משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר ₂ כלי- ₂ Domains אבץ האצבע

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד להשתמש בתחומי אצבעות אבץ כדי להעביר חלבונים פונקציונליים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק לתאי יונקים. זה מושג על ידי יצירת פלסמיד ביטוי המכיל את החלבון הפלואורסצנטי הירוק אזמרגד MGFP המותך באופן תרגומי לתחומי אצבעות אבץ. השלב השני הוא לבטא את חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי בחיידקים.

לאחר מכן, תאי החיידקים עוברים ליזה וחלבון ההיתוך הפלואורסצנטי מטוהרים. השלב האחרון הוא לדגור על תאי יונקים עם חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי המטוהר כדי לאפשר ספיגה. בסופו של דבר, ניתן לכמת את הקרינה של תאים מטופלים על ידי זרימה ציטומטרית כדי לקבוע את היעילות של אספקת חלבון היתוך לתאים.

היתרון העיקרי של גנב או תחום העברת חלבון אחר כמו פפטיד הדוק שמקורו ב-HIV או פולי ארגינין, הוא שהוא יכול להקל על רמה גבוהה של אספקה ציטוזולית מבלי לפגוע בפעילות המטען האנזימטי בשדה. כדי להתחיל ב-PCR, הגבירו את רצף ה-GFP או ה-MGFP האמרלד מפלסמיד על פי פרוטוקול הטקסט, טהרו את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת מיצוי ג'ל ולאחר מכן כמתו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, השג וקטור ביטוי PET 28 המכיל את רצף האלנין.

החלפתי שתי אצבעות, אצבע אבץ או שני תחומי FZ, וקטור עיכול ומוצר MG F-P-P-C-R באנזימי הגבלה XMA אחד ו-SAC אחד תוך שימוש ב-10 יחידות אנזים למיקרוגרם DNA ודגירה על העיכול במשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס. טהר את שברי ה-DNA על ידי מיצוי ג'ל ומדוד את ריכוזי הווקטור ותוצר MG F-P-P-C-R. בעזרת ספקטרופוטומטר, שלב את תוצר MG F-P-P-C-R ו-50 עד 100 ננוגרם של הווקטור בשפופרת בודדת ביחס של 6 ל-1 הכנסה לווקטור מולארי.

לאחר מכן הוסף יחידה אחת של T ארבע DNA ליגאז ודגר את התגובה בשעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להפוך חיידקים עם הפלסמיד הקשור. להפשיר. 50 מיקרוליטר של תאי אי קולי בעלי יכולת כימית על קרח. לאחר מכן מערבבים בעדינות את התאים עם 100 עד 20 ננוגרם של ה-DNA הקשור ודוגרים את התאים עם ה-DNA על הקרח למשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, שוק חום מחשמל את התאים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. הוסף שני מיליליטר של מדיום SOC לצינור ואפשר לתאים להתאושש למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול כדי לבחור טרנספורמציה. מורחים 100 מיקרוליטר מהתרבית על צלחות אגר LB המכילות 50 מיקרוגרם למיליליטר של פחית מיצין ודוגרים על הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת.

חסנו תרבית של שישה מיליליטר של LB המכילה 50 מיקרוגרם למיליליטר של פחית מיצין עם מושבה מבודדת מצלחת הלילה. דגרו על התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת, אספו והכינו מיני את התאים כדי לבודד את הפלסמיד ולאחר מכן אשרו את הפלסמיד על ידי ריצוף עם הפריימר.

עבור מקדם ה-T שבע, הפלסמיד צריך להכיל היתוך תרגומי טרמינלי N של שני תחומי ה-FZ ל-MGFP. כדי להתחיל בטיהור חלבון. ראשית טרנספורמציה BL 21 משווה תאים עם 100 ננוגרם של הפלסמיד המטוהר.

בחר עבור טרנספורמטורים על אגר LB המכיל פחית מיצין למחרת לחסן תרבית של 10 מיליליטר של מדיום LB המכיל פחית מיצין עם מושבה אחת מצלחת הלילה ולדגור את התרבית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול, לדלל את כל מושבת הלילה לליטר אחד של מדיום LB, בתוספת פחית מיצין 0.2% גלוקוז ו-100 מיקרו-מולרי אבץ כלוריד. דגרו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול עד שהיא מגיעה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.8 ולאחר מכן הוסיפו IPTG לריכוז סופי של שתי מילי-טוחנות כדי לגרום לביטוי. לאחר שש שעות של צנטריפוגת אינדוקציה, התרבית בטמפרטורה של 5,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקצור את התאים.

השעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של מאגר ליזה, ולאחר מכן תאי ליזה על קרח עם שמש באמצעות תפוקת הספק של 50% ומחזור של חמש שניות על עשר שניות למשך ארבע דקות. לאחר מכן, תאי צנטריפוגה ליזאט ב-25,000 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור איסוף חדש על קרח. כדי לטהר את החלבון, טען את הסופרנטנט על עמוד שהיה ארוז מראש במיליליטר אחד של תמיסת חומצה אצטית ניקל חנקתית.

לאחר העברת הסופרנטנט דרך העמוד, יש לשטוף את השרף עם 20 מיליליטר מאגר כביסה. הסר את החלבון מהעמודה עם חמישה מיליליטר של מאגר פליטה, ולאחר מכן העביר את התמיסה לצינורות דיאליזה, דיאליזה של החלבון ומאגר האחסון למשך הלילה לאחר הדיאליזה. השתמש ברכז ספין כדי לרכז את החלבון לפחות 40 מיקרומולר על ידי צנטריפוגה 3000 פעמים G למשך שעה.

קבע את ריכוז החלבון והטוהר כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט לאחסון. אקווה 200 מיקרוליטר של החלבון בצינורות פוגה של 1.5 מיליליטר ומכסים את הצינור בנייר כסף כדי להגן על חלבוני היתוך MGFP מפני פוטוהלבנה. לאחר מכן הבזק, הקפיאו את החלבון בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס כדי להתכונן להעברת חלבון תחילה את הבארות של צלחת 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של תמיסה של 50 מיקרוגרם למיליליטר.

פוליליזין למשך 30 עד 60 דקות בחום של 25 מעלות צלזיוס. שאפו את התמיסה מהבארות לפני זריעת תרבית התאים. לרפא תאים ב-DMM המכילים 10% FBS ו-1% אנטי-מיקרוביוטיקה אנטי-מיקוטית ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני.

קצרו את התאים וזרעו אותם על צלחת 24 הבארות בצפיפות של 200,000 תאים לבאר. לאחר מכן הניחו צלחת של 24 בארות בחממה לאחר כ -24 שעות דגירה כאשר התאים הם 80 עד 90% מתלכדים. שאפו את המדיום מכל באר ושטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר של מדיום ללא סרום או SFM.

הוסף 250 מיקרוליטר של SFM המכילים שני חלבון Z-M-G-F-P מיקרו-מולרי ו-100 אבץ כלוריד מיקרומולרי לכל באר ולאחר מכן דגר על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, שאפו את המדיום מהבארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של סידן ומגנזיום ללא דוקוס פוספט מלח הידוע בשם DPBS בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר הפרין. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין EDTA לבארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי לנתק את התאים מהצלחת.

העבירו את התאים המנותקים לצינור וצנטריפוגה חדשים ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-500 מיליליטר של DPBS בתוספת 1%FBS מודדים את עוצמת הקרינה הממוצעת של הדגימה על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות ערוץ הפייט כפי שתואר קודם לכן. התאם את הפיזור קדימה והצד כדי למקם את אוכלוסיית העניין על הסקאלה.

לאחר מכן, השתמש בשער מוגדר כדי לנתח את הבקרה ואת דגימות הבדיקה. אסוף 10,000 פתחי אוורור חיים לכל דגימה והשתמש בתוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה כדי לעבד את הנתונים. לנרמל את עוצמת הפלואורסצנט של תאים שטופלו בחלבון לתאים שטופלו בסרום הבקרה.

חלבוני היתוך של Zif MGFP הופקו באי קולי, טוהרו ונותחו על ידי דף SDS. תוצאות אלה מראות כי חלבון ההיתוך של שתי האצבעות ZIF MG FP טוהר להומוגניות של יותר מ-95%. כאשר תאי HELO טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של חלבון ההיתוך ZIFF MG FP.

הם הראו עלייה תלוית מינון בעוצמת הקרינה הממוצעת כפי שנמדדה על ידי זרימה ציטומטרית, טיפולים עוקבים עם חלבון היתוך Z MG FP בריכוז של שני מיקרומולריים הביאו לכמעט 100% מהתאים עם פלואורסצנטיות MGFP. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתחומי הטרנזקציות של חלבון הגנב כדי להעביר חלבונים פונקציונליים לתאים שלי.