Name: משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר 2 כלי- 2 Domains אבץ האצבע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למד כיצד להשתמש בדומייני אצבע אבץ להובלת חלבונים פונקציונליים לתאי יונקים. שיטה זו כוללת ייצור פלסמיד, ביטוי בחיידקים, טיהור ודגימת קליטה בתאי HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (DP1CA174426 לקרלוס פ Barbas) ואוניברסיטת ShanghaiTech, שנחאי, סין (לJL). גרפיקה מולקולרית היו שנוצרה באמצעות PyMOL.

1. שיבוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תחומים זיף שתי אצבעות-הוחלף אלאנין שכבר תת-שובטו לתוך מערכת וקטור ביטוי PET-28 והנם זמינים לפי בקשה (PET-2F-זיף). 34 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר EmGFP מפלסמיד Emerald-pBAD עם פריימרים 5 &#39;XmaI-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; Xma אני אתר מודגש) ו 3 &#39;SACI-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 &quot; ; Sac אני אתר מודגש). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 ng של DNA תבנית, 10 μl של חיץ 10x פולימראז, 1 יח &#39;(U) של פולימראז תקי DNA, 0.2 מ&quot;מ כל אחד dNTP ו -0.2 מיקרומטר של כל צבע יסוד בפתרון 100 μl עם הנפח שנותר מורכבים ממים מזוקקים / deionized . השתמש בתנאי הרכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; C ° 72 במשך 10 דקות. לטהר את מוצר ה- PCR על ידי extracti ג&#39;לובלקבוע את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מדידת Abs 260 x 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Digest PET-2F-זיף ולהוסיף קידוד EmGFP עם הגבלת אנזימי Xma אני וSac אני במאגר מומלץ ל3 שעות על 37 מעלות צלזיוס באמצעות 10 U של אנזים לכל 1 מיקרוגרם של ה- DNA. דמיין DNA על ידי אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל באמצעות צבע intercalating פלורסנט, כגון ברומיד ethidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- DNA מתעכל על ידי ערכת חילוץ ג&#39;ל ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר מדידת Abs 260 x 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור DNA EmGFP הקידוד המטוהרים ל50-100 ng של PET-2F-זיף באמצעות 1 U של אנזים T4 DNA לשעות לפחות 1 ב RT. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע את תגובת קשירה באמצעות 6: יחס טוחנת להכניס לוקטור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי 50 μl של כל XL-1 תאי coli Escherichia הכחול כימי מוסמכים על קרח ומערבבים בעדינות עם 10-20 ng של ligated PET-2F-הזיף-EmGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על קרח 30 דקות. הלם חום את התערובת על 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות ולשחזר את התאים ב 2 מיליליטר של מרק הסופר אופטימלי עם דיכוי Catabolite (SOC) עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות תרבות התאוששות 100 μl על מרק lysogeny (LB) צלחת אגר עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לחסן 6 מיליליטר של סופר מרק (SB) או תרבות LB המכילה 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin עם מושבה אחת מצלחת LB אגר ותרבות O / N על 37 מעלות צלזיוס. הערה: המושבה PCR באמצעות פריימרים 5 &#39;XmaI-EmGFP ו 3&#39; SACI-EmGFP יכול לשמש כדי לזהות שיבוטים חיוביים לפני miniprep. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר PET-2F-הזיף-EmGFP ידי miniprep ולאשר פלסמיד על ידי רצפי DNA באמצעות אמרגן T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &quot;). </li></ol> 2. ביטוי וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 50 μl של כימי המוסמך BL21 E. coli תאים על קרח ומערבבים בעדינות עם של PET-2F-הזיף-EmGFP pl 100 ngasmid. להפוך כמתואר בשלבים 1.7-1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לחסן 10 מיליליטר של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin עם מושבה אחת ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לדלל את 10 מיליליטר של O / תרבות N לתוך 1 ליטר של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, גלוקוז 0.2% ו -100 מיקרומטר ZnCl 2. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.8 ולגרום לביטוי חלבון עם 2 מ&quot;מ איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). לאחר 6 שעות של צמיחה על 37 מעלות צלזיוס, תאי קציר על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 10 דקות ב 4 ° C. הערה: תנאי אינדוקציה הם משתנים מאוד ותלויים ביציבות של החלבונים לידי ביטוי. לפקח על OD 600 כל 30 דקות עד OD 600 של 0.8 הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ תמוגה (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ &#39;dithiothreitol M (DTT), 1 מ&quot;מ MgCl 2, פלואוריד 1 מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF) ו -10 מ&quot;מ imidazole, pH 8.0). Lyse התאים על קרח על ידי sonication עם ההגדרה הבאה: 50% תפוקת כוח, זמן תהליך 4 דקות עם 5 שניות על / 10 שניות את מרווחים. הימנע מחימום יתר הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא ב25,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לתוך צינור איסוף טרי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע את כל השלבים ב 4 מעלות צלזיוס הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את supernatant דרך עמודה מראש ארוז עם 1 מיליליטר של תרחיף Ni-נ.ת.ע equilibrated. לשטוף את השרף עם 20 מיליליטר של חיץ לשטוף (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ&quot;מ DTT, 1 מ&quot;מ MgCl imidazole 2 ו -30 מ&quot;מ, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון עם 5 מיליליטר של חיץ elution (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ&quot;מ DTT, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו -300 מ&quot;מ imidazole, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר להחליף חלבון eluted עם חיץ אחסון (50 מ&quot;מטריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ&quot;מ DTT, 1 גליצרול מ&quot;מ MgCl 2 ו -10%, pH 8.0) ולרכז את החלבון לפחות 40 מיקרומטר באמצעות concentrator ספין על ידי צנטריפוגה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון על ידי BCA או assay ברדפורד. לערבב 2 μl של חלבונים מטוהרים עם 2 μl 2 × צבע טעינת SDS-PAGE, רתיחה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לפתור על 4% -20% טריס-גליצין SDS-PAGE להעריך טוהר חלבון (איור 2). </li></ol> 3. חלבון אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot החלבון המרוכז, פלאש הקפאה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לחלבוני היתוך EmGFP, לכסות את הצינור עם נייר אלומיניום על מנת להגן על החלבון מן האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מהקפאה והפשרה של פתרון החלבון חוזרים ונשנים. הערה: חלבונים התמזגו-זיף הם יציבים בתנאים אלה במשך לפחות 1 חודש. או אחסון לא ראוי חודש&gt; 4 עשוי להוביללמשקעי חלבון או photobleaching של EmGFP. </li></ol> התמרה 4. חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תאי הלה במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכיל 10% (v / v) בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% לאנטיביוטיקה antimycotic על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified באופן מלא עם 5% CO 2. הערה: תאי passaged יותר מ -30 פעמים אינן מומלצים לתמרת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל צלחת 24 גם עם 500 μl 50 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי ליזין למשך 30 עד 60 דקות במהירות של 25 ° C. תאי זרע על צלחת 24 גם בצפיפות של 2 × 10 5 תאים לכל טוב. בגיל 24 שעות לאחר זריעה, או פעם תאים הם בין 80% -90% ומחוברות, להסיר תקשורת מכל טוב ולשטוף עם 500 μl של סרום ללא DMEM המחומם מראש (SFM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה טוב, להוסיף 250 μl של SFM המכיל 2 מיקרומטר חלבון הזיף-EmGFP של 100 מיקרומטר ZnCl 2. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: תחומים זיף להיכנס לתאי יחסי ציבורimarily דרך macropinocytosis, 34 שהוא מנגנון אנרגיה תלויה. לכן, תאים חייבים להיות טופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך הפנמת חלבון יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהתאים ולשטוף שלוש פעמים עם 500 μl של סידן ומגנזיום ללא פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco (DPBS) בתוספת 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר של הפרין. הערה: הפרין יש צורך להסיר חלבון מאוגד משטח שעשוי לסבך את הניתוח במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים (אופציונליים) חזור על עד שלוש פעמים למסירה משופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים שטופלו מייד לאחר הפרין לשטוף על ידי עיכול עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. להשעות מחדש תאים מנותקים ב 0.5 מיליליטר של DPBS בתוספת 1% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את עוצמת הקרינה של כל דגימה על ידי זרימת cytometry 35 באמצעות ערוץ isothiocyanate והעמסת (FITC) (איור 3). התאם את הפיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC) למקום האוכלוסייהריבית על קנה מידה, על מנת להבטיח שאוכלוסיות עם מאפיינים שונים נפתרות אחד מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10,000 אירועים חיים עבור כל דגימה ולנתח את הנתונים באמצעות זרימת cytometry ניתוח נתונים תוכנה. 36 הקרינה לנרמל מתאי הלה שטופלו בזיף-EmGFP לאלה תאים שטופלו רק עם SFM. </li></ol>

<ol><li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li>
<li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+cell+delivery%3A+application+in+protein+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li>
<li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li>
<li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li>
<li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li>
<li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li>
<li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li>
<li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li>
<li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li>
<li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li>
<li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li>
<li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li>
<li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li>
<li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755(2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li>
<li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li>
<li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li>
<li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li>
<li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li>
<li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li>
<li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+zinc+finger+proteins%3A+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li>
<li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li>
<li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li>
<li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li>
<li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Aart%2C+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide%2C+bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד למסירת החלבון השתמשה בתחומי תא חדיר אבץ-אצבע (ZIF) מוצג. תחום הזיף אינו מפחית את הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו 34; מאפשר לייצור והטיהור של חלבונים בתשואות כמעט זהות לאלו שנצפו עם חלבון ללא שינוי; ויכול להעביר חלבונים ואנזימים למגוון רחב של סוגי תאים עם יעילות העולה על מערכות חודרות תאים מסורתיים פפטיד או חלבון תחום התמרה. יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על הפוטנציאל הרחב של תחומים זיף לתיווך משלוח חלבון ישיר לתאים למגוון רחב של יישומים. <p c...

מאוד אסטרטגיות אספקת החלבון יעילה ותכליתיות הן קריטיות למחקר בסיסי ויישומים רבים טיפוליים. המשלוח הישיר של חלבונים מטוהרים לתאים מייצג את אחד מהשיטות הבטוחות ביותר והקלה ביותר להשגת מטרה זו. בניגוד ל1,2 אסטרטגיות המסתמכות על ביטוי גנים מחומצות גרעין, 3-5 משלוח החלבון אינו מהווה סיכון של mutagenesis insertional, אינו תלוי ב שעתוק / מכונות תרגום וסלולרי מאפשר לתוקף באופן מיידי. עם זאת, חוסר שיטות פשוטות ולהכליל למעניקים פעילות חודרת תאים על חלבונים מבלבל באופן שגרתי הכניסה הישירה שלהם לתאים. שיטות קיימים להקלת משלוח חלבון תאית המבוססות על השימוש באופן טבעי 6-8 או תוכנן פפטידים חודרים-תא, 9-12 תחומים התמרה לעייף, ו13,14 חלקיקים 15 ויפוזומים, 16 חלקיקים כמו וירוס-17,18 </sup&gt; וחומרים פולימריים microsphere. 19 למרבה הצער, רבים מן הגישות הללו הם הקשו על ידי שיעורים נמוכים סלולריים ספיגה, 20,21 יציבות עניה, 22 סגוליות שלא במתכוון תא מסוג, 23 נכסי בריחת endosomal הנמוך 24 ורעילות. 25 בנוסף, רב חלבון טכנולוגיות התמרה להפחית את הפעילות הביולוגית של החלבונים נמסרו. 14 המעבדה שלנו הראתה כי nuclease אבץ-אצבע בעבר חלבונים (ZFN) - הגבלת chimeric endonucleases בהיקף של 2 כלי- 2 חלבון לתכנות Cys אבץ-אצבע ה- DNA מחייבת ותחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI 26-28 - מטבעם תאי ד&#39; חדיר. 29 פעילות חודרת תאים מפתיע זה הוצגה להיות רכוש מהותי של תחום אבץ-אצבע אישית מעוצב, פלטפורמת ה- DNA מחייב שהתפתחה ככלי רב עוצמה למטרת הגנום enההנדסה באמריקה, 30-32 ונחשבת לתוצאה של קבוצת הכוכבים של שש שאריות מטען חשמליות חיוביות על פני החלבון. ואכן, כמה חלבוני קושרי DNA, כוללים ג-ג&#39;ון וN-DEK הוכחו יש יכולת מולדת לחצות קרום תא. 33 לאחרונה, המעבדה שלנו התרחבה על תוצאות אלו, והראו שהפעילות חודרת תאים של zinc- תחומים אצבע (ZIF) יכולים להיות ממונפים למסירת חלבון תאית. היתוך גנטי של שני תחומים זיף אחת או שתי אצבעות למטען חלבון מסוים הוביל לספיגה יעילה שעלו על מערכות רבות קונבנציונליות חודר תאי פפטיד משלוח. 34 בעיקר, משלוח בתיווך זיף לא התפשר הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו והקל רמות גבוהות של משלוח cytosolic. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה להדגים את הפוטנציאל של תחום הזיף להקלה על ההעברה היעילה וקלילה של חלבונים, וסוגים שעלולים להיות יותר מגוונים של מאקרומולקולות, לתאים. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט על כיצד ליישם טכנולוגית זיף למסירת חלבון בתאי יונקים מוצג. בנינו חבילה של עבר אחד, שתיים, שלוש, ארבעה, חמש ושש-אצבע תחומים זיף שחסר את היכולת לקשור DNA, עקב החלפה של כל אחד משאריות ה- DNA מחייבת α-סליל, אבל הם מסוגלים לספק חלבונים לתאים 34 (איור 1). הייצור והתמרה של Emerald GFP (EmGFP) לתאי הלה באמצעות תחום זיף שתי אצבעות מתוארת. פרוטוקול זה הוא הרחבה לכמעט כל חלבון מסוגל ביטוי מסיס בEscherichia coli וכמעט כל סוג של תאי יונקים. תוצאות צפויות מסופקות ואסטרטגיות למקסם את הביצועים של מערכת זו הם דנו גם.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>הרחב מערכת PCR בנאמנות גבוהה</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine מיני ג'ל חלבון, 1.5 מ"מ, 10 בארות</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>פי 2 Laemmli מאגר דגימה</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) מוכשר E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>אבץ כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>טריס בייס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA שרף אגרוז</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon אולטרה-15 יחידות סינון צנטריפוגליות</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים בסרום בקר עוברי</td><td></td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייה&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה שטוחה 24 בארות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ספקטרופוטומטר ND-1000&nbsp;</td>ערכת טיהור <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR QIAGEN</td><td></td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ערכת מיצוי ג'ל</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי cys cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; domains אבץ האצבע

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

בשל המודולריות שלהם ויכולתם להיות מתוכנתים מחדש לזהות מגוון רחב של רצפי DNA, תחומי קשירת ה-DNA של Cys2-His 2-His 2 התגלו ככלים שימושיים להנדסת גנום ממוקדת. כמו חלבונים רבים אחרים קושרי DNA, גם לאצבעות אבץ יש את היכולת המולדת לחצות את קרומי התאים. לאחרונה הוכחנו כי ניתן למנף את חדירות התאים הפנימית הזו לאספקת חלבון תוך תאי. היתוך גנטי של מוטיבים של אצבעות אבץ מוביל להובלה יעילה של מטען חלבון ואנזים למגוון רחב של סוגי תאי יונקים. בניגוד לטכנולוגיות אחרות של העברת חלבונים, אספקה דרך תחומי אצבע אבץ אינה מעכבת את פעילות האנזים ומובילה לרמות גבוהות של אספקה ציטוזולית. כאן מוצג פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ליישום טכנולוגיית אצבע אבץ להעברת חלבון לתאי יונקים. מודגשים צעדים מרכזיים להשגת רמות גבוהות של אספקה תוך-תאית בתיווך אצבע אבץ ונדונות אסטרטגיות למקסום הביצועים של מערכת זו.

יכולים לבוא לידי ביטוי חלבוני היתוך שתי אצבעות הזיף-EmGFP בE. coli עם&gt; ההומוגניות 95% ותשואות גבוהות (&gt; 25 מ&quot;ג / מיליליטר) (איור 2). באופן כללי, אחד ושתי אצבעות ניתן לייצר חלבוני היתוך זיף בכמויות כמעט זהות לאלו של חלבון ללא שינוי wild-type. עם זאת, בחלק ממקרים, חלבוני היתוך זיף חמישה ושש-אצבע אינם מסוגלים לייצר תשואות גבוהות מספיק עבור יישומים במורד הזרם. יישום ישיר של שתי אצ...

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד להשתמש בדומייני אבץ (zinc finger domains) כדי להחדיר חלבונים פונקציונליים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, לתאי יונקים. הדבר משיג תחילה על ידי יצירת פלסמיד ביטוי המכיל את החלבון הפלואורסצנטי הירוק MGFP המחובר תרגומית לדומייני אבץ. השלב השני הוא ביטוי של חלבון הפיוזיונ פלואורסצנטי בחיידקים.בשלב הבא, תאיי הבקטריות עוברות ליזיס וחלבון היתוך פלואורסצנטי מופק. השלב הסופי הוא דגירה של תאי יונקים עם חלבון ההיתוך הפלואורסצנטי המופק כדי לאפשר ספיגה. לבסוף, ניתן לכמת את הפלואורסצנציה של התאים שעובדו באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את יעילות הובלת חלבון ההיתוך אל תוך התאים.היתרון המרכזי של thief או דומיינים אחרים להעברת חלבונים, כגון פפטידים הדוקים המופקים מ-HIV או פולי-ארגינין, הוא היכולת להקל על העברה ברמה גבוהה לציטוזול מבלי לפגוע בפעילות של המטען האנזימטי. כדי להתחיל ב-PCR, הגבירו את רצף ה-emerald GFP או ה-MGFP מתוך פלסמיד בהתאם לפרוטוקול הכתוב, טהרו את תוצר ה-PCR באמצעות ערכה להפקת ג'ל ולאחר מכן כממו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, השגיגו וקטור ביטוי PET 28 המכיל את הרצף של alanine.בצעו החלפה של שני אצבעות, אצבע אבץ או שני דומיינים מסוג FZ, בוקטור העיכול ובמוצר ה-MG F-P-P-C-R באמצעות אנזימי ההגבלה XMA ו-SAC, תוך שימוש ב-10 יחידות אנזים לכל מיקרוגרם של DNA, והדגירו את תוצרי העיכול במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 °C. טהרו את מקטעי ה-DNA באמצעות מיצוי ג'ל (gel extraction) ומדדו את הריכוזים של הוקטור ושל מוצר ה-MG F-P-P-C-R. באמצעות ספקטרופוטומטר, ערבבו את מוצר ה-MG F-P-P-C-R ו-50 עד 100 ננוגרמים מהוקטור בתוך מבחנה אחת, ביחס מולרי של 6:1 בין המאסף (insert) לוקטור.לאחר מכן, הוסיפו יחידה אחת של T4 DNA ligase והדריכו את התגובה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להפוך את החיידקים עם הפלסמיד המקושר. הפשירו מניה של 50 µL של תאי e coli בעלי כשירות כימית על קרח. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את התאים עם 100 עד 20 ng של ה-DNA המקושר והדריכו את התאים עם ה-DNA על קרח למשך 30 דקות.לאחר הדגירה, בצעו הלם תרמי לתאים בטמפרטורה של 42 °C למשך 90 שניות. הוסיפו למבחנה 2 mL של מצע SOC ואפשרו לתאים להתאושש במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור, כדי לבחור את התאים שעברו טרנספורמציה. פזרו 100 µL מהתרבית על צלחות LB agar המכילות 50 µg/mL של kanamycin והדגירו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C למחרת.בצעו אינוקולציה לתרבית של 6 mL של LB המכיל 50 µg/mL של kanamycin עם מושבה מבודדת מהצלחית של הלילה הקודם. דגרו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור. למחרת, אספו את התאים ובצעו mini prep כדי לבודד את הפלסמיד, ולאחר מכן אשרו את הפלסמיד באמצעות ריצוף עם הפרימר.עבור מקדם T7, הפלסמיד צריך להכיל איחוי תרגומי (translational fusion) של שני דומייני FZ לקצה ה-N של MGFP. כדי להתחיל בטיהור החלבון, ראשית בצע טרנספורמציה לתאי BL 21 equalize עם 100 nanograms של הפלסמיד המטוהר.בחר את הטרנספורמנטים על מצע LB agar המכיל kanamycin. למחרת, תבצע אינוקולציה של תרבית של 10 milliliters של מצע LB המכיל kanamycin עם מושבה בודדת מהצלחת הלילה, והדגר את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור. דלל את כל תרבית הלילה לתוך ליטר אחד של מצע LB, בתוספת kanamycin, 0.2% glucose ו-100 µM zinc chloride. הדגר את התרבית בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור עד שתגיע לצפיפות אופטית (OD) ב-600 nm של 0.8, ולאחר מכן הוסף IPTG לריכוז סופי של 2 mM כדי להשרות את הביטוי. לאחר שש שעות של השראה, סבב את התרבית בצנטריפוגה ב-5,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לקצור את התאים.שחזר את משקע התאים בחמישה מיליליטר של באפר ליזיס, ולאחר מכן בצע ליזיס לתאים על קרח באמצעות סונקציה בהספק של 50% ובמחזור של חמישה שניות פעילות ועשר שניות מנוחה למשך ארבע דקות. לאחר מכן, סבב במערך צנטריפוגה את ליזיס התאים ב-25,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, והעבר את supernatant לפח תجميع חדש על קרח. כדי לטהר את החלבון, העמס את ה-supernatant על עמודה שנמלאה מראש במיליליטר אחד של slurry של חומצה ניטריק-אצטית עם ניקל.לאחר העברת הנוזל העליון דרך העמודה, שטפו את הסורבנט ב-20 milliliters של בופר שטיפה. אלוטו את החלבון מהעמודה באמצעות five milliliters של בופר אלוציה, ולאחר מכן העבירו את התמיסה לשקיקי דיאליזה, בצעו דיאליזה לחלבון ולבופר האחסון למשך לילה. השתמשו במרכז חלבונים בסיבוב (spin concentrator) כדי לרכז את החלבון לריכוז של לפחות 40 micromolar באמצעות צנטריפוגה ב-3000 ×g למשך שעה אחת.קבעו את ריכוז החלבון ואת רמת הטוהר כפי שמוצג בפרוטוקול הטקסט לצורך אחסון. חלקו 200 µL מהחלבון למבחנות סנטריפוגה של 1.5 mL ועטפו את המבחנה בנייר אלומיניום כדי להגן על חלבוני MGFP fusion מפני פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית). לאחר מכן, בצעו הקפאה מהירה (flash freeze) של החלבון בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- °C. להכנה לקראת טרנסדוקציית חלבון, בצעו קדם-טיפול (preco) בבארים של פלטת 24 בארים באמצעות 500 µL של תמיסה בריכוז 50 µg/mL.פוליליזין למשך 30 עד 60 דקות ב-25 degrees Celsius. שאבו את התמיסה מהבארים לפני זריעת תרבית התאים. דגרו את התאים ב-DMM המכיל 10%FBS ו-1%antibiotic anti mycotic ב-37 degrees Celsius באינקובטור לח עם 5%carbon dioxide.קצרו את התאים והעבירו אותם לפלטת 24 בארות בצפיפות של 200,000 תאים לבאר. לאחר מכן, הכניסו את פלטת 24 הבארות לאינקובטור למשך כ-24 שעות של דגירה, עד שהתאים יגיעו ל-80% עד 90% התמזגות (confluency). שאבו את המצע מכל בארה ושטפו את התאים עם 500 µL של מצע נטול סרום (SFM) שחומם מראש.הוסיפו 250 µL של SFM המכיל 2 µM של חלבון Z-M-G-F-P ו-100 µM של zinc chloride לכל באר, ולאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, שאבו את המדיום מהבארים ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 500 µL של תמיסת DPBS (docos phosphate buffered saline) נטולת סידן ומגנזיום, המועשרת ב-0.5 mg/mL של heparin. לאחר מכן, הוסיפו לבארי 200 µL של 0.05% trypsin EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שתי דקות כדי לנתק את התאים מהפלטה.העבירו את התאים שהסתרו למבחנה חדשה וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, השעיו שוב את התאים ב-500 milliliters של DPBS מועשיר ב-1%FBS ומדדו את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של הדגימה באמצעות ציטומטריית זרימה בערוץ fite כפי שתיאור קודם לכן. כווןנו את ה-forward scatter וה-side scatter כדי למקם את האוכלוסייה הרלוונטית על הסקאלה.בשלב הבא, השתמשו ב-gating מוגדר כדי לנתח את דגימות הביקורת ואת דגימות הבדיקה. אספו 10,000 תאי vent חיים לכל דגימה והשתמשו בתוכנה לניתוח פלוו-ציטומטריה (flow cytometry) לעיבוד הנתונים. נרמלו את עוצמת הפלואורסצנציה של תאים שטופלו בחלבון ביחס לתאים שטופלו בסרום ביקורת.חלבונים מאוחדים של Zif MGFP הופקו ב-e coli, טוהרו ונולחו באמצעות SDS page. תוצאות אלו מראות כי החלבון המאוחד ZIF MG FP בעל שתי האצבעות טוהר לרמה של הומוגניות הגבוהה מ-95%. כאשר תאי helo טופלו בריכוזים עולים של החלבון המאוחד ZIFF MG FP.הם הראו עלייה תלויית מינון בעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת כפי שנמדדה בציטומטריה זרימתית; טיפולים עוקבים בחלבון היתוך Z MG FP בריכוז של 2 µM הביאו לכך שכמעט 100% מהתאים הציגו פלואורסצנציית MGFP. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בדומיינים של העברה של חלבון thief כדי להחדיר חלבונים פונקציונליים לתוך תאי שריר.

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

אנו מתארים כאן מערכת ביטוי גרנזים חסכונית המשתמשת בתאי HEK293T המייצרת תפוקות גבוהות של פרוטאז טהור, מסוכרר לחלוטין ופעיל אנזימטית.

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

אנו מתארים כיצד להעביר חלבונים ומולקולות קטנות אטומות לתאים לתאי יונקים מתורבתים על ידי פרוטוקול דגירה משותפת פשוט עם מגיב הגורם לאברונים אנדוציטיים לדלוף.

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

זהו פרוטוקול מהיר וחסכוני לייצור חלבוני יונקים מופרשים ומסוכררים וטיהור חד-שלבי לאחר מכן עם תפוקות מספיקות של חלבון הומוגני לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומחקרים ביופיזיקליים אחרים.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

לשיטות הקיימות לשינוי צמחים יש ישימות מוגבלת. הטכנולוגיה החדשנית שמקורה בפפטיד המוצעת כאן מבטיחה הן פשטות והן יעילות בהחדרת חלבון או גנים אקסוגניים לתאים התוך-תאיים הרצויים של צמחים שלמים.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

זהו פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין עם החידוש של שילוב רצפים חודר לתא. היתרון העיקרי הוא הרצף היעד מודגרת עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות תתרחש בתוך ההקשר הסלולר.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

למד כיצד להשתמש בדומייני אצבע אבץ להובלת חלבונים פונקציונליים לתאי יונקים. שיטה זו כוללת ייצור פלסמיד, ביטוי בחיידקים, טיהור ודגימת קליטה בתאי HeLa.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר

גלה סרטונים נוספים