Name: ייצור של Nurr-1 Polyclonal ספציפי נוגדנים חינם של צלב-תגובתיות נגד homologs לסוגרה, Nor1 וNur77 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: למד שיטה לשיפור ספציפיות נוגדנים נגד חלבונים הומולוגיים באמצעות הסרת נוגדנים מסוג צלב-תגובתיות. השיטה משתמשת בזיהוי אזורי חלבון שונים לחלוטין ובכרומטוגרפיה להפרדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH (NS070577 ו-NS084869).

הערה: ניתן למצוא ההרכב של כל הפתרונות שהובאו להלן בטבלת חומרים / ציוד. 1. חלבון טור נוגדן טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן חלבון טור ספין וכל מאגרים הנדרשים לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות לפני תחילת ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הסרום חיסוני 1: 1 עם החלבון IgG כריכת מאגר. (5 מיליליטר של סרום מומלץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות חלבון טור ספין על גבי הספסל כדי לסלק כל שרף שעשוי להיות תקוע בפקק. הסר את המכסה העליון ועדינות להצמיד את הסגירה התחתונה. מניחים את הטור בצינור איסוף 15 מ&quot;ל ולאפשר פתרון אחסון לניקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של החלבון IgG כריכת הצפת ולאפשר הפתרון לניקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הסרום חיסוני המדולל לעמודה ולאסוף את הזרימה דרך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להוסיף נפח דגימה המכיל ריכוז של נוגדנים פחות מ -80% מcapacit מחייב הנוגדן של העמודהy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם 15 מיליליטר של החלבון IgG כריכת הצפת או עד הספיגה ב 280 ננומטר היא מתחת 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ניטרול הצפת 100 μl לחמישה צינורות אוסף שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של IgG הצפת elution לחלבון עמודה ולאסוף שברי 1 מיליליטר בכל אחד מהצינורות המכילים ניטרול הצפת 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של כל חלק ב280 ננומטר ברים ובריכה עם הספיגה גבוהה מ -0.5. שמור את השברים ונקווה על קרח עד מוכן לדיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחדש העמודה על ידי הוספת 8 מיליליטר של IgG הצפת elution ולאפשר הפתרון לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הטור עם פתרון כריכת החלבון IgG עד תשואות pH eluent 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העמודה על ידי הוספת 5 מיליליטר של פתרון אחסון (0.02% אזיד הנתרן PBS). כאשר 3 מיליליטר כ יישאר בעמודה, התחתונה הכובע ולאבטח את המכסה העליון. אחסן את הטור ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אורך oצורך צינורות דיאליזה ו בהתאם להוראות היצרן. שימוש בצינורות בקוטר 16 מ&quot;מ שטוח להשתמש 5.47 סנטימטר של אורך צינור לכל מיליליטר של פתרון לדיאליזה. חותך את צינורות ולשטוף עם pH 7.4 PBS במשך 15 עד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפלים וקליפ קצה אחד של צינור הדיאליזה, להעביר IgG נקווה שמכיל שברים לצינורות דיאליזה equilibrated בpH 7.4 PBS ולסגור את הקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze בטמפרטורת חדר נגד 200 כרכים של pH 7.4 PBS עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את חיץ הדיאליזה (PBS pH הטרי 7.4) ודיאליזה לעוד 2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את חיץ הדיאליזה (PBS pH הטרי 7.4) ודיאליזת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את פתרון נוגדן dialyzed על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך בצעדי טיהור נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז הנוגדנים באמצעות הספיגה שלה ב 280 ננומטר ומקדם ספיגה הטוחנות של נוגדנים ב 280 ננומטר של 210,000 M -1 סנטימטר -1 12. </li></ol> 2. צימוד של החלבונים LBD לAminoLink צימוד שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי עמודות, אחת לNor1 ואחר לNur77. בצע את אותו הפרוטוקול לשני החלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את החלבון שמצמיד את השרף על קרח. קבע את ריכוז החלבון באמצעות מקדמה טוחנת הכחדה והספיגה שלה ב 280 ננומטר 12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש assay נחישות חלבון כגון assay חומצת bicinchoninic 13. אם החלבון הוא מומס בחילופי dialyze חיץ המכיל אמין או חיץ נגד הצפת זיווגים. אם החלבון הוא בחיץ מתאים (לא אמינים חינם) לדלל אותו פי 4 בצימוד מאגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מיליליטר של שרף עבור 2 מ&quot;ג של חלבון. כל השלבים הבאים הם עבור שרף 2 מיליליטר בעמודת 10 מיליליטר. עד 10 מ&quot;ג של חלבון יכול להיות מקושר לכל 1 מיליליטר של שרף (2 מיליליטר של 1: 1 תרחיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמודת 10 מיליליטר על ידי לחיצת frit לתחתית ופועל PBS pH 7.4 דרכו. כובע לאהוא חלק תחתון של העמודה ולהוסיף 2 מיליליטר של צימוד מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפח הרצוי של תרחיף (4 מיליליטר להשיג 2 מיליליטר של שרף) לעמודה, להסיר את הכובע התחתון ולתת לטמיון הטור. יש לשטוף את העמודה עם סך של 6 מיליליטר (3 שרף-מיטת נפח) של צימוד מאגר ולאפשר לטור לניקוז. לאחר חיץ הצימוד נקז, להחליף את הכובע התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2-4 מיליליטר של החלבון התלוי בצימוד מאגר לעמודה (לשמור aliquot של פתרון החלבון כדי להעריך את יעילות הצימוד על ידי השוואת ריכוז החלבון של eluate בשלב 2.11 או באמצעות הספיגה ב 280 ננומטר או assay bicinchoninic) . כובע ולערבב סוף על הסוף יש פתרון הומוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל צינור microcentrifuge 1.8 מיליליטר ריק ולעבור למנדף. להעביר NaCNBH 3 (על 0.05 ז) בזהירות בצינור-שקל מראש. סגור את הצינור ולשקול את הצינור המכיל NaCNBH 3. אל תפתחו את הצינור מחוץ למכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על המשקל שלNaCNBH 3 הועבר לתוך הצינור, להפוך את פתרון 5 M על ידי הוספת 1 ​​M NaOH. המשקל המולקולרי של NaCNBH 3 הוא 62.84 גרם לכן 0.05 גרם שווה (0.05 / 62.84 = 7.96 x 10 -4 שומות) 7.96 x 10 -4 שומות. כדי להפוך 5 M להוסיף פתרון (7.96 x 10 -4 / 5) 159 μl של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד הנפח הכולל של התגובה לוקח את שרף הנפח בחשבון. הוסף 10 μl 5 M NaCNBH 3 לכל מיליליטר של תגובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא: עבור 4 מיליליטר נפח תגובה להוסיף 40 μl 5 M NaCNBH 3. ל1 מיליליטר של שרף ושל 3 מיליליטר חלבון הוסיף, הנפח הכולל הוא 4 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הטור ולערבב סוף על הסוף. אבטח את הטור על הכתף צינור ולתת את התגובה להמשיך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר, להביא את הטור למכסת המנוע הכימי ובזהירות להסיר את הכובע כמו כמה גז ייתכן שנוצר. מסננים את העמודה לתוך צינור נקי ולשמור eluate למדוד את קון החלבוןcentration באמצעות הספיגה ב שיטת ננומטר 280 12 או assay חומצת bicinchoninic ולהשוות אותו עם ריכוז החלבון מתחיל בצעד 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף עם 4 מיליליטר של צימוד הצפת ולתת לטמיון הטור. </li></ol> 3. אתרי חסימה נותרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף עם 4 מיליליטר של חיץ מרווה. מסננים ולהחליף את הכובע התחתון. הוסף 2 מיליליטר של חיץ מרווה ולהשעות את השרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את סך נפח תגובה על ידי מדידת נפח השרף ומרווית חיץ הנפח ולאחר מכן להוסיף 10 μl 5 M NaCNBH 3 לכל מיליליטר של נפח תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות בטמפרטורת חדר למשך 30 סוף-על-קצה דק &#39;. לאחר 30 דקות, להביא את הטור במנדף. מוציא בזהירות את החלק העליון ולאחר מכן להסיר את הכובע התחתון ולתת לטמיון העמודה לתוך צינור פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם 5 כרכי שרף של פתרון לשטוף. צג שוטף לנוכחות של חלבונים שיורית על ידי מדידת abso של eluaterbance ב 280 ננומטר. חלבוני נחק נשטפים החוצה על ידי ריכוז מלח הגבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרף עם 6 מיליליטר של 7.4 אזיד degassed PBS pH מכיל 0.02% נתרן. שמור את הטור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. </li></ol> 4. טיהור של נוגדנים ספציפיים Nurr1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הטור בשילוב Nur77 LBD עם 10 מיליליטר של PBS pH 7.4 ולתת לטמיון הטור. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולמקם את טור Nur77 LBD סחוט בשילוב בצינור איסוף 15 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים, מכסה את הטור ומקום על הכתף ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את המכסים העליונים ותחתונים ולאסוף את הזרימה דרך. מניח בצד על קרח עד מוכן להוסיף לעמודה בשילוב Nor1 LBD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הטור בשילוב Nor1 LBD עם 10 מיליליטר של PBS pH 7.4 ולתת לטמיון הטור. מכסה את החלק התחתון של העמודה ולמקם את LBD Nor1 טור בשילוב בצינור איסוף 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הזרימה דרך מהפיכת Nur77 LBDטור הוביל, מכסה את הטור ומקום על הכתף על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הסר את המכסים העליונים ותחתונים ולאסוף את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז נוגדנים על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. </li></ol> ניתוח של מזוקקים אנטי-Nurr1 נוגדנים מבוסס ELISA 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חלבון 100 μl (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) לבארות של צלחת גם 96. אם בודק 3 חלבונים שונים, להוסיף חלבון 1 100 μl לA1 בארות לH4, של חלבון 2 100 μl, לA5 בארות לH8 ושל חלבון 3 100 μl לA9 בארות לH12. מכסה את הצלחת ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות מצופים פעמיים עם 300 μl לכל גם של PBS pH 7.4 ולהוסיף 300 μl של חיץ חסימת ELISA לבארות אנטיגן כל מצופות דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הצלחת חוסמת להכין רצוי דילול החל מנוגדן אנטי Nurr1 מטוהר (החל 10-100 מיקרוגרם / מיליליטר) במאגר חסימת ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות של חסימה, להחליף את חיץ בלוק ELISA עם של חיץ לחסום ELISA טרי 100 μl לכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לדילול נוגדן אנטי Nurr1 מטוהר 100 μl לכל הבארות בא השורה סדרו לדלל את הנוגדנים על ידי העברה של פתרון 100 μl משורה לבארות בשורת B ואחרי העברה של פתרון 100 μl מהשורה B לחתור C ממשיך עד לשורה ג &#39;לאחר ערבוב הפתרונות בבארות בשורת G להשליך 100 μl הנוסף. ולס בשורת H לקבל רק של חיץ חסימת 100 μl הראשוני. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת שלוש (3) פעמים עם 300 μl לכל גם של 0.05% Tween 20 בPBS pH 7.4 ולמחוק את הצלחת כדי להסיר חיץ לשטוף עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לסוסי צנון Peroxidase (HRP) IgG נגד הארנב עיזים מצומדות מדולל במאגר בלוק ELISA 100 μl (1: 8,000 דילול; מגוון הטיפוסי הוא בין 1: 5000 עד 1: 25,000). דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את ה הצלחתרי (3) פעמים כמתואר ב5.6. יש לשטוף את כל הבארות על ידי מילוי אותם עם 300 μl מים ללא יונים. כתם מים עודפים על ידי היפוך לצלחת על נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3 100 μl, 3 &#39;, 5, 5&#39; tetramethylbenzidine (חימם לטמפרטורת חדר) לכל בארות דגירה 15 עד 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 2 NH 2 SO 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו הספיגה ב 450 ננומטר הפחתת רקע ב 650 ננומטר. </li></ol>

<ol><li>Hawk, J. D., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NR4A+transcription+factors+in+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">The role of NR4A transcription factors in memory formation.</a> Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).</li>
<li>Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+brain-specific+transcription+factor%2C+NURR1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1.</a> Mol. Endocrinol. 6 (12), 2129-2135 (1992).</li>
<li>Zetterström, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+agenesis+in+Nurr1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice.</a> Science. 276 (5310), 248-250 (1997).</li>
<li>Kadkhodaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nurr1+is+required+for+maintenance+of+maturing+and+adult+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nurr1 is required for maintenance of maturing and adult midbrain dopamine neurons.</a> J. Neurosci. 29 (50), 15923-15932 (2009).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Björklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease--from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease--from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. 9 (11), 629-636 (2013).</li>
<li>Peña de Ortiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Expression+of+the+Orphan+Nuclear+Receptor+Gene+hzf-3%2Fnurr1+during+Spatial+Discrimination+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Expression of the Orphan Nuclear Receptor Gene hzf-3/nurr1 during Spatial Discrimination Learning.</a> Neurobiol Learn Mem. 74 (2), 161-175 (2000).</li>
<li>Vecsey, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+enhance+memory+and+synaptic+plasticity+via+CREB%3ACBP-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors enhance memory and synaptic plasticity via CREB:CBP-dependent transcriptional activation.</a> J. Neurosci. 27 (23), 6128-6140 (2007).</li>
<li>Colón-Cesario, W. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Nurr1+in+the+rat+hippocampus%3A+implications+to+spatial+discrimination+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Nurr1 in the rat hippocampus: implications to spatial discrimination learning and memory.</a> Learn Mem. 13 (6), 734-744 (2006).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> J. Neurosci. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Hawk, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NR4A+nuclear+receptors+support+memory+enhancement+by+histone+deacetylase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">NR4A nuclear receptors support memory enhancement by histone deacetylase inhibitors.</a> J. Clin. Invest. 122 (10), 3593-3602 (2012).</li>
<li>Bridi, M. S., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NR4A+orphan+nuclear+receptors+mediate+transcription-dependent+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The NR4A orphan nuclear receptors mediate transcription-dependent hippocampal synaptic plasticity.</a> Neurobiol Learn Mem. 105, 151-158 (2013).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Anal. Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Zetterström, R. H., Williams, R., Perlmann, T., Olson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+the+immediate+early+transcription+factors+Nurr1+and+NGFI-B+suggests+a+gene+regulatory+role+in+several+brain+regions+including+the+nigrostriatal+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of the immediate early transcription factors Nurr1 and NGFI-B suggests a gene regulatory role in several brain regions including the nigrostriatal dopamine system.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 41 (1-2), 111-120 (1996).</li>
<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמכת על הזמינות של חלבונים טהורים לאפיון הנוגדנים שהועלו נגד חבר ספציפי של משפחת החלבון של עניין. אין צורך לטהר את הנוגדנים באמצעות חלבון / G עד שברור נקבע כי יש reactivities הצולב משמעותי על ידי ELISA ומערבי סופג. כאמור בטקסט, חשוב להימנע מהשעיית החלבון (ים) להיות בין-צמוד לטור במאגר המכיל אמין כמו טריס או גליצין. יתר על כן ריכוז החלבון האופטימלי המשמש לcross-linking צריך להיקבע באופן אמפ...

גורם שעתוק Nurr1 וhomologs שלה (Nur77 וNor1) שייכים ל4A קולט הגרעיני תת משפחה (NR4A) 1. הם גם קולטנים יתום כי ligands אנדוגני אינו מזוהים עדיין. Nurr1 היה משובט ראשון בשנת 1992 ולמרות שידוע שבאו לידי ביטוי במוח 2, תפקידה החיוני לפיתוח ותחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון התגלה על ידי מחקרי עכבר נוקאאוט 3. בנוסף, התפקיד החשוב שלה לצורך התחזוקה של נוירונים דופמין המוח התיכון הודגם לאחרונה על ידי מחקר בנוקאאוט מותנה 4. בשל מחקרים האלגנטיים אלה מראים התפקידים הקריטיים של Nurr1 לנוירונים דופמין המוח התיכון, מחקרים רבים שלאחר מכן התמקדו במידה רבה בנוירונים דופאמין והפרעה ניוונית של מערכת עצבים הקשורים לדופמין המוח התיכון, מחלת פרקינסון (PD) 5. יש לציין, Nurr1 מתבטא לא רק בתאי עצב דופמין המוח התיכון (מד&quot;א), אלא גם בdiאזורים במוח פסוק 2, מה שמרמז שאולי יש לו תפקידים פונקציונליים בתחומים רבים שאינו התובע, אשר נתמך במידה רבה על ידי יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי Nurr1 משחק תפקידים חשובים בתפקודי מוח שונים. לדוגמאות, זה הוצג פעילויות התרמה-זיכרון שכגון למידה, או משימות היפוקמפוס תלוי אחרות לגרום לעד-רגולציה של ביטוי Nurr1 ב6,7 היפוקמפוס. בנוסף, להפיל את ביטוי Nurr1 בהיפוקמפוס היה מספיק כדי לפגוע בזיכרון לטווח ארוך ו / או פלסטיות הסינפטית 8-11, חזק המצביע על כך Nurr1 משחק תפקידים מגוונים באזורי מוח רבים. לכן, כדי להבין את ביטוי תאים מסוג ספציפי וsubcellular של Nurr1 נוסף, רצוי להשתמש נוגדני Nurr1 ספציפי, שאינו מפגינים כל תגובה צולבת לhomologs Nur77 או Nor1. מאמר זה מתאר פרוטוקול מראש ספיחה לייצר נוגדני Nurr1 ספציפי ונתונים נוספים מראים הנוכחיים הספציפי שלו.

<table><tbody><tr><td>תחום קשירת ליגנד מטוהר מפתרון אחסון עמודות Nurr1, Nor 1 ו-Nur77</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AminoLink צימוד שרף וערכה</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>חלבון עמוד ספין</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered</td><td>Saline Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחות תחתונות, אוגן גבוה, 330 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10% סרום עיזים רגיל</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>תרכיז מדלל / חוסם חלב&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>צנון סוסים Peroxidase מצומד עז נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA שרף</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A IgG מאגר מחייב</td><td>Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Elution Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> אחסון <td>עמודה פוספט חוצץ מי מלח המכילים 0.02% נתרן אזיד</td></tr><tr><td>ספקטרה/פור 7 צינורות דיאליזה מטופלים מראש</td><td>ספקטרום מעבדות</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל עמודות חד פעמיות</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>AminoLink מאגר</td><td></td><td></td> צימוד <td>0.1M נתרן פוספט, 0.05% NaN3, pH 7.0</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> מרווה <td>1M Tris. HCI, 0.05% NaN3, pH </td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> כביסה <td>7.4 1M NaCl, 0.05% NaN3</td></tr><tr><td>ELISA חוסם חוצץ</td><td></td><td></td><td>1% סרום סוס רגיל (NHS), 1% סרום עיזים רגיל (NGS) בתמיסת</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> אחסון מדללת חלב <td>1X KPL PBS pH 7.4 המכיל 0.02% נתרן אזיד</td></tr><tr><td>מיקרופיפטות: 10 &mu; l; 20 &mu; l; 200 &mu; l; 1000 &mu; l</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור של nurr-1 polyclonal ספציפי נוגדנים חינם של צלב-תגובתיות נגד homologs לסוגרה, nor1 וnur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

תת-משפחת הקולטנים הגרעיניים 4 (NR4A) מורכבת מ-3 חלבונים קשורים החולקים תחום קשירת DNA (DBD) ותחום קשירת ליגנד (LBD). חלבון 1 הקשור לקולטן הגרעיני (Nurr1 או NR4A2) ממלא תפקיד מפתח בתחזוקת המערכת הדופמינרגית. הפרעות בתפקוד הדופמין הקשורות לגן Nurr1 כוללות בין היתר מחלת פרקינסון, סכיזופרניה ומאניה דיפרסיה. יתר על כן, עדויות עדכניות מצביעות על כך ש-Nurr1 מתבטא גם באזורים אחרים במוח כמו ההיפוקמפוס וממלא תפקידים קריטיים ללמידה וזיכרון. שאר בני המשפחה הם גורם גדילה עצבי IB (Nur77 או NR4A1) וקולטן יתום 1 שמקורו בנוירונים (NOR1 או NR4A3). כדי לעזור לחקור את התפקידים התפקודיים המדויקים של Nurr1 בהפרעות תפקוד עצביות דופמינרגיות ואחרות הקשורות לאזור המוח, היה צורך בנוגדנים נטולי תגובתיות צולבת כנגד Nur77 ו-NOR1. מכיוון שהחלבונים שונים יותר ב-LBD שלהם מאשר בתחומי קשירת ה-DNA שלהם, חיסון עם LBD מטוהר אמור להניב נוגדנים ספציפיים ל-Nurr1 עם תגובתיות מינימלית כנגד Nur77 ו/או NOR1. למרות שנוגדנים נגד Nurr1 נוצרו בהצלחה, אלה הראו תגובתיות חיסונית משמעותית כנגד שאר בני המשפחה. כרומטוגרפיה של זיקה על פני חלבון A משותק ואחריה ספיחה מוקדמת כנגד LBDs Nur77 ו-NOR1 משותקים הניבה נוגדנים ספציפיים ל-Nurr1 ללא תגובתיות צולבת. כאן, אנו מכוונים באופן סלקטיבי לנוגדנים כנגד חבר ספציפי במשפחת חלבונים שהשתמרה מאוד על ידי חיסון בעלי חיים עם האזורים השונים ביותר שלהם ולאחר מכן הסרת נוגדנים צולבים על ידי ספיחה מוקדמת. מטרת הפרוטוקול היא להגביר את הספציפיות של נוגדנים רב-שבטיים באמצעות ספיחה מוקדמת כנגד אנטיגנים צולבים.

השוואה של חלבון נוגדני Nurr1 ספציפי עמודה מטוהרת עם חלבון נוגדנים נגד Nurr1 מטוהרים ואחרי המעבר בNur77 LBD וNor1 LBD עמודות מוצגים באיור 1. כפי שניתן לראות, מטוהר נוגדן Nurr1 חלבון הציגה חזק מחייבת לNurr1 LBD. עם זאת, הוא גם הוכיח משמעותי מחייב Nur77 LBD וNor1 LBD. כאשר נוגדני Nurr1-מטוהר חלבון היו מטוהרים נוסף נגד Nur77 LBD וNor1 LBD, הזיקה הסופית מטוהרת נוגדני Nurr1 הציגו ספציפיים מחייבים Nurr1 LBD עם גילוי מחייב לNur77 LBD או Nor1 LBD, הוכחה כי התגובה הצולבת של...

כאן, אנו מכוונים באופן סלקטיבי לנוגדנים כנגד חבר ספציפי במשפחת חלבונים שהשתמרה מאוד על ידי חיסון בעלי חיים עם האזורים השונים ביותר שלהם ולאחר מכן הסרת נוגדנים תגובתיים צולבים על ידי ספיחה מוקדמת.

ייצור של Nurr-1 Polyclonal ספציפי נוגדנים חינם של צלב-תגובתיות נגד homologs לסוגרה, Nor1 וNur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להגביר את הספציפיות של נוגדנים נגד חלבונים בעלי קשר קרוב על ידי הסרת נוגדנים בעלי תגובת הצלבה. הדבר מושג תחילה על ידי זיהוי דומיינים חלבוניים בעלי השונות הגדולה ביותר בין חלבונים הומולוגיים. השלב השני הוא ביטוי וטיהור של דומיינים חלבוניים אלו.בשלב הבא, דומייני חלבון אלו מקושרים דרך הקצה ה-N או ה-C למטריצת כרומטוגרפיה. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-Spheros. השלב הסופי כולל דגירה של סרום חיסוני עם שרפים המקושרים לכל דומיין בעל תגובתיות צולבת.בסופו של דבר, מבצעים ELISA ו-Western blotting כדי להעריך את יעילות הפרוצדורה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בנוגדנים מונוקלונליים או טיהור באמצעות זיקה (affinity purification), הוא היכולת לשמר את הזיקה למטרה הרצויה תוך ביטול של Epitopes בעלי תגובתיות צולבת ידועה. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים מכיוון שהחלבון בו הם מנסים לחקור אינו יציב.את הפרוצדורה זו תדגים ד"ר Uri Kim, עמית פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. מחקר זה דורש שתי עמודות, אחת עבור neuron derived orphan receptor, או nor 1, והשנייה עבור NER growth factor IB או nor 77. מכיוון שהפרוטוקול הזה חל על שני החלבונים, יודגם תהליך ההכנה של עמודה אחת בלבד.הפשירה על קרח את החלבון המיועד לצימוד לשרף, ולאחר מכן קבע את ריכוז החלבון באמצעות מקדם האטינציה המולרי שלו ובדידת ספיגות באורכי גל של 280 ננומטר. השתמש בשני מיליליטר של שרף עבור שני מיליגרם של חלבון. כל השלבים הבאים מתייחסים לשני מיליליטר של שרף.בעמודה של 10 מיליליטר, הכין עמודה של 10 מיליליטר על ידי דחיסת FR לתחתית והזרמת PBS pH 7.4 דרכה. סגור את תחתית העמודה והוסף שני מיליליטר של בופר צימוד. הוסף ארבעה מיליליטר מהסלסורי לעמודה כדי לקבל שני מיליליטר של שרף.הסִירו את הפקק התחתון והניחו לעמודה להתרוקן. שטפו את העמודה בסה"כ שישה מיליליטרים או שלושה נפחים של מצע שרף של באפר צימוד (coupling buffer) והניחו לעמודה להתרוקן. לאחר ניקוז באפר הצימוד, החזירו את הפקק התחתון.לאחר מכן, הוסף לעמודה שניים עד ארבעה מיליליטרים של חלבון התלוי בתמיסת סמיכה (coupling buffer). שמור מנה (aliquot) של תמיסת החלבון כדי להעריך את יעילות ההצמדה. לאחר מכן, סגור את העמודה במכסה וערבב אותה בתנועת הפיכה (end over end).כדי ליצור תמיסה הומוגנית, מדוד את הנפח הכולל של התגובה, תוך התחשבות בנפח השרף, והוסף 10 מיקרולטרים של נתרן סאנובורוהידריד בריכוז חמישה מולאר לכל מיליליטר של תגובה. סגור את העמודה בעזרת פקק וערבב בשיטת הפיכה (End-over-End). קיבע את העמודה על רוטטור לבחילות (tube rotator) והשאר את התגובה להמשיך במהלך הלילה.בבוקר למחרת, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, העבירו את העמוד למCה פסחנית הכימית והסירו בזהירות את הפקק, שכן ייתכן שנ}^{+}+\היו גזים. רוקנו את העמוד לשפרויר נקי ושמרו את ה-ilu. ריכוז החלבון של ה-IIT יימדד ויושווה לריכוז החלבון ההתחלתי.כדי להעריך את יעילות הקישור, שטפו את השרף עם ארבעה מיליליטרים של תמיסת בופר לקישור והניחו לעמודה להתנקז. לאחר שהדומיין הקושר לליגנד (LBD) נקשר לשרף, השלב הבא הוא חסימת האתרים שנותרו. כדי להתחיל בפעולה זו, שטפו את השרף עם ארבעה מיליליטרים של תמיסת בופר לכיבוי (quenching buffer), נקזו את הנוזלים והחזירו את הפקק התחתון.הוסיפו שני מיליליטרים של תמיפת כיבוי (quenching buffer) והשעו את הסורבן. העריכו את נפח התגובה הכולל על ידי מדידת נפח הסורבן ונפח תמיפת הכיבוי. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של sodium cyano borohydride בריכוז חמישה מולר לכל מיליליטר מנפח התגובה.ערבבו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, בסיבוב ראש לזנב (End over end). לאחר 30 דקות, העבירו את העמוד למCהווד (מCפעל). הסירו בזהירות את המכסה העליון, ולאחר מכן הסירו את הפקק התחתוני והניחו לעמוד להתנקז לתוך מבחנה לפסולת.שטפו את העמודה בחמישה נפחי שרף של תמיסת שטיפה. עקבו אחר השטיפות כדי לוודא את נוכחותם של חלבונים שאריתיים על ידי מדידת הבליעה של הנוזל היוצא ב-280 ננומטר; חלבונים שאינם קשורים נשטפים החוצה על ידי ריכוז המלח הגבוה. לבסוף, שטפו את השרף ב-6 מיליליטר של PBS של DGA המכיל 0.02% Sodium azide, ושמרו את העמודה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש.התחילו את ההליך לניקוי נוגדויות ספציפיות ל-nore על ידי שטיפת העמודה המצומדת ל-NORE 77 LBD ב-10 milliliters של PBS והמתנה לניקוז העמודה. סגרו את תחתית העמודה והניחו את עמודת ה-neuro 77 LBD המנוקזת בתוך מבחנה איסוף חדשה בנפח 15 milliliter. הוסיפו לעמודה חמישה milliliters של חלבון, נוגדויות anti neuro one מנוקחות, וסגרו אותה. הניחו את העמודה על רוטטור בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.לאחר מכן, הסירו את המכסים העליון והתחתון ואספו את נוזל המעבר (flow through). הניחו את נוזל המעבר בצד על קרח עד להוספתו לעמודה אחת מצומדת של LBD.שטפו את העמודה המצומדת ל-LBD הראשונה עם 10 מיליליטר של PBS והניחו לעמודה להתנקז; סגרו את תחתית העמודה והניחו את העמודה המצומדת ל-LBD הראשונה בתוך מבחנה איסוף של 15 מיליליטר. הוסיפו את נוזל הזרימה (flow through) מהעמודה המצומדת ל-LBD השביעית. סגרו את העמודה והניחו אותה ברוטור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.לאחר שעה אחת, הסיר את המכסים העליון והתחתון ואסוף את הנוזל שעבר סינון (flow through). מדוד את ריכוז הנוגדנים על ידי מדידת הבליעה באורך גל של 280 ננומטר.הנוגדן anti nore one המופק מנוחל מנותח לאחר מכן באמצעות ELISA. יש להוסיף 100 µL חלבון לבארי של פלטה בעלת 96 בארי. אם בוחנים שלושה חלבונים שונים, יש להוסיף 100 µL של חלבון 1 לבארי A1 עד H4, 100 µL של חלבון 2 לבארי A5 עד H8, ו-100 µL של חלבון 3 לבארי A9 עד H12.כסו את הפלטה והדגירו למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת בבוקר, שטפו את הבארים המצופות פעמיים עם 300 µL של PBS לכל באר. לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של תמיסת חסימה ל-ELISA לכל הבארים המצופות באנטיגן והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר שעתיים של חסימה, החליפו את תמיסת החסימה של ה-ELIZA בכל באר ב-100 microliters של תמיסת חסימה טרייה של Eliza. הוסיפו 100 microliters של נוגדן anti-EU one מטוהר ומדולל לכל הבארה בשורה. הדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; לאחר שעה אחת.שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 0.05%tween 20; לאחר השטיפה השלישית, ייבשו את הפלטה בעזרת נייר סופג להסרת שאריות של תמיסת השטיפה. הוסיפו לכל באר 100 microliters של horse radish peroxidase, conjugated goat anti rabid IgG המדולל בתמיסת חסימה ל-Eliza, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שעה, שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 0.05%tween 20 כפי שהודגם קודם לכן; לאחר השטיפה השלישית.שטפו את כל הבארות על ידי מילוי של 300 µL מים דאיוניים, וספגו את עודפי המים על ידי היפוך הפלטה על נייר סופג. הוסיפו 100 µL של 3',5',5'-tetraethyl benadine, מוחמר לטמפרטורת החדר, לכל הבארות והדגירו למשך 15 עד 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. עצרו את התגובה על ידי הוספה של 50 µL של חומצה S-uric בריכוז 2N לכל בארה.לבסוף, קראו את הבליעה באורך גל של 450 ננומטר. הפחיתו את הרקע ב-650 ננומטר. השוואה של חלבון. חלבון מטוהר ללא נוגדנים ספציפיים.מעבר של נוגדנים מטוהרים נגד Noro 1 דרך עמודי no 77 LBD ו-no 1 LBD הראה כי בעוד שחלבון anti no 1 מטוהר הפגין קישור חזק ל-no 1 LBD, הוא הראה גם קישור משמעותי ל-no 77 LBD ול-no 1 LBD. טיהור נוסף של anti no 1 כנגד no 77 LBD ו-no 1 LBD הסיר לחלוטין תגובה צולבת זו. סגוליות זו הודגמה עוד יותר באמצעות אנליזת Western blot של תמציות מתאים שטרנספקטו וקטורי ביטוי הנושאים Mic tagged full length nor 1, nor 1 ו-nor 77. נוגדנים anti mic חשפו כי כל חלבון באורכו המלא בוטה במשקל המולקולרי הצפוי; חלבון anti nor 1 מטוהר זיהה בעוצמה את nor 1 באורכו המלא, אך זיהה גם את nor 1 ו-nor 77, אם כי ביעילות פחותה.לעומת זאת, הנוגדן המזוהה והמטוהר באופן מלא ל-nor one לא הראה תגובתיות צולבת גילוי כלשהי ל-nor one ו-nor 77. ניתוח אימונוהיסטוכימי של נוירוני דופמין במוח האמצעי עם הנוגדן המטוהר באופן מלא ל-nor one אישר את הביטוי הבולט של nor one באימונוהיסטוכימיה. שימוש ב-tyrosine hydroxylase חשף בנוסף כי neuro one מבוטא באופן בלעדי גם בגרעין של נוירוני דופמין במוח האמצעי באזור ה-substantia nigra. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כהלכה. זכרו כי עבודה עם sodium ion או hydride עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה תחת מ 빠르게 כימי בעת ביצוע הליך זה.

production-nurr-1-specific-polyclonal-antibodies-free-cross

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים הליך לייצור נוגדנים רקומביננטיים נגד מטלופפטידאז. פלסמידים רקומביננטיים הנושאים גנים לנוגדן, חלבון פלואורסצנטי ירוק ועמידות לאנטיביוטיקה נדבקים לתאי אפיתל עם ליפופקטמין. התאים הנגועים נבחרים ומעובדים כדי ליצור נוגדנים רקומביננטיים.

שיטה לייצור נוגדנים רקומביננטיים נגד מטלופפטידאז

במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את האבחון וטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

כאן, אנו מתארים שיטה להביע ולטהר norovirus באיכות גבוהה בולטות (P) תחומים ב E. coli לשימוש במחקרים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים, כמו גם חלבונים הלא מבניים, כלומר., הגנום צמוד חלבונים נגיפיים (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp).

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; E. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

כאן, המחברים מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל להגדרת אפיטופ אנטיגני ליניארי באמצעות נוגדן חד שבטי מטוהר וסריקת פפטידים באמצעות הכלאה של כתמי נקודות. לאחר מכן ניתן להשתמש באפיטופ שזוהה ביישומים טיפוליים ואבחנתיים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

אנחנו ectopically לידי יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים עובריים אנושיים (HEK293) כמו אנטיגן לזהות עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם של חולים חשוד עם דלקת אוטואימונית. שיטה פשוטה זו עשויה להיות מתאימים לסינון למטרות בהגדרות קליניים.

וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

מאמר זה מספק נוהל מפורט על ההכנה ועל הערכה של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים לשימוש immunoassays שונים. הליך זה כולל חיסונים, תא היתוך, עקיף ELISA תחרותי שיבוט חיובי ההקרנה, ליפידים monoclonal הכנה. המפרט עבור אפיון נוגדנים באמצעות MALDI-תוף-MS וניתוחים אליסה הינם גם מסופקים.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

כאן אנו מציגים שיטה cytometry זרימה מבוססת תא לזהות נוגדנים נטרול או גורמים אחרים להפריע קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים במטריצה אנושי, כגון לנוזל חוט השדרה (CSF) או בנסיוב אדם.

זיהוי נוגדנים המנטרלים את קליטת סלולר הנובעים מהשימוש בתחליפי האנזים עם Assay מבוססת-תא

חלבון הנוגדן הרקומביננטי המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובנוגדנים חד-שבטיים המיוצרים בטכנולוגיית היברידימה מסורתית יכול לזהות ולהיקשר לחלבון אמינופפטידאז N (APN) חזירי.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

מדידת מומנט לסבסב של תסיסנית קשור עם מד מומנט מאפשר שליטה הנוירולוג מעולה של המצב גירוי של החיה ניסיוני. יחד עם כלים גנטיים ייחודיים זמין זבוב הפירות, פרדיגמה זו משמשת עבור מגוון רחב של מחקר הנוירוביולוגי.

למידה אופרנטית של תסיסנית במד מומנט

למד שיטה לשיפור ספציפיות נוגדנים נגד חלבונים הומולוגיים באמצעות הסרת נוגדנים מסוג צלב-תגובתיות. השיטה משתמשת בזיהוי אזורי חלבון שונים לחלוטין ובכרומטוגרפיה להפרדה.

ייצור של Nurr-1 Polyclonal ספציפי נוגדנים חינם של צלב-תגובתיות נגד homologs לסוגרה, Nor1 וNur77

גלה סרטונים נוספים