Name: מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: למדו שיטה פשוטה לחקר דורוטקסיס תאי במבחנה באמצעות רכסות PDMS בעלות קשיחות מוגדרת. טכניקה זו מאפשרת צפייה בזמן אמת בהעדפה של תאים יונקים לרכסים קשים יותר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי NIH R01 GM47607, CA163296 וNSF 1,334,493 למטח. אנו מודים לחברי המעבדה טרנר לקריאה ביקורתית של כתב היד. כל הנתונים שמוצגים בדוח זה היו מיוצרים באישור וורמר et al. 2,014 11.

1. הכנת לשכות Durotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחת תרבית רקמת 6-גם אחד, הטרה האיזון עם צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. לשקול את כ -10 גרם של פתרון PDMS הבסיס בצינור 50 מ&quot;ל (הפתרון הוא די צמיג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל90: מצע 1 (Compliance של ~ 1 kPa), לחלק את המשקל שנמדד של פתרון בסיס PDMS בצינור ב -90 כדי לקבוע את הסכום הנכון של פתרון crosslinker צורך. מוסיף את הכמות המחושבת של פתרון crosslinker PDMS לאותו צינור. לדוגמא: 10 גר &#39;/ 90 = 0.11 גרם. להוסיף 0.11 גרם של פתרון crosslinker PDMS לפתרון בסיס PDMS. הערה: פתרונות הבסיס וcrosslinker שניהם מסופקים בערכת PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במרץ לערבב את תערובת הבסיס / crosslinker PDMS 5 דקות בRT בעזרת מרית קטנה. בשלב זה התערובת תכיל מספר רב של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מצע PDMS בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות ב 50 XG ב RT להסיר את bubbles. אם עדיין יש בועות לאחר 5 דקות, צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 פיפטה מיליליטר של 90: 1 מצע PDMS לבאר כל תרבית הרקמה שטופל 6-גם צלחת. ניתן לבטל את כל בועות אוויר שנותרו כיום בPDMS בשלב זה על ידי פקיעתם באמצעות מחט 21 G. לאפשר PDMS להפיץ למשך 30 דקות בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רתיחה # זכוכית 12 מ&quot;מ 1 coverslips במים מזוקקים למשך 5 דקות. חזור על שתי פעמים ולאחסן את coverslips במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד coverslip מיובש, לבאר כל צלחת תרבית הרקמה על ידי בעדינות נוגע בצד אחד של coverslip לפתרון PDMS לאחר מכן שחרר את coverslip PDMS. כcoverslip מתיישב, PDMS יתחיל לנגוס על הקצוות של coverslip, אבל לא יכסה אותו לחלוטין. זה יפיק ממשק בין PDMS והזכוכית לאחר הריפוי (ראה איור 1 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 70 מעלות צלזיוס בתנור במשך 16 שעות כדי לרפא (להקשיח) PDMS. מניחים את פלאטדואר בשכונת תרבות התא וUV לעקר במשך 10 דקות. הערה: עדיף לעשות את הצלחות בתוך כמה ימים של שימוש. עם זאת, הצלחות יכולות להיות עטופות בParafilm ללא כל חיץ ומאוחסנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות ללא כל ירידה מורגשת באיכות. </li></ol> 2. תא ציפוי הערה: אם בוחן את ההשפעה של מציאה בתיווך siRNA, לבצע את מציאה באמצעות הוראות היצרן או הפרוטוקול מותאם לסוג התא של בחירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל כל durotaxis קאמרי עם 1 מיליליטר של 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS ללא סידן ומגנזיום לשעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, פיברונקטין ניתן להחיל היום לפני ניתוח על ידי דוגרים PDMS עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין בPBS במשך 16 שעות על 4 מעלות צלזיוס. ודא את כל פני השטח הוא שקוע בפיברונקטין בפתרון PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BSA 1% חום מפוגל. שוקל 0.5 גרם BSA ולפזר אותו ב 50 מיליליטר של PBS.סנן לעקר את הפתרון דרך פילטר וחום 0.22 מיקרומטר על 80 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. הערה: הכן את הפתרון הזה ביום שלפני תא ציפוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון פיברונקטין ולשטוף 3 פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר של BSA-מפוגל חום בPBS לכל היטב דגירה במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ולספור תאים של בחירה תוך תאי durotaxis חוסמים עם BSA החום מפוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 x 10 5 תאים בנפח של 2 מיליליטר לכל טוב של חדר durotaxis, באמצעות התקשורת הנדרשת לסוג תא המסוים של בחירה. אפשר התאים לדבוק ולהתפשט על המצע במשך 4 שעות בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. הערה: תאי U2OS נשמרים באופן שיגרתי בDMEM עם 10% FBS, בתוספת L- גלוטמין 2 מ&quot;מ, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, ו -10 IU / פניצילין מיליליטר, 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. הערה: מספר התאים המשמש בדוגמא זו היא מותאמת לתאי U2OS. ייתכן שתהיה צורך אופטימיזציה לסוגי תאים אחרים. צפיפות זה נותנת את התאים מספיק מקום להעביר ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. </li></ol> הדמיה 3. Live- תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה תא חי על מיקרוסקופ הפוכה, באמצעות ניגוד שלב עם מטרת 10X. מיקרוסקופ צריך להיות מצויד עם תא humidified, סגור סביבתי, המאפשר שליטה על הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במהלך הדמיה לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים התפשטו לכ 3.5 שעות, להרכיב את הצלחת בתא מיקרוסקופ. לאפשר המדגם (ים) לאזן בתא למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ריבוי נקודות אוטומטיות, ביקור במיקרוסקופ אם זמין. דגש על הממשק שבין 90: 1 PDMS וcoverslip הזכוכית ולבחור נקודות לתמונה בכל רחבי הממשק עם ממוצע של 40 נקודות לdurotaxis קאמרית. תמונת התאים כל 10 דקות עד 16 שעות. הערה: מחדשגיון של עניין יופיע כשני קווים, עם הקו החיצוני המקביל לקצה של coverslip והקו הפנימי המקביל לממשק בפועל בין PDMS וcoverslip. ראה איור 1. </li></ol> ניתוח נתונים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור גיליון אלקטרוני כמו בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר אירועי מעבר מPDMS למשטח הזכוכית ולהיפך מכל סרט שנוצר. רשום את מספר אירועי מעבר בעמודה המתאימה בגיליון האלקטרוני Excel. הערה: אירוע מעבר מוגדר כגרעין התא עובר על הגבול בין PDMS והזכוכית בכל כיוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת מעברים מרובים, לספור את מספר הפעמים שהתא חצה את הממשק. מספר זה צריך להיות מוקלט בעמודת Excel המתאימה למצע שעליו התא היה ממוקם בסוף הסרט. חזור על הניתוח לכל תא שחוצה את הממשק בtסרטו. תכלול תאים שנודדים משדה הראייה במהלך הדמיה. הערה: חשוב גם כדי לוודא, על ידי תא לספור בתחילת הניסוי, שהתאים מסוגלים לדבוק באותה מידה לPDMS מצופה פיברונקטין ומשטחי הזכוכית coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את אחוז התאים שהגרו מPDMS למשטח הזכוכית (כלומר, עבר durotaxis). הוסף את מספר חציית אירועים מרכים לקשה ואירועי המעבר המרובים שהסתיימו ביום קשה ולחלק במספר הכולל של אירועי מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי המעברים מרובים על ידי חלוקת מספר המעברים מרובים במספר הכולל של מעברים. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

במסמך זה אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis בתאים נודדים. כוח עיקרי של assay זה הוא הקלות של הכנת תאי durotaxis באמצעות PDMS. הנוקשות של מצעים ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי היחס של פתרון בסיס PDMS לcrosslinker כדי לאפשר המחקר של קשיחויות שונות בassay. עם זאת, הגבלת פוטנציאל אחד של המערכת היא שתאים נחשפים רק לשינוי יחיד בקשיחות מצע בניגוד לחווה שיפוע נוקשות המסופק על ידי מערכות מתוחכמות יותר 4. חשוב לציין, שלא כמו מצעי polyacrylamide, רכיבי ECM לא צריכים להיות כימי צ...

מטריקס (ECM) מורכב ממערך מורכב של חלבונים מבניים וcrosslinking כולל קולגן, פיברונקטין וlaminin. למרות שזה מבוסס היטב כי ECM מספק תמיכה מבנית חשובה לרקמות סלולריות, יש ראיות גוברים למצביעות על כך שתאים באופן פעיל להגיב לשינויים פיזיים בסביבת ECM להסדיר תהליכים תאיים שונים כולל הישרדות תא, התמיינות ונדידת תאים. לדוגמא, הבדלים בקשיחות של ECM יכולים לנהוג בתאי גזע mesenchymal כלפי שושלות שונות, עם מצעים רכים (~ 1 kPa) קידום שושלות עצביות בעוד מצעים נוקשה (~ 25 kPa) לקדם בידול osteogenic 1. כמו כן, עלייה בקשיחות מטריצת סטרומה הוכחה לקדם tumorigenesis החלב אפיתל תאים ופלישה ל2,3 הרקמה הסובב. היבט מעניין במיוחד של mechanosign זהתוצאות פעילות aling בתהליך המכונה durotaxis, שבו תאים לנדוד מועדף כלפי מצע קשיח יותר 4,5. תאים לחוש כל הזמן את המאפיינים הפיזיים של הסביבה תאית שלהם באמצעות קולט integrin מחייבים את ECM. זה, בתורו, מקדם את ההצטברות של חלבונים מבניים ואיתות רבים לתחומים cytoplasmic לנהוג ההיווצרות של מבנים דבקים הידועים כהידבקויות מוקד או אנשי קשר מוקדי 6,7. מאז יש לי integrins אין פעילות האנזימטית טבועה, אותות מועברים מECM דרך חלבוני אבזר אלה כדי לתאם את התגובה של התא לסביבה המשתנה שלהם 8. בהתאם לכך, זיהוי והאפיון של חלבוני מפתח מעורבים בויסות mechanosignaling וdurotaxis הוא אזור חשוב של חקירה. מערכות מודל שונות פותחו כדי ללמוד durotaxis במבחנה, אך רוב יש לימצעים מנוצלים מצופה קולגן polyacrylamide 4. עם זאת, ההכנה של מצעי polyacrylamide יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית וקולגן המשמש במבחנים אלה חייב להיות כימיים crosslinked למצע 9. Polydimethylsiloxane מצעים (PDMS) הוכחו תערוכה תכונות מכאניות דומות למצעי polyacrylamide 10. עם זאת, מצעי PDMS מוכנים על ידי ערבוב פשוט יחס של הבסיס לcrosslinker ויכולים להיות מצופים מצעים אלה עם חלבוני ECM ללא הצורך בcrosslinking הכימי, ובכך PDMS כלי קל יותר לחקור את ההשפעות של נוקשות בהתנהגות תא. בזאת, אנו מתארים כיצד להכין קאמרי durotaxis פשוט שבמצע PDMS רך משולב עם coverslip זכוכית נוקשה. Assay, כמפורט להלן, מספק שיטה מהירה ופשוטה ללמוד durotaxis. במחקר זה השתמשנו בתאים אנושיים אוסטאוסרקומה U2OS בשילוב עם תיווך siRNAמציאה של cdGAP כדי ללמוד את התפקיד של חלבון הידבקות מוקד זה בdurotaxis 11. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לדרישות פרט. סוגי תאים אחרים יכולים להחליף את תאי U2OS וכל חלבון יכול להיות הפיל או ביטוי יתר כדי לקבוע את ההשפעות על התנהגות תא במהלך durotaxis. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשלב חלבונים מתויגים fluorescently לנתח את הדינמיקה שלהם וFRAP באמצעות התנהגות או סריג גישות.

<table><tbody><tr><td>פולידימתילסילוקסן (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td></tr> <tr><td>#1 כיסוי זכוכית 12 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>נתרן Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות בז</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>תאי U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת mechanosensing וdurotaxis<em&gt; במבחנה</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

מאפייני הרכב ומכאני של מטריקס הם משתנה מאוד בין סוגי רקמות. גיוון זה חיבור סטרומה הרקמה מאוד תא השפעות התנהגות להסדיר תהליכים נורמלים ופתולוגיים כוללים התפשטות תאים, התמיינות, איתות הידבקות והגירה כיוונית. בהקשר זה, היכולת המולדת של סוגים מסוימים של תאים לנדוד לכיוון מצע מטריצה ​​נוקשה, פחות או תואם נקרא durotaxis. תופעה זו ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, תיקון פצע ופלישה של תאים סרטניים. כאן אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis, במבחנה, באמצעות polydimethylsiloxane מצעים (PDMS). הכנת תאר durotaxis תאים יוצרת ממשק בין נוקשות ג&#39;ל PDMS הרך יחסית וcoverslip זכוכית נוקשה. בדוגמא בתנאי, השתמשנו תאי durotaxis אלה להפגין תפקיד לCdc42 הגנה של מחזור / Rac1 GTPase הפעלהב, cdGAP, בmechanosensing וdurotaxis רגולציה בתאי אוסטאוסרקומה U2OS אנושיים. assay זה הוא בקלות להתאמה לסוגי תאים אחרים ו / או מציאה של חלבונים אחרים של אינטרסים לחקור התפקידים שלהם בmechanosignaling וdurotaxis.

סכמטי של תא durotaxis מוצג באיור 1 א. מצע PDMS רך (90: תערובת 1 של בסיס PDMS לcrosslinker פתרונות) היא להפיץ בצלחת 6 היטב וcoverslip זכוכית מונח על גבי PDMS, אשר לאחר מכן באופן חלקי מכסה את פני השטח העליונים של coverslip, ובכך ליצור ממשק בין שני מצעים של ציות שונה. הקשיחות של מצע PDMS הרך היא ~ 1 kPa, אשר ניתן להשוות העמידה הטיפוסית של רקמת המוח, ואילו את הנוקשות של זכוכית היא סביב 1-2 1 GPA. תמונה בניגוד שלב של הממשק בין PDMS והזכוכית מוצגת על ידי ראשי...

תאי יונקים רבים מעדיפים לנדוד לעבר מטריצה או מצע נוקשה יותר באמצעות דורוטקסיס. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת חוץ גופית פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור ולתפעל התנהגויות דורוטקסיס של תאים על ידי שילוב מצעי פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעלי קשיחות מוגדרת, המתממשקים עם כיסויי זכוכית.

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis<em&gt; במבחנה</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לספק מערכת מפושטת לניתוח קשיחות תאים, שדרכה תאי יונקים רבים נודדים באופן מועדף לעבר תשתית קשיחה יותר. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תשתיות Polymethyl siloxane או PDMS בעלות קשיחות מוגדרת. לאחר מכן, ה-PDMS שהוכן נשפך לתוך כל באער של פלטת שש באערים, וכל בועות האוויר מוסרות.לאחר מכן משלימים את תאי ה-Durex על ידי הנחת זכוכית כיסוי סטרילית מעל ה-PDMS בכל באר כדי ליצור שכבה עליונה. השלב האחרון הוא זריעת תאים אל תוך תאי ה-Durex בצפיפות המאפשרת לתאים מספיק מרחב להגירה ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של תאים חיים כדי לחקור את הציר בתאים נודדים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פולי-אקרילאמיד, הוא קיומו של שלב בודד בין ה-PDMS הרך לזכוכית הקשיחה, במקום חלופות של ג'ל עם מדרג (gradient gel). כמו כן, ציפוי PDMS ברכיבי מטריצה חוץ-תאית כגון פיברונקטין אינו דורש קשירה כימית (chemical cross-linking), הנדרשת עבור ג'לים של פולי-אקרילאמיד. כדי להכין פלטת תרבית רקמות בעלת שישה בארות, ראשית, שקלו את המאזן באמצעות מבחנה קונית של 50 milliliter.שקלו כ-10 גרם של תמיסת בסיס פולידימეთילסילוקסאן (PDMS) לתוך מבחנה של 50 מיליליטר. עבור תת-מצע ביחס של 90 ל-1, חלקו את המשקל הנמדד של תמיסת בסיס ה-PDMS ב-90. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של תמיסת מסמך הצילוב (crosslinker) הדרושה, הוסיפו את הכמות המחושבת של תמיסת מסמך הצילוב של ה-PDMS למבחנה וערבבו נמרצות את תערובת בסיס ה-PDMS ומסמך הצילוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.בשלב זה, בשימוש בשפכטל קטן, התערובת תכיל מספר קטן של בועות אוויר. סובב את מצע ה-PDMS בצנטריפוגת שולחנית למשך חמש דקות ב-50 $\times$g. השאר בטמפרטורת החדר כדי להסיר את הבועות אם הן עדיין קיימות.לאחר חמש דקות של צנטריפוגה נוספת, העבירו בפיפט 1 mL של תת-מצע PDMS ביחס של 90:1 לכל באער של פלטת 6 באערים שעברה טיפול לתרבית רקמות. ניתן להסיר בשלב זה בועות אוויר שנותרו ב-PDMS על ידי פיצוצן עם מחט בכיול 21 gauge.המתינו 30 דקות כדי לאפשר ל-PDMS להיפרס בתוך הבאר. לאחר מכן, הרתיחו כיסויות זכוכית מספר 1 במידה של 12 מילימטר במים מזוקקים במשך חמש דקות, בסך הכל שלוש פעמים. הניחו כיסויית אחת יבשה לתוך כל באר בלוח לתרבית רקמות על ידי נגיעה עדינה באחד מצדי הכיסוי.החליקו את הזכוכית לתוך תמיסת ה-PDMS ולאחר מכן הניחו אותה על ה-PDMS. ככל שזכוכית הכיסוי תתייצב, ה-PDMS יתחיל להתרחב מעל קצוות הזכוכית, אך לא יכסה אותה לחלוטין. פעולה זו תיצור ממשק בין ה-PDMS לזכוכית לאחר הפולימריזציה.דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 70 °C בתנור למשך 16 שעות כדי להקשות את ה-PDMS. לבסוף, הניחו את הפלטה במנדף לתרביות תאים וסטריליזרו באמצעות UV למשך 10 דקות. ציפו כל תא durox ב-1 mL של פיברונקטין בתוך phosphate buffered saline ללא סידן ומגנזיום למשך שעה אחת בטמפרטורה של 30 °C.ודאו שכל השטח טבול בתמיסת פיברונקטין ב-PBS. הכינו אלבומין מסרום בקר (BSA) בריכוז 1% שעבר דנטורציה תרמית, על ידי שקילה של 0.5 גרם BSA והמסה שלו ב-50 מיליליטר של PBS מסונן. סטריליזו את התמיסה באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון לפני החממה בטמפרטורה של 80 °C למשך 12 דקות.בשלב הבא, שאבו את תמיסת הפיברונקטין ושטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של BSA שעבר דנטורציה תרמית ב-PBS לכל באר והדרימו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, בצעו טריפסינזציה וספרו את התאים הרצויים בזמן שהתאים נחסמים על ידי ה-BSA שעבר דנטורציה תרמית. שאבו את תמיסת ה-BSA מהתאים רגע לפני זריעת התאים.זריעו 10,000 תאים בנפח של שני מיליליטר לכל באער בתא ה-doax. בעזרת המדיום הנדרש לסוג התאים הנבחר, אפשרו לתאים להיצמד ולהתפשט על התשתית במשך ארבע שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2, ובצעו דימוי של תאים חיים במיקרוסקופ הפוך בשיטת ניגודיות פאזה (phase contrast) עם עדשה של 10x. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בתא סביבתי לח וסגור, המאפשר בקרת טמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 במהלך דימוי לטווח ארוך.דימוג: לאחר שהתאים התפשטו במשך כ-3.5 שעות, מקמו את הפלטה בתא המיקרוסקופ. המתינו 30 דקות להגעה לשיווי משקל של הדגימות בתא. הגדירו ביקור אוטומטי של מספר נקודות במיקרוסקופ, אם קיים.התמקדו בממשק שבין ה-PDMS לבין כיסוי הזכוכית ובחרו נקודות לצילום מסביב לממשק. בצילום של בממוצע 40 נקודות לכל תא Durex, ובביצוע צילום של התאים מדי 10 דקות למשך עד 16 שעות, אזור העניין (ROI) יופיע כשני קווים, כאשר הקו החיצוני תואם לקצה כיסוי הזכוכית והקו הפנימי תואם לממשק הממשי בין ה-PDMS לבין כיסוי הזכוכית. כדי לנתח את הנתונים, צרו גיליון נתונים בדומה לזה המוצג בפרוטוקול הכתוב.ספרו את מספר אירועי החצייה ממשטח ה-PDMS למשטח הזכוכית ולהפך מכל סרטון שהופק. אירוע חצייה מוגדר כמעבר של גרעין התא מעל הגבול שבין ה-PDMS לזכוכית בכל אחד מהכיוונים. רשמו את מספר אירועי החצייה בעמודה המתאימה בגיליון ה-Excel כדי לכמת חציות מרובות.ספרו את מספר הפעמים שבהן התא חצה את הממשק. מספר זה יירשם בעמודת ה-Excel המתאימה למצע שבו שהה התא בסיום הסרטון. חזרו על הניתוח עבור כל תא שחוצה את הממשק בסרטון.יש להוציא תאים שנדדו אל מחוץ לשדה הראייה במהלך הדימוי. חשבו את אחוז התאים שנדדו מה-PDMS אל פני השטח של הזכוכית ולכן עברו Durotaxis. כדי לעשות זאת.חברו את מספר אירועי החצייה מרך לקשיח ואת אירועי החצייה המרובים שהסתיימו על קשיח, וחלקו במספר הכולל של אירועי החצייה. חשבו את אחוז החציות המרובות על ידי חלוקת הסכום הכולל של חציות מרובות במספר הכולל של החציות, כדי להתחיל להבין את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו תאים מגיבים לרמזים מכניים בסביבתם. ניתן להשתיק חלבונים ספציפיים באמצעות IRNA כפי שמוצג כאן.בסביבות 70% מהתאים בביקורת שטופלו ב-irna הראו ציר (axxis). בניגוד בולט לכך, כאשר CD gap הושקט באמצעות RNAi, לתאים לא הייתה העדפה לגבי נדידתם על תשת קשה או רכה. יתרה מכך, התאים שבהם הושקט CD gap חצו את הגבול מספר פעמים.בעוד שתאים של ביקורת המטופלים ב-irna חוצים בדרך כלל את הגבול פעם אחת בלבד, מסלולים מייצגים של תאי ביקורת irna מראים כי התאים נודדים בדרך כלל פעם אחת לחוצה הגבול ונשארים באופן מועדף על הפני השטח הקשיח יותר בהשוואה לתאים המטופלים ב-CD gap. תאים המטופלים ב-irna שלא הפגינו העדפה לקשיחות כלשהי חצו את הגבול מספר פעמים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תשתיות ה-PDMS, הרכבת תאי ה-duris וכמותיתת ה-DUR taxes.

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

על מנת לזהות מוטציות חדשות המשפיעות על תחושה מכנית, תכננו בדיקה המודדת את התגובה ההתנהגותית לגירוי מישוש של זיפי זבובים בשיבוטים מוטנטיים שנוצרו בשיטת MARCM. שילוב הטכניקות מאפשר לזהות מוטציות רגישות למכניקה שאחרת היו קטלניות.

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

ערכת הכלים האינטגרטיבית לניתוח אותות סלולריים (iTACS) הופכת את התהליך של מדידה בו זמנית של מגוון רחב של אותות כימיים ומכאניים בתאים דבקים. iTACS נועדה להקל על פיתוח מונחה קהילה ולאפשר לחוקרים להשתמש בכל תכונות הפלטפורמה ללא קשר לרקע החינוכי שלהם.

ערכת כלים אינטגרטיבית לניתוח אותות תאיים: כוחות, תנועה, מורפולוגיה ופלואורסצנטיות

עבודה זו מציגה פרוטוקול גמיש לשימוש בטכנולוגיית משטחים אלסטומריים (FLECS) בעלי תווית פלואורסצנטית בפורמט מיקרווול לכימות פשוט יותר של כוחות התכווצות של תאים חד-תאיים המבוססים על תזוזות חזותיות של מיקרופטרנים של חלבון פלואורסצנטי.

ניתוח פשוט בעל תפוקה גבוהה של התכווצות של תאים חד-תאיים באמצעות אלסטומרים מיקרו-מרופדים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.

מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה

מוצגת כאן שיטה לפנוטיפ מכני של תאים בודדים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מבוססת אלקטרוניקה הנקראת חישת נקבוביות מכאנו-צומת (mechano-NPS). פלטפורמה זו שומרת על תפוקה מתונה של 1-10 תאים לשנייה תוך מדידת התכונות הביופיזיות האלסטיות והצמיגיות של התאים.

חישת נקבוביות Mechano-node: פלטפורמה מהירה ונטולת תוויות למדידות ויסקואלסיות של תאים בודדים מרובי פרמטרים

למדו שיטה פשוטה לחקר דורוטקסיס תאי במבחנה באמצעות רכסות PDMS בעלות קשיחות מוגדרת. טכניקה זו מאפשרת צפייה בזמן אמת בהעדפה של תאים יונקים לרכסים קשים יותר.

מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis

גלה סרטונים נוספים