Name: מדידת נזק לדנא ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני In vivo חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למדו כיצד למדוד נזק ל-DNA ותיקון בספלנוציטים של עכברים לאחר חשיפה כרונית לקרינת בטא וגמא במינונים נמוכים. השיטה משתמשת בזרימה ציטומטרית לכימות פגיעות DNA בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להכיר בתרומתם של עמיתינו סנדרין רוש-לפבר ואריק גרגואר מהמכון להגנה מפני קרינה ובטיחות גרעינית (פריז, צרפת). עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של ממשלת קנדה במעבדות הגרעין הקנדיות (צ'וק ריבר, אונטריו, קנדה), קבוצת הבעלים של CANDU (טורונטו, אונטריו, קנדה), הוועדה הקנדית לבטיחות גרעינית ועל ידי המכון להגנה מפני רדיו ובטיחות גרעינית (פריז, צרפת).

כל נהלי הטיפול וטיפול העכבר צריכים לדבוק בכללים שנקבעו על ידי מחוקק התוכניות ו / או טיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים מקומית. כל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים באישור ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. זהירות: כל העבודה עם רדיואקטיביות (כולל, אך לא מוגבלת לטיפול בטריטיום, γ-קרינה חיצונית, טיפול ברקמות בעלי החיים רדיואקטיבי, פסולת מצעים) צריך לדבוק בכללים שנקבעו על ידי הרשויות המחוקקת ו / או הגנה מפני קרינה ותבוצע על ידי מורשה כוח אדם במעבדה ו / או מתקן מוסמכים. 1. בעלי החיים עבודה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים קיבוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עכברים מגיעים מארגון חיצוני, להתאקלם חיות לפחות 10 ימים במתקן בעלי החיים. אם המחקר כולל קבוצות טיפול מרובות, להבטיח כי ספק בעלי החיים ניתן לשלוח אלבעלי החיים l כיצווה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי להקצות עכברים לקבוצות טיפול של 10 עכברים לכל קבוצה. אם משתמש בעכברי זכרים של זן C57BL / 6, יש לי ספק החיה מראש לארגן אקראי של C57BL זכרים / 6 צעירים מאוד במתקן שלהם כדי למתן בעיות תוקפנות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפה כרונית של עכברים β-קרינה פנימית ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי עבודה של טריטיום (10 kBq / L וMBq 1 / L) במי שתיית עכבר על ידי דילול המניות המקוריות של HTO וOBT (תערובת של פרולין tritiated, אלאנין וחומצות אמינו גליצין) פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את הריכוזים הסופיים של טריטיום במי השתייה על ידי מדידת רדיואקטיביות באמצעות מונה נצנץ נוזלי. התאם ריכוזים, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בבעלי חיים לחודש אחד על ידי מתן כרצונך גישה למים טריטיום. אם מים טיפול מקבלים נמוכים בתקופה של השבועיים, להוסיף עוד מים. אחרת, לשנות בקבוקים בשבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמה-מוקרנת התייחס שליטהעכברים זהים. שמור אותם בחדר &quot;נקי&quot; נפרד או על מדף נפרד &quot;נקי&quot; תחת לחץ אוויר חיובי כדי למנוע טריטיום זיהום צולב מהאוויר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפה כרונית של עכברים γ-קרינה חיצונית ל הערה: γ-קרינת מתקן / ציוד ישתנה בהתאם למיקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיטות זמינות של dosimetry, לקבוע את המרחקים ממקור γ-קרינה שיש לי שדות קרינת הפקת שיעורי מינון הרצויים. ודא ההומוגניות של שדות קרינה באזורי כיסוי כלובי חיות. הערה: 1.7 μGy / h הוא שווה ערך לשיעור מינון המיוצר על ידי 1 MBq / טריטיום L בגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף עכברים על ידי הצבת כלובי עכבר במרחקים שנקבעו בשלב 1.3.1 לחודש אחד. למזער הפרעה יומית של γ-קרינה 30 דקות. השתמש מד מינון thermoluminescence למדוד מינונים נקלטו כולל. </li></ol> 2. קורבנות ודגימה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכשירי ניתוח סטרילי, צלחות פטרי 60 מ&quot;מ עם מסננות הוכנסו 70 מיקרון תא, 15 מיליליטר וצינורות 1.5 מיליליטר, תקשורת RPMI בתוספת סרום 5% שור עוברי (FBS) ומקום כל בתוך ארון בטיחות ביולוגי. הבטחת סטריליות של העבודה היא קריטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של תקשורת RPMI לכל צלחת פטרי 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים באמצעות שיטה שאושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים המקומית. נקע בצוואר הרחם הוא בחירה טובה עבור עבודת splenocyte המתוארת בפרוטוקול זה. עם זאת, אם דגימות דם למבחנים אחרים (לדוגמא, לmFISH, הגרעינון בלוק cytochalasin או מבחני genetoxicity הנפוץ אחרים) נדרשות, להשתמש לנקב פנים-לב לאחר הרדמה עם isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה שכיבתה על גב, עם הראש והצביע ממך. לרסס את העכבר למטה עם 70% אתנול. בעזרת מלקחיים, לתפוס את עור anteriorly לפתיחת השופכה ולעשות חתך קטן עם מספריים באזור החיץ הנקבי. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחתך זה, לחתוך לאורך קו האמצע הגחון לחלל החזה, להיות זהיר, כדי לחתוך רק את העור ולא קיר השריר מתחת. לנתח את העור מקו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את דופן הבטן עם מלקחיים ולחתוך לאורך הציר החציוני של קיר השרירים לפתוח את חלל הבטן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הטחול על ידי בקלילות תופס אותו עם מלקחיים סטריליות ומשייכתו בעדינות על זה תוך צמצום מרחק בו זמנית רקמת חיבור במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה קטנה של הטחול (כ 1/10 של הטחול) והמקום בצינור 1.5 מיליליטר. Snap להקפיא בחנקן נוזלי לאחסון שלאחר מכן ב -80 ° C למבחנים משלימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שארית הטחול לתוך מסננת תא בתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ עם 5 מיליליטר של תקשורת RPMI-לוותר מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעכבר הבא. יכולים להיות כל הזמן טחולים חולץ ב -60 מנות מ&quot;מ עם תקשורת (עד 2 שעות) בעוד שאר העכברים להקריב את: הערהאד. בהתאם למספר האנשים שהשתתפו, בין 5 ל 15 עכברים יכולים להיות מעובד ביום אחד. </li></ol> 3. הכנת תרבויות Splenocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הטחול על ידי מיותר בתוך מסננת תא עם מלקחיים סטרילי עם קצה מעוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסננת התא ולאסוף את ההשעיה התא המסוננת מצלחת 60 מ&quot;מ לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מסננת התא עם 5 מיליליטר של תקשורת כדי לאסוף את שארית התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 10 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant ולמזוג מחדש להשעות גלולה ב 5 מיליליטר של RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 4 מיליליטר של השעיה תא לתוך בקבוק 25 מיליליטר תרבות רקמות ולהסיר לחממת CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 80% לחות) </li></ol> 4. מאתגרי הקרנה ותיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר אתנותר 1 מיליליטר של השעיה תא מהצעד 3.8 לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הנזק לדנ&quot;א שנמדד במדגם זה מייצג שני נזק הנגרם הטיפול וt = 0 נתוני נקודה לבניית עקומת תיקון DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TBS (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 300 μl של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך ערבוב במערבולת במהירות נמוכה, להוסיף 700 μl של -20 אתנול 100% מעלות צלזיוס. סגור את המכסה ולהפוך כמה פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות ב -20 ° C. Splenocytes הקבוע באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C לפחות 12 חודשים ללא כל אובדן מורגש באות γH2AX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את תרבויות splenocyte מצעד 3.8 עם γ-רד מאתגר<html> מינון iation של 2 Gy ב≥ שיעור מינון 200 mGy / דקות באמצעות מכשיר הקרנה זמין. הערה: המטרה של קרינה זו היא לגרום לDNA DSB לאתגר את מכונות התיקון. גם צילומי רנטגן יכול לשמש למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחזיר את התרבויות לחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה 1 לאחר הקרנת Gy 2 המאתגרת, להסיר את התרבויות מן החממה לארון בטיחות ביולוגית. לאסוף aliquot מדגם מייצג, בעדינות מחדש להשעות תאים באמצעות pipettor והעברה 1 מיליליטר של ההשעיה תא צינור 1.5 מיליליטר על קרח. להחזיר את תרביות תאים לחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות לשאוב supernatant באמצעות משאבת ואקום. בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.3-4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר 2 γ-הקרנת Gy, הקציר המאתגר ולתקן ב= מדגם 24 שעות כמתואר בשלב 4.8-4.10. </li></ol>ייתכנו &quot;&gt; 5. תיוג Immunofluorescent עם אנטי-γH2AX נוגדן הערה: בדרך כלל, 15-30 דגימות ליום יכולות להיות מתויגות immunofluorescently וassayed ידי cytometry זרימה בטווח אחת. כדי להבטיח השוואה מדויקת בין קבוצות טיפול, כולל מדגם (ים) מכל קבוצה. ראית גם התייחסות 16 לפרטים נוספים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערכת שכותרת של צינורות למספר הדגימות להיות מעובד ומניחים על קרח. השתמש 12 x 75 מ&quot;מ צינורות זכוכית הסירו את מכסה. עקרות אינה נדרשות לעבודה זו. כולל דגימה אחת נוספת היסטורית שליטה לתיוג עם נוגדנים משני בלבד (&quot;2 Ab רק&quot;). השתמש מדגם שליטה היסטורי זה בכל cytometry זרימה לרוץ בתוך מחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של TBS קר כקרח על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר splenocytes קבוע מ-20 ° C, מערבולת במשך 5 שניות ולהעביר aliquot 0.5 מיליליטר לצינורות מוכנים עם כפות. מניחים את שארית דגימות בחזרה לאחסון -20 ° C ולשמור כמדגם גיבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של קר כקרח TBS המכיל 1% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של חיץ TST (0.05% X-100, 2% FBS טריטון ב TBS). דגירה של 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של נוגדן אנטי γH2AX העיקרי בדילול 1: 150 במאגר TST. השתמש 200 μl של TST ל&quot; 2 Ab רק &quot;מדגם השליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות עמדה על שייקר מסתובב בזווית של 45 - 60 מעלות ולנער תמורת 1.5 שעות ב 300 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צינורות דוגרים, להכין נפח מספיק (200 μl / מדגם) של הנוגדנים משני אנטי העכבר העז מצומדות עם Alexa-488 בדילול 1: 200 במאגר TST. הערה: כל העבודה שיש בי Alexa-488נוגדן מצומדת (שלבים 5.10-5.16 להלן) צריך להיעשות בתנאי אור עמומים וצריכה להיות מוגן דגימות שכותרתו מאור על ידי עטיפת צינורות בנייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגירה 1.5 שעות הושלמה, להוסיף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 2% FBS על צינור אחד וצנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS המכיל 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 200 μl של פתרון נוגדנים משני מהשלב 5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות על פלטפורמה רועדת עבור שעה 1 כמו בשלב 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של TBS קר כקרח המכיל 1% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של TBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant בעדינות מחדש להשעות גלולה ב 0.5 מיליליטר של TBS המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטריודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות על RT המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על cytometer זרימה באמצעות פרוטוקולי מכשיר ספציפי 16. קראו לפחות 10,000 תאים לדגימה. </li></ol>

<ol><li>Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptive+response+modifies+latency+for+radiation-induced+myeloid+leukemia+in+CBA%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice.</a> Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).</li>
<li>Shadley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+adaptive+response+in+human+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal adaptive response in human lymphocytes.</a> Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).</li>
<li>Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+%5B3H%5Dthymidine-induced+adaptive+response+of+human+lymphocytes+to+subsequent+doses+of+X-rays+involves+the+induction+of+a+chromosomal+repair+mechanism%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism).</a> Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).</li>
<li>Mitchel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dose+window+for+radiation-induced+protective+adaptive+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Dose-Response%22%5BJournal%5D)">The dose window for radiation-induced protective adaptive responses.</a> Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).</li>
<li>Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+no-threshold+relationship+is+inconsistent+with+radiation+biologic+and+experimental+data%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data.</a> Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).</li>
<li>Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+stability+and+the+DNA+double-stranded+break+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection.</a> Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).</li>
<li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+repairing+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Sensing and repairing DNA double-strand breaks.</a> Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+binding+protein+1+%2853BP1%29+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+%28125%29IdU-induced+DNA+double-strand+breaks+with+gamma-H2AX+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody.</a> Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).</li>
<li>Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus+on+histone+variant+H2AX%3A+to+be+or+not+to+be%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Focus on histone variant H2AX: to be or not to be.</a> FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).</li>
<li>Taneja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+phosphorylation+as+a+predictor+of+radiosensitivity+and+target+for+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy.</a> J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+histone+H2AX+in+spheroids%2C+tumors%2C+and+tissues+of+mice+exposed+to+etoposide+and+3-amino-1%2C2%2C4-benzotriazine-1%2C3-dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide.</a> Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA+double-strand+breaks+is+not+modulated+by+low-dose+gamma+radiation+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice.</a> Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).</li>
<li>Runge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+interpretation+of+ionizing+radiation-induced+gammaH2AX+foci+by+the+novel+pattern+recognition+system+AKLIDES%28R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R).</a> Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).</li>
<li>Jucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FociCounter%3A+A+freely+available+PC+programme+for+quantitative+and+qualitative+analysis+of+gamma-H2AX+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci.</a> Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).</li>
<li>Garty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RABIT%3A+a+rapid+automated+biodosimetry+tool+for+radiological+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage.</a> Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).</li>
<li>Kovalchuk, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+DNA+repair+in+radiation-exposed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice.</a> Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).</li>
<li>Rube, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+in+the+context+of+chromatin%3A+new+molecular+insights+by+the+nanoscale+detection+of+DNA+repair+complexes+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy.</a> DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).</li>
<li>Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+stress+genes+by+low+doses+of+gamma+rays%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of stress genes by low doses of gamma rays.</a> Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי לא ידוע על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול שהוצג במאמר זה הוא שימושי לניהול עכבר בקנה מידה גדול במחקרי vivo בוחנים את השפעות genotoxic של רמות נמוכות של חומרים כימיים ופיסיים שונים, כוללים קרינה מייננת. המתקן שלנו ייחודי ספציפי הפתוגן ללא בעלי החיים מצויד בirradiator GammaBeam 150 ואולם הקרנה ארוכה 30 מטר מאפשר ביצוע המחקרים ארוכים-חיים כרוכים בirradiations שיעור מינון נמוך או נמוך מאוד על מאות או אפילו אלפים של עכברים. ניתן להגדיר מתקני קרינה קטנים יותר לקרינה במינון נמוכה כרונית באוניברסיטה או בסביבת ב...

מחלוקת מהותית על ההשפעות המזיקות האפשריות של שני מינונים נמוכים או נמוכים מאוד של קרינה מייננת ופחד של הציבור של קרינה, מונע על ידי תמונות של ההפצצות האטומיות על הירושימה ונגסקי ותאונות כור גרעיני נדירות (שהוחמרה על ידי תקשורת המונים), הובילה למאוד רגולציה קפדנית הגנה מפני קרינה ותקנים שהם בעלות פוטנציאל לא מדעי מוצדקים. בשלושת העשורים האחרונים, דיווחים רבים תעדו שני חוסר מזיק ואת הנוכחות של השפעות ביולוגיות פוטנציאלי הנגרמות על ידי קרינה מועילות במינון נמוך 1-4. גורם הסיכון בריאותי קרינה העיקרי הוא ההסתברות של סרטן, המוערכת בהתבסס על מחקרים אפידמיולוגיים של ניצולי פצצה אטומיים שקיבלו מינון גבוה או בינוני של קרינה. אקסטרפולציה ליניארית של נתונים אלה (מה שנקרא ליניארי-אין-סף או מודל LNT) משמשת להערכת סיכונים של סרטן במינונים נמוכים. עם זאת, גישה זו לא קיבלה קבלה מדעית ברחבי העולםוהוא דנו בכבדות 5. ניכר כי מחקרים נוספים נדרשים כדי להבהיר סוגיה זו ואולי לשפר את הסטנדרטים להגנה מפני קרינה. מחקרים כאלה צריכים לערב טיפולים כרוניים (הקירוב הטוב ביותר של חשיפות סביבתיות ותעסוקתיות), במודלים של בעלי החיים vivo (הטובים ביותר עבור אקסטרפולציה אפקטים לאדם) ונקודתי קצה כגון שיעורי נזק לדנ&quot;א, תיקון DNA וmutagenesis. זה ידוע שה- DNA הוא היעד העיקרי לפגיעת השפעות קרינה ולא שלמים או אי-תיקון עלול להוביל להתפתחות הסרטן וmutagenesis 6. הפסקות DNA פעמיים גדיל (DSB) הן אחד מהסוגים מזיקים ביותר של נגעי DNA ועלולות להוביל למוות של תאים ויצירת הגידולים 7. זהו, אם כן, חשוב להיות מסוגל אמין ומדויק למדידת הרמה של DSB לאחר חשיפה לקרינה במינון נמוכה ו / או גורמי לחץ אחרים, כגון מזהמים כימיים. אחד מהסמנים הרגישים והספציפיים ביותרשל DNA DSB הוא H2AX היסטון פוספורילציה, נקרא γH2AX 8, עדיין סמנים ושיטות אחרים כבר הציעו 9,10. ההערכה היא כי אלפי מולקולות H2AX, בקרבת DSB מושרה, מעורבים בהיווצרות γH2AX מאפשרת זיהוי של DSB הבודד על ידי תיוג immunofluorescent עם הנוגדן ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אנטי γH2AX 11. התגובה היא מהירה מאוד, והגיע המקסימלית שלה בין 30 ל -60 דקות. ראיות לכך שγH2AX מאפשר תיקון של דנ&quot;א DSB ידי משיכת גורמי תיקון אחרים לאתרים של הפסקות ועל ידי שינוי מבנה הכרומטין לעגן קצות DNA השבורים ולספק גישה לחלבונים אחרים תיקון (ביקורת ב -12). עם השלמת התיקון של דנ&quot;א DSB, γH2AX מקבל דה-פוספורילציה ו / או עובר השפלה, ומולקולות H2AX מסונתזים חדש להחליף γH2AX באזורים שנפגעו מהכרומטין 10. ניטור היווצרות ואובדן γH2AX יכול,לכן, לספק הערכה מדויקת של קינטיקה תיקון DNA DSB. גישה זו נעשתה שימוש כדי ללמוד תיקון DSB בשורות תאי גידול שונים אנושיות מוקרנים עם מינונים גבוהים של קרינה ושיעורה ורמות DSB שייר הוכח לתאם עם radiosensitivity 13-15. אנחנו שונה הגישה הניסויית הזה וליישם אותו למחקר עכבר in vivo לבחון את ההשפעות של מינונים נמוכים של γ- הכרוני וβ-קרינה ברמות ה- DNA DSB ותיקון (איור 1). ראשית, אנחנו מדגימים שיטה לביצוע חשיפה כרונית ארוך טווח של עכברים לβ-קרינה הנפלטת באמצעות טריטיום (מימן-3) בצורה של המים tritiated (HTO) או כטריטיום מחויב אורגני (OBT) מומס במי שתייה . שתי הצורות צפויות לצבור ו / או להפיץ בצורה שונה בגוף ולכן, לייצר השפעות ביולוגיות שונות. שני צורות הן סכנות פוטנציאליות בתעשיית גרעין. טיפול זההקביל לחשיפה כרונית לקרינת γ-בשיעור מינון שווה ערך כדי לאפשר השוואה נכונה של שני סוגי הקרינה, שהוא חיוני להערכת היעילות הביולוגית היחסית שלהם. Beta-קרינה מורכבת מאלקטרונים, מה שהופך את שונה מאוד מγ-הקרינה, הפוטונים באנרגיה גבוהים. בשל הבדל זה, Β-קרינה מייצגת סכנה בריאותית בעיקר פנימית ועלולה לייצר השפעות ביולוגיות שונות בהשוואה לγ-קרינה. סיבוך זה הביא מחלוקות משמעותיות על פני הרגולציה של חשיפה לβ-קרינה הנפלטת על ידי HTO. לפיכך, רמות רגולציה של HTO במי שתייה לציבור משתנות מקרל 100 / L באירופה 75,000 בקרל / L באוסטרליה. זהו, אם כן, חשוב להשוות השפעות ביולוגיות של HTO למינונים מקבילים של γ-קרינה. שנית, שיעור ה- DNA DSB נמדד בsplenocytes המבודד עם השלמת חשיפות כרוניות באמצעות כותרת immunofluorescently γH2AX לזהותאד על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר ההערכה של מידת נזק שנגרם על ידי ה- DNA in vivo החשיפות. עם זאת, זה הגיוני לצפות שחשיפות כגון רמה נמוכה לא יכולות לייצר כל שיעורי זיהוי של ה- DNA DSB; במקום זאת, כמה שינויים נסתרים / ניתן לצפות תגובות שמשפיעות על היכולת של התאים כדי לתקן נזק ל- DNA. שינויים אלה, אם מצאו, יכולים להיות גם גירוי (ייצור אפקט מועיל) או מעכב (ייצור אפקט מזיק). הפרוטוקול המוצע מאפשר חושף שינויים כאלה על ידי מאתגרים splenocytes חילוץ עם מינון גבוה של קרינה שמייצר כמות משמעותית של נזק (למשל, 2 Gy ייצור כ -50 DNA DSB לכל תא או 3 -. עלייה של 5 לקפל בסך הכל רמת γH2AX) . בהמשך לכך, ההיווצרות ואובדן γH2AX, המשקף את הייזום והשלמת תיקון DSB, מנוטרת על ידי cytometry זרימה. בדרך זו, לא רק בסיס ורמות מושרה טיפול של ה- DNA DSB ניתן למדוד, אבלגם השפעתה הפוטנציאלית על היכולת של התאים להגיב ונזק לדנ&quot;א תיקון הנגרם על ידי רמות לחץ גבוהות בהרבה.

<table><tbody><tr><td>HTO: מים משולשים, [3H]</td> <td>המתקבלים מקומית מכור גרעיני&nbsp;</td><td></td><td>פעילות מלאי 3.7 GBq/mL;&nbsp; ניתן להחליף ב-HTO מבית Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT: Alanine, L-[3-3H]: טריטיום קשור אורגנית (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: גליצין, [2-3H]: טריטיום פרקין</td><td>אלמר</td> קשור אורגנית <td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT: פרולין, L-[2,3-3H]: טריטיום קשור אורגנית (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr> <tr><td>מים משולשים, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>תחליף ל-HTO ממקור מקומי&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>ניתן להחליף את <td>GammaBeam 150 irradiator</td><td>Atomic Energy of Canada Limited</td><td>בייצור מקומי</td><td>במקור קרינת g אחר בעל פעילות נמוכה מספיק&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 עם L-גלוטמין ו-HEPES 500 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד gH2AX, שיבוט JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 נוגדן נגד עכבר עז</td><td>Life Technologies (לשעבר Invitrogen)</td> <td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יוד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4864-10 מ"ל</td> 1 <td>מ"ג / מ"ל</td></tr><tr><td>אלכוהול</td> מסחרי <td>P006-EAAN</td><td>בקבוקי 500 מ"ל צינורות אתנול</td><td></td></tr><tr><td>מוחלט 1.5 מ"ל</td> צינורות <td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>2682550 פישר סיינטיפיק</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-539-5</td><td>צינורות צנטריפוגה סטריליים מפוליפרופילן</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 מ"מ צינורות זכוכית לא מכוסים</td><td>Fisher Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים עם קצה רגיל</td></tr><tr><td>צלוחיות T25</td><td>VWR</td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue culture בקבוק 25 מ"ל (מס' ספק 156340)</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>Wagner מספריים 12 ס"מ מלקחיים חדים/</td></tr><tr><td>חדים, ישר</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>מלקחיים Semken 13 ס"מ, מלקחיים</td></tr><tr><td>ישרים,</td><td>מעוקלים Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>מלקחיים בתבנית צרה 12 ס"מ,</td></tr><tr><td>צלחות פטרי מעוקלות 60 מ"מ</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD צלחת תרבית רקמות פלקון 60 x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>מסנני תאים, 70 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-2</td><td>מסנני תאי פלקון 50/מארז</td></tr><tr><td>מתכון PBS: טבליה אחת מומסת ב -200 מ"ל מים נטולי יונים, התאימו את ה- pH ל -7.4 במידת הצורך.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>טבליות מלח חוצצות פוספט</td></tr><tr><td>מתכון TBS: להכנת מלאי</td><td></td><td></td><td></td>10x</tr><tr><td>30 גרם TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Trizma hydrochloride</td></tr><tr><td>88 גרם NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>נתרן כלורי</td></tr><tr><td>2 גרם KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>אשלגן כלורי</td></tr><tr><td>ממיסים ב-1 ליטר מים נטולי יונים, התאימו את ה-pH ל-7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בsplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; in vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

חשיפה לקרינה במינון נמוכה עלולה לייצר מגוון רחב של השפעות ביולוגיות שהם שונים בכמות ובאיכות מתופעות המיוצרות על ידי מינוני קרינה גבוהים. התמודדות עם שאלות הקשורות לבטיחות בריאות סביבתית, תעסוקתית וציבורית באופן ראוי ומוצדק מבחינה מדעית מסתמכת במידה רבה על היכולת למדוד במדויק את ההשפעות הביולוגיות של מזהמים במינון נמוכים, כגון חומרים מייננת קרינה וכימיקלים. נזק לדנ&quot;א ותיקון הם הסימנים המוקדמים החשובים ביותר של סיכונים בריאותיים בשל השלכותיהם הפוטנציאליות לטווח ארוך, כגון סרטן. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללמוד את ההשפעה של חשיפה כרונית בvivo למינונים נמוכים של קרינת β γ- ועל נזק לדנ&quot;א ותיקון בתאי טחול עכבר. באמצעות סמן מקובל של DNA הפסקות גדיל פעמיים, H2AX היסטון phosphorylated נקרא γH2AX, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך לא רק את הרמות של נזק לדנ&quot;א, אלא גם משניםביכולת תיקון DNA שהופק על ידי פוטנציאל מינון נמוך בחשיפות vivo. Cytometry זרימה מאפשרת מדידה מהירה, מדויקת ואמינה של γH2AX כותרת immunofluorescently במספר גדול של דגימות. תיקון הפסקה כפול גדיל DNA יכול להיות מוערך על ידי חשיפת splenocytes חילוץ למנה מאתגרת של 2 Gy לייצר כמות מספקת של DNA פורץ להפעלת תיקון ועל ידי המדידה המושרית (לאחר ההקרנה 1 שעה) ונזק לדנ&quot;א שייר (24 שעות לאחר הקרנה). הנזק לדנ&quot;א שיורי יהיה מעיד על תיקון חלקי והסיכון של חוסר יציבות גנומית לטווח ארוך וסרטן. בשילוב עם מבחני אחרים ונקודתי קצה שיכול בקלות להיות נמדדים בכך במחקרי vivo (למשל, סטיות כרומוזומליות, תדרי גרעינונים בreticulocytes מח עצם, ביטוי גנים, וכו &#39;), גישה זו מאפשרת הערכה מדויקת וקונטקסטואלית של ההשפעות הביולוגיות לחצים רמה הנמוכה של.

איור 2 מציג דוגמאות של cytometry זרימת הגרפים הצפויים לsplenocytes מוכנים תוך שימוש בשיטה שתוארה כאן. תאים מגודר ראשון המבוסס על &lt;נפח בצד הפיזור אלקטרוני&gt; עלילת פיזור (איור 2 א ו 2 ד; נפח אלקטרוני הוא שווה ערך לפיזור קדימה). היסטוגרמות יוד FL3 / propidium (איור 2 ו2E) לאשר חלוקת מחזור התא נורמלית. אומר אות γH2AX מחושבת באמצעות ערוץ FL1 מאשר גידול&gt; פי 2 בדנ&quot;א DSB ב2-Gy מוקרן תאים (איור 2F)</st...

פרוטוקול להערכת שינויים ברמות הנזק ל-DNA וביכולת תיקון ה-DNA שעלולים להיגרם על ידי הקרנה כרונית במינון נמוך in vivo בלימפוציטים של טחול עכבר, על ידי מדידת היסטון זרחני H2AX, מוצג סמן לשבירות דו-גדיליות של DNA, באמצעות זרימה ציטומטרית.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למדוד את נזקי ה-DNA והתיקון המושרים בתאי טחול של עכברים כתוצאה מחשיפה כרונית in vivo למינונים נמוכים של קרינת בטא או גמא. מטרה זו מושגת תחילה על ידי חשיפת העכברים להקרנה פנימית של בטא או חיצונית של גמא, כדי לעורר שינויים פוטנציאליים בנזקי ה-DNA ובתיקונו. כשלב שני, מבודדים את תאי ה-PLE ומקרינים אותם במינון מאתגר גבוה של קרינת גמא המשרה נזקי DNA ניתנים לגילוי, כדי לאפשר ניטור של תיקון ה-DNA.במהלך הזמן, תאי הטחול מסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות אימונו-לבילה נגד gamma H2AX כדי לאפשר כימות של נזקי ה-DNA. בסופו של דבר, ניתן למדוד באמצעות ציטומטריית זרימה את נזקי ה-DNA שנגרמו ממנות של קרינת גמא חריפה הנמוכות עד כדי 10 cGy. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההגנה מפני קרינה, כגון האם מנות נמוכות של קרינה, הנפוצות בדרך כלל במסגרת תעסוקתית, רפואית או ציבורית, אכן מגבירות את ההסתברות להשפעות בריאותיות מזיקות כגון סרטן.היתרונות העיקריים של הטכניקה שלנו על פני שיטות קיימות, כגון ספירת מוקדי gamma H two A X באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה, הם שהטכניקה שלנו דורשת זמן ניתוח קצר משמעותית, מה שהופך אותה למתאימה למחקרי בעלי חיים בקנה מידה גדול, והיא מפחיתה הטיות הקשורות למבצע בכימות של gamma H two A X. ההשלכות של טכניקה זו חולשות לעבר רפואה מות

measuring-dna-damage-repair-mouse-splenocytes-after-chronic-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Quantitation של גדיל הדנ"א הכפול נשבר על בסיס γH2AX מוקדים הפך כלי רב ערך, במיוחד בביולוגיה קרינה, להערכת radiosensitivity רקמות ההשפעות של תרכובות קרינה שינוי. כאן אנו מדגימים את השימוש assay immunofluorescence עבור quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

מערכת העיכול היא אחד האיברים הרגישים ביותר לפגיעה בטיפולי סרטן רדיותרפיים. זוהי בו זמנית מערכת איברים עם אחת מיכולות ההתחדשות הגבוהות ביותר בעקבות עלבונות כאלה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת

הפרוטוקול מתאר מחקר של השפעות העור המערכתיות והמקומיות של חשיפה לאולטרה סגול B בעכברים.

חקר חשיפה כרונית של עכברים לקרינה אולטרה סגולה מסוג B 

למדו כיצד למדוד נזק ל-DNA ותיקון בספלנוציטים של עכברים לאחר חשיפה כרונית לקרינת בטא וגמא במינונים נמוכים. השיטה משתמשת בזרימה ציטומטרית לכימות פגיעות DNA בזמן אמת.

מדידת נזק לדנ"א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני

גלה סרטונים נוספים