADP-ריבוז) (PAR) בתאי יונקים קבועים. מבחן זה מאפשר לכימות אתרים של הפעלת PARP הנגרמת מנזק DNA, כולל זה הקשור לתיקון כריתת בסיס או תיקון שבירה חד-גדילית, בגרעינים של תאים שנחשפו לגנוטוקסין.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי

למדו שיטת טרנספקציה עדינה לתאי RAW264.7 עם גני לוציפראז מדווחים ללא הפעלת תגובות חיסוניות. פרוטוקול זה מאפשר מחקר ביולוגיה תאית ומאקרופאג'ים תוך שמירה על מצב מנוחה של התאים.

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג'ין

גלה סרטונים נוספים