מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis
27 באוגוסט 2015
תאי יונקים רבים מעדיפים לנדוד לעבר מטריצה או מצע נוקשה יותר באמצעות דורוטקסיס. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת חוץ גופית פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור ולתפעל התנהגויות דורוטקסיס של תאים על ידי שילוב מצעי פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעלי קשיחות מוגדרת, המתממשקים עם כיסויי זכוכית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק מערכת מפושטת לניתוח קשיחות תאים, שדרכה תאי יונקים רבים נודדים באופן מועדף לעבר תשתית קשיחה יותר. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תשתיות Polymethyl siloxane או PDMS בעלות קשיחות מוגדרת. לאחר מכן, ה-PDMS שהוכן נשפך לתוך כל באער של פלטת שש באערים, וכל בועות האוויר מוסרות.
לאחר מכן משלימים את תאי ה-Durex על ידי הנחת זכוכית כיסוי סטרילית מעל ה-PDMS בכל באר כדי ליצור שכבה עליונה. השלב האחרון הוא זריעת תאים אל תוך תאי ה-Durex בצפיפות המאפשרת לתאים מספיק מרחב להגירה ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של תאים חיים כדי לחקור את הציר בתאים נודדים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פולי-אקרילאמיד, הוא קיומו של שלב בודד בין ה-PDMS הרך לזכוכית הקשיחה, במקום חלופות של ג'ל עם מדרג (gradient gel). כמו כן, ציפוי PDMS ברכיבי מטריצה חוץ-תאית כגון פיברונקטין אינו דורש קשירה כימית (chemical cross-linking), הנדרשת עבור ג'לים של פולי-אקרילאמיד. כדי להכין פלטת תרבית רקמות בעלת שישה בארות, ראשית, שקלו את המאזן באמצעות מבחנה קונית של 50 milliliter.
שקלו כ-10 גרם של תמיסת בסיס פולידימეთילסילוקסאן (PDMS) לתוך מבחנה של 50 מיליליטר. עבור תת-מצע ביחס של 90 ל-1, חלקו את המשקל הנמדד של תמיסת בסיס ה-PDMS ב-90. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של תמיסת מסמך הצילוב (crosslinker) הדרושה, הוסיפו את הכמות המחושבת של תמיסת מסמך הצילוב של ה-PDMS למבחנה וערבבו נמרצות את תערובת בסיס ה-PDMS ומסמך הצילוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
בשלב זה, בשימוש בשפכטל קטן, התערובת תכיל מספר קטן של בועות אוויר. סובב את מצע ה-PDMS בצנטריפוגת שולחנית למשך חמש דקות ב-50 $\times$g. השאר בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הבועות אם הן עדיין קיימות.
לאחר חמש דקות של צנטריפוגה נוספת, העבירו בפיפט 1 mL של תת-מצע PDMS ביחס של 90:1 לכל באער של פלטת 6 באערים שעברה טיפול לתרבית רקמות. ניתן להסיר בשלב זה בועות אוויר שנותרו ב-PDMS על ידי פיצוצן עם מחט בכיול 21 gauge.
המתינו 30 דקות כדי לאפשר ל-PDMS להיפרס בתוך הבאר. לאחר מכן, הרתיחו כיסויות זכוכית מספר 1 במידה של 12 מילימטר במים מזוקקים במשך חמש דקות, בסך הכל שלוש פעמים. הניחו כיסויית אחת יבשה לתוך כל באר בלוח לתרבית רקמות על ידי נגיעה עדינה באחד מצדי הכיסוי.
החליקו את הזכוכית לתוך תמיסת ה-PDMS ולאחר מכן הניחו אותה על ה-PDMS. ככל שזכוכית הכיסוי תתייצב, ה-PDMS יתחיל להתרחב מעל קצוות הזכוכית, אך לא יכסה אותה לחלוטין. פעולה זו תיצור ממשק בין ה-PDMS לזכוכית לאחר הפולימריזציה.
דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 70 °C בתנור למשך 16 שעות כדי להקשות את ה-PDMS. לבסוף, הניחו את הפלטה במנדף לתרביות תאים וסטריליזרו באמצעות UV למשך 10 דקות. ציפו כל תא durox ב-1 mL של פיברונקטין בתוך phosphate buffered saline ללא סידן ומגנזיום למשך שעה אחת בטמפרטורה של 30 °C.
ודאו שכל השטח טבול בתמיסת פיברונקטין ב-PBS. הכינו אלבומין מסרום בקר (BSA) בריכוז 1% שעבר דנטורציה תרמית, על ידי שקילה של 0.5 גרם BSA והמסה שלו ב-50 מיליליטר של PBS מסונן. סטריליזו את התמיסה באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון לפני החממה בטמפרטורה של 80 °C למשך 12 דקות.
בשלב הבא, שאבו את תמיסת הפיברונקטין ושטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של BSA שעבר דנטורציה תרמית ב-PBS לכל באר והדרימו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בצעו טריפסינזציה וספרו את התאים הרצויים בזמן שהתאים נחסמים על ידי ה-BSA שעבר דנטורציה תרמית. שאבו את תמיסת ה-BSA מהתאים רגע לפני זריעת התאים.
זריעו 10,000 תאים בנפח של שני מיליליטר לכל באער בתא ה-doax. בעזרת המדיום הנדרש לסוג התאים הנבחר, אפשרו לתאים להיצמד ולהתפשט על התשתית במשך ארבע שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2, ובצעו דימוי של תאים חיים במיקרוסקופ הפוך בשיטת ניגודיות פאזה (phase contrast) עם עדשה של 10x. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בתא סביבתי לח וסגור, המאפשר בקרת טמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 במהלך דימוי לטווח ארוך.
דימוג: לאחר שהתאים התפשטו במשך כ-3.5 שעות, מקמו את הפלטה בתא המיקרוסקופ. המתינו 30 דקות להגעה לשיווי משקל של הדגימות בתא. הגדירו ביקור אוטומטי של מספר נקודות במיקרוסקופ, אם קיים.
התמקדו בממשק שבין ה-PDMS לבין כיסוי הזכוכית ובחרו נקודות לצילום מסביב לממשק. בצילום של בממוצע 40 נקודות לכל תא Durex, ובביצוע צילום של התאים מדי 10 דקות למשך עד 16 שעות, אזור העניין (ROI) יופיע כשני קווים, כאשר הקו החיצוני תואם לקצה כיסוי הזכוכית והקו הפנימי תואם לממשק הממשי בין ה-PDMS לבין כיסוי הזכוכית. כדי לנתח את הנתונים, צרו גיליון נתונים בדומה לזה המוצג בפרוטוקול הכתוב.
ספרו את מספר אירועי החצייה ממשטח ה-PDMS למשטח הזכוכית ולהפך מכל סרטון שהופק. אירוע חצייה מוגדר כמעבר של גרעין התא מעל הגבול שבין ה-PDMS לזכוכית בכל אחד מהכיוונים. רשמו את מספר אירועי החצייה בעמודה המתאימה בגיליון ה-Excel כדי לכמת חציות מרובות.
ספרו את מספר הפעמים שבהן התא חצה את הממשק. מספר זה יירשם בעמודת ה-Excel המתאימה למצע שבו שהה התא בסיום הסרטון. חזרו על הניתוח עבור כל תא שחוצה את הממשק בסרטון.
יש להוציא תאים שנדדו אל מחוץ לשדה הראייה במהלך הדימוי. חשבו את אחוז התאים שנדדו מה-PDMS אל פני השטח של הזכוכית ולכן עברו Durotaxis. כדי לעשות זאת.
חברו את מספר אירועי החצייה מרך לקשיח ואת אירועי החצייה המרובים שהסתיימו על קשיח, וחלקו במספר הכולל של אירועי החצייה. חשבו את אחוז החציות המרובות על ידי חלוקת הסכום הכולל של חציות מרובות במספר הכולל של החציות, כדי להתחיל להבין את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו תאים מגיבים לרמזים מכניים בסביבתם. ניתן להשתיק חלבונים ספציפיים באמצעות IRNA כפי שמוצג כאן.
בסביבות 70% מהתאים בביקורת שטופלו ב-irna הראו ציר (axxis). בניגוד בולט לכך, כאשר CD gap הושקט באמצעות RNAi, לתאים לא הייתה העדפה לגבי נדידתם על תשת קשה או רכה. יתרה מכך, התאים שבהם הושקט CD gap חצו את הגבול מספר פעמים.
בעוד שתאים של ביקורת המטופלים ב-irna חוצים בדרך כלל את הגבול פעם אחת בלבד, מסלולים מייצגים של תאי ביקורת irna מראים כי התאים נודדים בדרך כלל פעם אחת לחוצה הגבול ונשארים באופן מועדף על הפני השטח הקשיח יותר בהשוואה לתאים המטופלים ב-CD gap. תאים המטופלים ב-irna שלא הפגינו העדפה לקשיחות כלשהי חצו את הגבול מספר פעמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תשתיות ה-PDMS, הרכבת תאי ה-duris וכמותיתת ה-DUR taxes.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט מערכת in vitro מפושטת לחקר דורוטקסיס (durotaxis) של תאים, תהליך שבו תאי יונקים נודדים באופן מועדף לעבר מצעים קשיחים. באמצעות שימוש במצעי פולידימيثילסילוקסאן (PDMS) בעלי קשיחות מוגדרת, חוקרים יכולים להשפיע על דפוסי נדידה של תאים ולהתבונן בהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- מדע החומרים
רקע
- דורוטקסיס (Durotaxis) היא התופעה שבה תאים נעים לעבר מצעים קשיחים יותר.
- הבנת נדידת תאים היא חיונית להשגת תובנות בתחומי הנדסת הרקמות וגרורות סרטניות.
- PDMS הוא חומר רב-תכליתי המשמש ליצירת תשתיות בעלות קשיות משתנה.
- מחקר זה נועד לספק שיטה הניתנת לשחזור לניתוח התנהגות תאים בתגובה לקשיחות התשתית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה לחקר דורוטקסיס (durotaxis) של תאים.
- בחינת ההשפעה של קשיחות התשתית על נדידת תאים.
- מתן אפשרות לדימות של תאים נודדים בזמן אמת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מצעי PDMS בעלי קשיחות מוגדרת.
- מזיגת PDMS לתוך פלטות של שישה בארות והסרת בועות אוויר.
- הנחת ליתיות כיסוי סטריליות על גבי ה-PDMS.
- זריעת תאים לתוך תאי ה-Durotax לצורך תצפית.
תוצאות עיקריות
- תאים נדדו באופן מועדף לעבר מצעי ה-PDMS הקשיחים יותר.
- מיקרוסקופיה של תאים חיים סיפקה תובנות לגבי דינמיקת הנדודה.
- המערכת אפשרה מניפולציה מבוקרת של קשיחות המצע.
- הממצאים תורמים להבנת התנהגות תאים בהקשרים ביולוגיים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מציע שיטה מהימנה לחקר דורוטקסיס של תאים.
- התובנות שיתקבלו עשויות להנחות מחקרים עתידיים בתחומי נדידת תאים והנדסת רקמות.
- השימוש במצעי PDMS יעיל להשפעה על התנהגות תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת הדורוטקסיס (durotaxis) המפושטת זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביופארמה להעריך את החשה המכנית (mechanosensing) ואת הנדידה הכיוונית של תאים בתגובה לקשיחות התשתית, גורם מפתח בפלישת גידולים ובאינטראקציות עם הסטורמה. באמצעות אספקת מודל in vitro הניתן לשחזור עם ממשק קשיחות מוגדר בין PDMS לזכוכית, המערכת תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים של חלבונים המעורבים במסלולי העברה מכנית (mechanotransduction). יכולת ההתאמה של הבדיקה לסוגי תאים שונים ולאסטרטגיות knockdown מגבירה את תועלתה בשלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מודולטורים של דורוטקסיס כמטרות טיפוליות פוטנציאליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוגע לחלבונים רגישים למכניקה כגון cdGAP בוויסות של דורוטקסיס (durotaxis).
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרה על ידי קישור בין השתקה (knockdown) של חלבון לבין אובדן העדפה לנדידה כיוונית.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים כמותיים של אירועי חצייה להערכת השפעת המטרה על התנהגות נדידה של תאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר ממשקי PDMS-glass סטנדרטיים המתאימים לדימות תאים חיים ברזולוציה גבוהה ולמעקב אחר נדידה.
- שחזוריות: מבטל את הצורך בקשירה כימית (cross-linking) או בג'לים בעלי מדרג ריכוזים, ובכך משפר את עקביות הבדיקה בין ניסויים שונים.
- סקילביליות: תואם לפורמט של פלטה בעלת שישה בארות, מה שמאפשר בדיקה מקבילה של מספר תנאים או הפרעות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה דורוטקסיס (durotaxis), תהליך המעורב בפלישה של תאי סרטן ובממאירות המונעת על ידי הסטרומה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים של חישה מכנית (mechanosensing) משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים של גרורות ושחזור רקמות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק תובנות מכניסטיות לתעדוף מטרות בהתבסס על תפקידן במסלולי חישה של קשיחות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרה ועד לזיהוי מוביל (lead), ובמיוחד עבור מסלולים הקושרים בין מכניקה של המטריצה החוץ-תאית לבין פנוטיפים של נדידת תאים.
- ביולוגיה גילויית: תומכת בבחינת השערות לגבי חיישנים מכניים (mechanosensors) ומסנני GTPase בתהליכי דורוטקסיס (durotaxis) באמצעות קריאות של דימוי תאים חיים.
- סריקה: מאפשרת מערכות מוכנות לבדיקה להערכת השפעות של תרכובות או השפעות גנטיות על נטיית הנדידה לעבר מצעים קשיחים.
- אנליטיקה: מספקת פלטיים כמותיים, כגון ספירת אירועי חצייה ואחוזי נדידה כיוונית לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני חישוש מכני (mechanosensing) in vitro להקשרים פתופיזיולוגיים, כגון פלישת גידולים, שבהם דורוטקסיס ממלא תפקיד.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת מטרות רגישות מכנית בתוכניות של אונקולוגיה, פיברוזיס וריפוי פצעים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתפקידי מטרה בתוך רשתות של התמרות מכניות (mechanotransduction) על ידי הפחתת העמימות בפנוטיפים של נדידה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מערכת מצע פשוטה ללא מדרג (gradient-free).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הבהרת קשרים מכניסטיים בין מטרות לתהליכים פתולוגיים המונעים על ידי דורוטקסיס (durotaxis).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מטרות מותאם סיכון על בסיס תיקוף פונקציונלי במבחן חישוש מכני (mechanosensing assay) הרלוונטי למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, דימוי תאים חיים, וטכניקות של RNAi או הפרעה גנטית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים הפוכים עם בקרת סביבה לצורך דימוי ניגודיות פאזה לטווח ארוך.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההכנה והציפוי של PDMS כדי להבטיח קשיחות תשתית עקבית.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הבדיקה לתאים ראשוניים או למודלים של נדידה בתלת-ממד.
- מוגבל לדורוטקסיס על פני שטח דו-ממדי; אינו לוכד עיצוב מחדש של מטריצה תלת-ממדית מורכבת או מנגנוני פלישה פרוטאוליטיים.
