ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים. הערכת רמות הבסיס של סידן ובחינת פעילותם של תעלות בודדות בפוודוציטים (podocytes) כחלק מגלומרולס שלם שבודד acabado. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ניקוי הדם מכליות של חולדה באמצעות שטיפה דרך האורטה הבטנית.

לאחר מכן, הכליות נאספות, וקליפת הכליה מבודלת ונקצצת באמצעות להב תער. בשלב השלישי, הגלומרולוים הקליפתיים מבודלים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. לאחר מכן, ניתן להעביר את הגלומרולוים המבודלים והנקיים לניסויים אלקטרופיזיולוגיים, או להטעינם בצבעים פלואוריסצנטיים ולבצע מדידות של ריכוז סידן במיקרוסקופ קונפוקלי.

בסופו של דבר, הליכים אלו מאפשרים לחוקרים להבחין בשינויים חריפים בטיפול בסידן התוך-תאי בתגובה למתן חומרים שונים, ולהעריך ולשלוט על מוליכות הסידן ברמה של תעלות יונים בודדות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת לנו לחקור פודוציטים כחלק מהגלומרול המבודד השלם. ההכנה שלנו שומרת על הפוטנציאל התפקודי של הפודוציטים.

הם נשארים צמודים לנימים ומשתתפים בהומאוסטזיס של הסביבה, אשר למעשה יכולה לשמר את החלקים העיקריים של מנגנון הסינון הגלומרולרי. השמעות של טכניקה זו מרחיבה את הסריקה הפרמקולוגית שלנו. במצבים נורמליים ופתולוגיים, מנגנון הטיפול בסידן על ידי הפודוציטים ממלא תפקיד רגולטורי חיוני בפיתוח ובמניעה של סיבוכים כלייתיים במחלות כגון נפרופתיה סוכרתית, סקלרוזה פוקאלית סגמנטרית או יתר לחץ דם. ישנה חשיבות רבה לבחינת התגובתיות של זרימת הסידן לתרופות בתאים אלו, אותה ניתן לסרוק בקלות.

בהכנה זו, VLA Hunka ידגים כיצד לבצע שטיפה לכליה לצורך הפרוצדורות הבאות. אראה בידוד של גלומרולי ואלקטרופיזיולוגיה ב-V clamp, וד"ר GaN ידריך אתכם בדימוי סידן קונפוקלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הניחו חולדה מורדמת על שולחן ניתוח בבקרה תרמית. תחת המיקרוסקופ, בצעו חתך בקו האמצע של הבטן כדי לחשוף את הווריד CVA ואת האורטה.

בשלב הבא, השחילו ליגטורה סביב העורקים הצליאקי והמסריכי העליון והסביב לאבי העורקים הבטני שמעליהם. בצעו דיסקציה קהה של אבי העורקים הבטני מתחת לעורקים הכליתיים. לאחר מכן, מקמו שתי ליגטורות סביבו, אך אל תקשרו אותן.

סגרו את האורטה בעזרת קלימה מעל הקשירות וקשרו את החוט התחתון. לאחר מכן, הכניסו לקטטר לאורטה באמצעות צינור פוליאתילן המחובר למשאבת מזריק מלאה ב-PBS מתחת לקלימה, וקבעו את הקטטר באמצעות קשירה שנייה. לאחר מכן, הסירו את הקלימה וקשרו אותם.

העבירו את העורקים האנטריים והצליאקיים. השקו את האורטה ב-PBS שקולקל מראש למשך שלוש דקות בקצב של 6 mL לדקה. במקביל, בצעו חתך בווריד הנבוב (vena cava) סמוך לוורידים הרנליים כדי להקל על הלחץ.

לאחר שלוש דקות, הפסיקו את הפרפוזיה, הוציאו את הכליות ועטפו אותן. הניחו אותן בתמיסת PBS על קרח. כעת הכינו 30 מיליליטר של 5%BSA טרי במצע RPMI 1640.

באמצעות להב תערמס ומספריים, בודדו את קליפת הכליה (cortex) משתי הכליות, ולאחר מכן גרסו אותן עד לקבלת תעבית הומוגנית. לאחר מכן, העבירו את הרקמה הגרוסה דרך נפה מנירוסטה בעוצמה של 100 mesh שהושרה מראש בתמיסת 5%P-S-A-R-P-M-I. אספו את החומר שעבר דרך הנפה והעבירו אותו דרך נפה בעוצמה של 140 mesh.

לאחר מכן, סננו את הזרימה שנאספה מהנפה ברזולוציה של 140 mesh באמצעות נפה רססה מראש ברזולוציה של 200 mesh. השליכו את התסנין ושטפו את הנפה העליונה עם 10 עד 15 milliliters של תמיסת ה-B-S-A-R-P-M-I שהוכנה, ואספו את הגלומרולים מהחלק העליון של הנפה. לאחר מכן, העבירו את תמיסת ה-B-S-A-R-P-M-I המכילה את הגלומרולים למבחנה של 15 milliliters, והניחו לגלומרולים לשקוע בתחתית המבחנה למשך עד 20 דקות.

בפרוצדורה זו, יש לצפות שבבי זכוכית (cover glass chips) בגודל חמישה על חמישה מילימטרים ב-poly lysine בעלות משקל מולקולרי של 70,000 עד 150,000, ולייבש אותם על פלטה מחוממת. לאחר מכן, יש להביא את התמיסות הניסיוניות לטמפרטורת החדר ולמלא את תא ה-patch clamp ואת הפפילטה. ערבבו בעדינות את התמיסה המכילה גלומרולי. לאחר מכן, הישלימו כ-50 µL ממנה על כל שבב זכוכית מצופה ב-polylysine.

לאחר מכן, העבירו את שבבי הזכוכית עם הגלומרולוסי לתא ה-patch clamp. מלאו מראש את התא בתמיסדת Beth. בצעו פרפוזיה של התא בקצב של 3 mL לדקה למשך דקה אחת כדי להסיר גלומרולוסי שאינם מודבקים, לפני ביצוע הקלטת patch clamp קונבנציונלית במצב cell attached.

כעת העבירו 500 µL של פראקציית הגלומרולוסי לכל פרועת קונוית של 0.5 mL והוסיפו את צבעי הסידן Pure Red AM ו-Fluo-4 AM. לאחר מכן, הניחו את הפרועות על שייקר מסתובב למשך עד שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את לביבות הזכוכית בעזרת פוליליזין והניחו להן להתייבש על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 70 °C. עם השלמת טעינת צבעי הסידן, טפטפו 100 µL מהתמיסה המכילה את הגלומרולוסי על לביבות הזכוכית המצופות בפוליליזין והניחו להם להיקשר לפני השטח למשך כחמש דקות.

לאחר מכן, מקבעו את לוחות הכיסוי שעליהם מחוברים הגלומרולי אל תא הדמיה והזרימו לתוכם תמיסת רחצה בקצב של 3 mL לדקה, כדי להסיר את הגלומרולי שאינם מחוברים ואת הצבעים שנותרו. לאחר מכן, הגדירו את מיקרוסקופ הסריקה הלייזרית הקונפוקלית לאורך גל עירור של 488 nm. לאחר מכן, הגדירו בתוכנת ההדמיה את התדר והרזולוציה הרצויים.

בשלב הבא, אתרו את הגלומרולוסי במיקרוסקופיה בשדה בהיר. לאחר מכן, הפעילו את גילוי אות הפלואורסצנציה. לאחר מכן, בחרו את מישור המיקוד הרצוי ובדקו את עוצמת הפלואורסצנציה בערוצי ה-flu oh four וה-firo red.

וודאו שהגלומרול נראה בבירור בתאורה רגילה (brightfield). לאחר מכן, רשמו את השינויים בעוצמת הפלואורסצנציה עבור אותות ה-flu oh four וה-furor red. כדי לייבא את רצף התמונות, הפרידו את הערוצים והשתמשו במצב hyper stack gray scale.

בתוכנת Image J, פתחו חלון ROI manager דרך הנתיב analyze tools, ROI Manager. בחרו אזור עניין אחד או יותר באמצעות כלי הבחירה האליפטי (oval selection tool) ופונקציית add T ב-ROI manager. לאחר מכן, בחרו את האזור ברקע ושמרו את ה-ROIs שנבחרו.

בשלב הבא, סמנו את תיבת הבחירה one row per slice בדיאלוג ולחצו על okay באפשרויות התפריט results. הגדירו את המדידות. בחרו ב-mean gray value, וחשבו את ערכי עוצמת הפיקסלים עבור כל ROI, אשר יוצגו בחלון התוצאות בעמודות נפרדות.

עבור כל ROI, העתיקו את ערכי העוצמה שנמדדו ב-ROI עבור כל ערוץ לתוכנת ניתוח הנתונים המועדפת, והחסירה את ערכי עוצמת הרקע מכל נקודת נתון עבור כל נקודת זמן. חשבו את יחס העוצמות בין הערוצים של flu oh four ל-URA red, ולאחר מכן שרטטו את השינויים בנקודות הזמן של הטרנזיאנט של הסידן עבור כל ROI. תמונה זו מראה את פיפט ה-patch clamp המחובר לגוף התא על פני השטח של הגלומרולוס של החולדה.

במהלך רישום אלקטרופיזיולוגי, ניתן לראות חלק מגלומרול עטוף בפינה הימנית התחתונה של התמונה. להלן עקומת זרם מייצגת של פעילות תעלות דמויות TRP מתא בשיטת attached patch שבוצעה על הפודוציט למדידת ריכוז הסידן התוך-תאי. הגלומרולים טעונים ב-Fluo-4 AM לסימון הסידן התוך-תאי.

סרטון זה ממחיש את ההשפעות של CIN ומנגנז כלוריד על זרימת סידן פנימה לגלומרולי. גרף זה מכמת שינויים בעוצמת האות של flu oh four שנרשמו פודוציט בודד בתגובה ל-CIN ולמנגנז כלוריד. כצפוי, CIN גורם לעוצמת הפלורסצנציה המקסימלית, ומנגנז כלוריד מכבה את הצבע ומוביל לעוצמת הפלורסצנציה הנמוכה ביותר.

שימוש בתרופות אלו מאפשר לחוקר להגדיר מאוחר יותר את ריכוז הסידן המדויק בתוך התא. סרטון זה מדגים את ההשפעה של 10 µM a TP על ריכוז הסידן הגלומרולרי. שימו לב כי קיימת עלייה בفلורסצנציית ה-flu O four הירוקה וירידה בفلורסצנציית ה-fu red האדומה, המעידות על עלייה בריכוז הסידן התוך-תאי.

טכניקה זו מציעה הזדמנות ייחודית לניטור שינויים בזרימת סידן בעקביות של תעלת יון בודדת ותאים בודדים לאחר טיפולים פרמקולוגיים או מניפולציות אחרות. לפיכך, גישה זו מהווה כלי רב עוצמה בהתחשב במגוון דגמי מכרסמים שעברו שינוי גנטי הזמינים כיום. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע מדידות של זרימת סידן בפודוציטים, כמו גם לגבי ניסויי voltage clamp אלקטרופיזיולוגיים, המשמשים יחד או באופן עצמאי.

טכניקות אלו מספקות תובנה מעמיקה ומכניסטית לגבי ויסות הטיפול בסידן בפודוציטים בתנאים נורמליים ופתולוגיים.