Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג'ין

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר מבנים של דוחות לוציפראז לתאים גולמיים 2 6 4 0.7 מבלי להפעיל את התאים. זה מושג על ידי קציר ראשון של 2 6 4 0.7 תאים גולמיים מצלחת מלאי על ידי פיפטינג עדין וזריעה של תאים לצלחת מטופלת בתרבית רקמות של 24 בארות. השלב השני הוא להעביר את דו"ח הלוציפראז של הגחלילית של פלסמיד והבקרה הפעילה פלסמיד לוציפראז לתאים.

פלסמידים אלה צריכים להיות נטולי אנדוטוקסין. לאחר מכן, התאים מגורים עם הטיפולים הרצויים ואחריהם ליזה של תאים ומועברים לצלחת לבנה של 96 בארות עם תחתית שקופה. השלב האחרון הוא לבחון את פעילות הלוציפראז של הגחלילית, ולאחר מכן להפעיל פעילות לוציפראז כדי לחשב את היחס בין הגחלילית.

בסופו של דבר, שינוי הקפל בהשוואה לבקרה הלא מגורה משמש כדי להראות את השפעת הגירויים על מדווח לוציפר, אשר מתואם לרמת הביטוי של הגן המעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חתך לילה קונבנציונלי, הוא שתאי הטרנסקט נשמרים במצב מנוחה עם נזק מינימלי לתאים. ה-DNA המשובץ שישמש לטרנספקציה חולץ בעבר באמצעות ערכת הכנה מקסי זמינה מסחרית והושעה מחדש ב-500 מיקרוליטר של מאגר te.

מכיוון שנוכחותו של מרכיב דופן התא החיידקי ליפופוליסכריד או LPS מפריעה לטרנספקציה, יש להסיר מזהמים חיידקיים שיוריים מה- DNA במכסה אדים. הוסף 500 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פניל כלורופורם ל-DNA הפלסמיד ונער במרץ במשך 15 שניות. יש לנקוט משנה זהירות מכיוון שפנול גורם לכוויות עור חמורות.

דגרו את התערובת למשך חמש דקות של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב -13, 000 פעמים G למשך 10 דקות של העברת טמפרטורת החדר 350 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לצינור איסוף חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר TE לצינור המכיל את הפאזה האורגנית התחתונה. יש לנער נמרצות במשך 15 שניות.

צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר העבירו 350 מיקרוליטר מהשלב המימי העליון לאותו צינור איסוף של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 70 מיקרוליטר של תמיסת נתרן אצטט ומערבבים היטב.

הוסף 700 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול. מערבבים היטב ומדגרים למשך 10 דקות של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר בחום של 13, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופינאט והוסף 500 מיקרוליטר של אתנול 75% למערבולת הגלולה את הדגימות לערבב ולצנטריפוגה ב-5,000 פעמים גרם למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט.

ה- DNA של הפלסמיד נמצא בגלולה. פתח את מכסה הצינור וייבש באוויר את הכדור בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 10 דקות. הגלולה צריכה להיות שקופה.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר TE לגלולת ה-DNA וחמם ב-50 עד 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להמיס את גלולת ה-DNA. לבסוף, מדוד את ספיגת מתלה ה-DNA ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר בעזרת ספקטרומטר. כדי לחשב את ריכוז ה- DNA ולהעריך את איכותו, תאי המקרופאגים הגולמיים 2 6 4 0.7 שהוסתרו ב- DMEM הוסיפו 9% סרום עגל עוברי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ועברו כל יומיים.

במהלך כל מעבר, החלף את המדיה הישנה בנפח קטן יותר של מדיה טרייה ונתק את התאים מהצלחת על ידי זרעי פיפטינג עדינים ומתמשכים. 1.5 עד 2 מיליון תאים בתרבית רקמה של 10 סנטימטר התייחסו לצלחת כציר ביום זרעי הטרנספקציה. 200,000 תאים לבאר.

בצלחת של 24 בארות בנפח של 500 מיקרוליטר של DMEM 9% FCS דגרו על התאים למשך ארבע שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהליך זה, יש לחמם את מגיב הטרנספקציה לטמפרטורת החדר בחימום החשוך, המדיה ללא סרום ו-DMEM 9%FCS עד 37 מעלות צלזיוס. הוסף 0.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ל-50 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום בשפופרת של 1.5 מיליליטר.

הוסף שני מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה עם קצה פיפטה מתחת לפני השטח של מערבולת הנוזל למשך שש שניות. השאירו את תערובת ה- DNA המגיב בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. במהלך הדגירה של 30 דקות, הסר את המדיה מהבארות של צלחת 24 הבארות והוסף 250 מיקרוליטר DMEM טרי 9% FCS לכל אחת.

ובכן, החזירו את הצלחת לחממה לאחר 30 דקות. הוסף 250 מיקרוליטר של DMEM 9%FCS לתערובת ה-DNA המגיב וערבב היטב על ידי טיהור למעלה ולמטה, הוסף 300 מיקרוליטר מהתערובת המדוללת לכל באר של צלחת 24 הבארות למשך שעתיים עד ארבע שעות בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%. לאחר שעתיים עד ארבע שעות, הסר את תמיסת הטרנספקציה והוסף 500 מיקרוליטר של דגירה DMEM 9%FCS למשך 24 עד 48 שעות בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%.

התחל הליך זה על ידי חימום מדיה ללא סרום ו-DMEM 9%FCS עד 37 מעלות צלזיוס. הוסף 0.75 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ל-18.75 מיקרוליטר של מערבולת בינונית נטולת סרום לזמן קצר כדי לערבב ולדגור את טמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסת DNA של מיקרוגרם אחד למיליליטר לטמפרטורת החדר המדוללת של מגיב הטרנספקציה למשך 10 דקות.

במהלך הדגירה של 10 דקות, הסר מדיה מכל באר של צלחת 24 הבארות והוסף 250 מיקרוליטר DMEM טרי 9%FCS לכל באר לאחר 10 דקות. הוסף 250 מיקרוליטר של DMEM 9%FCS לתערובת ה-DNA של המגיב. מוסיפים 270 מיקרוליטר מהתערובת המדוללת לכל באר של צלחת 24 הבארות ודוגרים למשך שעתיים עד ארבע שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר שעתיים עד ארבע שעות, הסר את תמיסת הטרנספקציה והוסף 500 מיקרוליטר של DMEM 9%FCS לכל אחד. דגירה טובה במשך 24 עד 48 שעות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ואחוז פחמן דו חמצני. 24 עד 48 שעות לאחר הטרנספקציה, ניתן לגרות את התאים ולבחון את פעילות הלוציפראז.

החלף את המדיה בכל באר ב-250 שחרורים של DMEM טרי 9%FCS הוסף 50 פליטות מיקרו של LPS או LPS בתוספת הציטוקין האנטי דלקתי IL 10 בריכוזים הרצויים לבארות. החזר את הצלחת לחממת הפחמן הדו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%, עורר שעתיים עד שש שעות. לאחר מכן, הסר את תמיסת הגירוי על ידי שאיפה.

שטפו את התאים עם PBS קר כקרח והוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה פסיבי אחד לכל אחד. ובכן נדנדו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, מגרדים ומעבירים את הליזאט לצינורות של 1.5 מיליליטר ומסירים פסולת תאים על ידי צנטריפוגה פי 20, 000.

G למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 40 מיקרוליטר מהליזאט השקוף לשקוף לבן. לוח 96 באר תחתון מודד את אות לוציפר עם לומינומטר על פני כל ספקטרום האור הנראה.

על פי פרוטוקול היצרן, ניתוח ציטומטריה נמוכה של תאים שהועברו עם פלסמיד המבטא GFP גילה כי המגיב מבוסס השומנים נתן קצב טרנספקציה של כ-25% בעוד שהטרנספקציה המבוססת על חלבון פוליאמיד הביאה לשיעור של כ-5%ההבדל ביעילות הטרנספקציה נצפה גם באותות לוציפראז בתאים שהועברו עם אזור המקדם של I capa b Zeta. הוספת LPS הגדילה את אות לוציפראז הגחלילית. בדרך כלל, התאים עוברים טרנספטציה משותפת עם פלסמיד בקרה המכיל את הגן לוציפראז הראן ואותות לוציפראז הגחלילית מנורמלים לאות הלוציפראז הרץ.

השוואת האותות המנורמלים בין דגימות לא מטופלות ומטופלות הראתה כי LPS מווסת, הפעילות של מדווח המקדם ו-IL 10 מעכבת את השפעת LPS. השוואת משך זמן המנוחה בין טרנספקציה לגירוי גילתה שאותות לוציפראז פוחתים עם הזמן וזה רק השפיע על פירוש הנתונים. כאשר נעשה שימוש במגיב טרנספקציה מבוסס חלבון פולי אמין כדי להעריך את ההשפעה של כל שיטת טרנספקציה על תאי מוות תאי נצבעו בנספחין חמש ופרופידיום יודיד ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה בלבד.

הטרנספקציה המבוססת על שומנים הגדילה מעט את שיעור הנספח בחמישה תאים חיוביים. הבלטה חיסונית הראתה שהטרנספקציה המבוססת על שומנים הגדילה מעט את שיעור חלבון פולי ריבוז DP שסוע. בעוד שהטרנספקציה המבוססת על חלבון פולי לא.

למרות המספרים הגבוהים של תאים אפופטוטיים, המורפולוגיה של התאים על ידי מיקרוסקופ אור לא השתנתה. חשוב מכך, התגובה הביולוגית של התאים הטרנספטנטיים מבוססי השומנים נותרה זהה לזו של התאים שלא נכרתו, שניהם יצרו כמויות דומות של TNF אלפא בתגובה ל-LPS ועוכבו על ידי הוספת IL 10. לא נוצר TNF אלפא כאשר התאים לא היו מגורים, מה שמרמז על כך שהתאים נשארים נאיביים לאחר הטרנספקציה.

לאחר שטיפת הסרטון הזה, למשתמש יש הבנה טובה כיצד לתרגם 2 6 4 0.7 תאים גולמיים עם לוציפר שדווח על פלזמות בצורה זעיר פולשנית שאינה משנה את התגובה המקורית של התאים.