מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis במבחנה
27 באוגוסט 2015
תאי יונקים רבים מעדיפים לנדוד לעבר מטריצה או מצע נוקשה יותר באמצעות דורוטקסיס. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מערכת חוץ גופית פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לחקור ולתפעל התנהגויות דורוטקסיס של תאים על ידי שילוב מצעי פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעלי קשיחות מוגדרת, המתממשקים עם כיסויי זכוכית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק מערכת פשוטה לניתוח דורקס תאים שדרכה תאי יונקים רבים נודדים באופן מועדף לעבר מצע נוקשה יותר. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של מצעי פולימתיל סובוקסן או PDMS בעלי קשיחות מוגדרת. לאחר מכן, ה- PDMS המוכן מוזג לכל באר של צלחת שש בארות וכל בועות האוויר מוסרות.
לאחר מכן, תאי Durex מושלמים על ידי הצבת החלקת כיסוי מעוקרת על גבי ה-PDMS בכל באר ליצירת שכבת-על. השלב האחרון הוא לזרוע תאים לתוך תאי המס של דורו בצפיפות שנותנת לתאים מספיק מקום לנדוד ללא אינטראקציות משמעותיות עם תאים אחרים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ תאים חיים משמש לחקר אקססיס בתאים נודדים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פולי אקרילאמיד, הוא שיש שלב אחד בין ה-PDMS הרך לזכוכית קשיחה במקום חלופות ג'ל שיפוע. כמו כן ציפוי PDMS במטריצה חוץ-תאית רכיבים כמו פיברונקטין אינם דורשים קישור צולב כימי, הנדרש לג'לים פולי אקרילאמיד. כדי להכין תחילה צלחת תרבית רקמה אחת של שש בארות, קרעו את האיזון בעזרת צינור חרוטי של 50 מיליליטר.
שקלו כ-10 גרם מתמיסת הבסיס פולי דימתיל סובוקסן או PDMS בצינור של 50 מיליליטר. עבור מצע של 90 לאחד, חלקו את המשקל הנמדד של תמיסת הבסיס PDMS ב-90. כדי לקבוע את הכמות הנכונה של תמיסת הצלבה הדרושה, הוסף את הכמות המחושבת של תמיסת קרוסלינקר PDMS לתערובת הקרוסלינקר הבסיסית A-P-D-M-S המעורבת במרץ למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
בעזרת מרית קטנה בשלב זה, התערובת תכיל מספר קטן של בועות אוויר. צנטריפוגה את מצע ה-PDMS בצנטריפוגה ספסל למשך חמש דקות ב-50 פעמים. ז. הוסף את טמפרטורת החדר כדי להסיר את הבועות אם עדיין יש בועות.
לאחר חמש דקות הצנטריפוגה שוב פיפטה מיליליטר אחד של 90 למצע PDMS אחד לכל באר של תרבית הרקמה המטופלת. צלחת שש בארות. ניתן לחסל את כל בועות האוויר שנותרו ב-PDMS בשלב זה על ידי פיצוץ אותן עם מחט בגודל 21.
הניחו ל-PDMS להתפשט במשך 30 דקות בבאר. לאחר מכן מרתיחים 12 מילימטר מספר אחת, המכסה מחליק במים מזוקקים למשך חמש דקות, בסך הכל שלוש פעמים. הנח כיסוי מיובש אחד לכל באר של צלחת תרבית הרקמות על ידי נגיעה עדינה בצד אחד של המכסה.
החלק לתוך תמיסת ה-PDMS ולאחר מכן הפיל את החלקת הכיסוי על ה-PDMS. כאשר החלקת הכיסוי מתייצבת, ה-PDMS יתחיל לפלוש לשולי החלקת הכיסוי, אך לא יכסה אותה לחלוטין. זה ייצור ממשק בין ה-PDMS לזכוכית לאחר הריפוי.
דגרו את הצלחת בחום של 70 מעלות צלזיוס בתנור למשך 16 שעות כדי לרפא את ה-PDMS. לבסוף, הניחו את הצלחת במכסה המנוע של תרבית תאים ועיקרו UV למשך 10 דקות. יש לצפות כל תא דורוקס במיליליטר אחד של פיברונקטין במי מלח ללא סידן ומגנזיום למשך שעה אחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
ודא שכל המשטח שקוע בפיברונקטין בתמיסת PBS. הכן אלבומין סרום בקר 1% או BSA במשקל 0.5 גרם BSA והמסתו ב-50 מיליליטר של מסנן PBS. יש לעקר תמיסה דרך פילטר נקודתי של 22 מיקרון לפני חימום בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות.
לאחר מכן, יש לשאוב את תמיסת הפיברונקטין ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף מיליליטר אחד של BSA מפוגל בחום ב-PBS לכל באר ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עיני טריפסין וספור את התאים לבחירתך בזמן שתאי הדורקס חוסמים עם החום. BSA מפורק שואב תמיסת BSA מהתאים ממש לפני הציפוי של תאים.
צלחת 10,000 תאים בנפח של שני מיליליטר לכל באר של תא הדואקס. באמצעות המדיום הנדרש לסוג התא המסוים שנבחר, אפשר לתאים להיצמד ולהתפשט על המצע במשך ארבע שעות באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2, לבצע הדמיית תאים חיים במיקרוסקופ הפוך באמצעות ניגודיות פאזה עם מטרה של פי 10. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בתא לחות סביבתי סגור, המאפשר שליטה בטמפרטורה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במהלך הדמיה ארוכת טווח.
הדמיה, לאחר שהתאים התפשטו במשך כ -3.5 שעות, הרכיבו את הצלחת בתא המיקרוסקופ. אפשר לדגימות להתייצב בתא למשך 30 דקות. הגדר ביקור אוטומטי מרובה נקודות במיקרוסקופ אם זמין.
התמקד בממשק בין ה-PDMS להחלקת כיסוי הזכוכית ובחר נקודות לתמונה בכל רחבי הממשק. עם ממוצע של 40 נקודות לכל תמונת תא Durex, התאים כל 10 דקות למשך עד 16 שעות, אזור העניין יופיע כשני קווים כאשר הקו החיצוני מתאים לקצה החלקה של הכיסוי והקו הפנימי המתאים לממשק בפועל בין ה-PDMS לתלוש הכיסוי. כדי לנתח את הנתונים, צור גיליון אלקטרוני כמו זה שמוצג בפרוטוקול הטקסט.
ספרו את מספר אירועי המעבר מה-PDMS למשטח הזכוכית ולהיפך מכל סרט שנוצר. אירוע חצייה מוגדר כגרעין התא העובר מעל הגבול בין ה-PDMS לזכוכית בשני הכיוונים. רשום את מספר אירועי החצייה בעמודה המתאימה בגיליון האלקטרוני של Excel כדי לכמת מעברים מרובים.
ספור את מספר הפעמים שהתא חצה את הממשק. יש לרשום מספר זה בעמודת Excel המתאימה למצע שעליו ממוקם התא בסוף הסרט. חזור על הניתוח עבור כל תא שחוצה את הממשק בסרט.
אל תכלול תאים הנודדים אל מחוץ לשדה הראייה במהלך ההדמיה. חשב את אחוז התאים שנדדו מ-PDMS למשטח הזכוכית ולכן עברו דורו טקסס. לעשות זאת.
הוסיפו את מספר אירועי החצייה מרך לקשה ואת אירועי החצייה המרובים שהסתיימו בקשה וחלקו במספר הכולל של אירועי החצייה. חשב את אחוז המעברים המרובים על ידי חלוקת סך הכלאות מרובות במספר הכולל של הצלבות כדי להתחיל להבין את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו תאים מתאימים לרמזים מכניים בסביבתם. ניתן להפיל חלבונים ספציפיים באמצעות IRNA כפי שמוצג כאן.
כ-70% מהתאים שטופלו ב-IRNA הפגינו axxis. בניגוד בולט, כאשר פער CD הופל באמצעות RNAi, לתאים לא הייתה העדפה אם הם נודדים למצע הקשה או הרך. יתר על כן, תאי הדפיקות של פער ה-CD חצו את מכפיל הגבול.
בעוד שתאי ביקורת שטופלו ב-irna בדרך כלל חוצים את הגבול רק לאחר מסלולי שליטה מייצגים. תאי אירנה מראים שהתאים בדרך כלל נודדים מעבר לגבול פעם אחת ומעדיפים להישאר על המשטח הנוקשה יותר בהשוואה לפער CD. אירנה טיפלה בתאים שלא הראו העדפה לקשיחות וחצו את הגבול מספר פעמים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את מצעי ה-PDMS, להרכיב את תאי הדוריס ולכמת מיסי DUR.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מערכת פשוטה in vitro לחקר דורטקסיס של תאים, שבה תאים של יונקים נודדים באופן עדיף לעבר מצעים נוקשים. על ידי שימוש במצעי פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעלי נוקשות מוגדרת, חוקרים יכולים לתמרן ולהתבונן בהתנהגויות נדידת התאים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מדעי המוח
- מדעי החומרים
רקע
- דורטקסיס היא התופעה שבה תאים נעים לעבר מצעים נוקשים יותר.
- הבנת נדידת תאים היא חיונית לתובנות בהנדסת רקמות ובמטסטזות של סרטן.
- PDMS הוא חומר רב-תכליתי המשמש ליצירת מצעים בעלי נוקשות משתנה.
- מחקר זה נועד לספק שיטה ניתנת לשחזור לניתוח התנהגות תאים בתגובה לנוקשות המצע.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה פשוטה לחקר דורטקסיס של תאים.
- לחקור כיצד נוקשות המצע משפיעה על נדידת התאים.
- לאפשר הדמיה חיה של תאים נודדים.
שיטות ששימשו
- הכנת מצעי PDMS בעלי נוקשות מוגדרת.
- שפיכת PDMS לצלחות שש-בארות והסרת בועות אוויר.
- הנחת זכוכיות מכסה מעוקרות על גבי PDMS.
- זריעת תאים לתוך תאי Durotax לצורך תצפית.
תוצאות עיקריות
- תאים נודדו בעדיפות לעבר מצעי PDMS הנוקשים יותר.
- מיקרוסקופיה של תאים חיים סיפקה תובנות לגבי דינמיקת הנדידה.
- המערכת אפשרה מניפולציה מבוקרת של נוקשות המצע.
- הממצאים תורמים להבנת התנהגות התאים בהקשרים ביולוגיים שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מציע שיטה אמינה לחקר דורטקסיס של תאים.
- התובנות שהושגו יכולות להדריך מחקרים עתידיים בתחום נדידת תאים והנדסת רקמות.
- השימוש במצעי PDMS יעיל למניפולציה של התנהגות התאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This simplified durotaxis assay enables biopharma R&D teams to evaluate cell mechanosensing and directional migration in response to substrate stiffness, a key factor in tumor invasion and stromal interactions. By providing a reproducible in vitro model with a defined rigidity interface between PDMS and glass, the system supports target validation and mechanistic de-risking of proteins involved in mechanotransduction pathways. The assay’s adaptability to various cell types and knockdown strategies enhances its utility in early discovery for identifying modulators of durotaxis as potential therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding mechanosensitive proteins like cdGAP in regulating durotaxis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking protein knockdown to loss of directional migration preference.
- Predictive Value: Generates quantitative crossing event data to assess target influence on cell migration behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized PDMS-glass interfaces suitable for high-resolution live cell imaging and migration tracking.
- Reproducibility: Eliminates need for chemical cross-linking or gradient gels, improving assay consistency across experiments.
- Scalability: Compatible with six-well plate format, enabling parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models durotaxis, a process implicated in cancer cell invasion and stromal-driven malignancy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanosensing findings to preclinical models of metastasis and tissue remodeling.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights to prioritize targets based on their role in rigidity-sensing pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking extracellular matrix mechanics to cell migration phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanosensors and GTPase regulators in durotaxis using live cell imaging readouts.
- Screening: Enables assay-ready systems for evaluating compound or genetic effects on migration bias toward rigid substrates.
- Analytics: Delivers quantifiable outputs such as crossing event counts and directional migration percentages for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanosensing data to pathophysiological contexts like tumor invasion where durotaxis plays a role.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mechanosensitive targets across oncology, fibrosis, and wound healing programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target roles within mechanotransduction networks by reducing ambiguity in migration phenotypes.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through a simple, gradient-free substrate system.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic links between targets and durotaxis-driven pathological processes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on functional validation in a disease-relevant mechanosensing assay.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, live cell imaging, and RNAi or genetic perturbation techniques.
- Depends on access to inverted microscopes with environmental control for long-term phase contrast imaging.
- Necessitates standardization of PDMS preparation and coating protocols to ensure consistent substrate rigidity.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to primary cells or 3D migration models.
- Limited to 2D surface durotaxis; does not capture complex 3D matrix remodeling or proteolytic invasion mechanisms.
