Name: שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H 2 O 2 בכליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למד כיצד למדוד ATP ומימן פרוקסיד בכליות בזמן אמת באמצעות ביוסנסורים אנזימטיים. הפרוטוקולים מסבירים כיול חיישנים, התקנה כירורגית ומדידות אקס ויוו ואין ויוו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מעריכים את סריסה ביו-רפואיים לעבודתם בפיתוח החיישנים המשמשים בכתב היד הנוכחית. מחקר זה נתמך על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון מעניק HL108880 (א Staruschenko), HL 116,264 (א קאולי) וHL 122,662 (א Staruschenko וא קאולי), פרויקט ממומן על ידי בית הספר לרפואה של הוועדה לענייני המחקר ויסקונסין # 9306830 (א &#39;Palygin) וקידום # בריא ויסקונסין תכנית המחקר וחינוך 9,520,217, והחוקר הצעיר גרנט של הקרן הלאומית לכליות (א&#39; Palygin).

נהלי החיה הבאים דבקו במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. אישור מראש התקבל מהוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). הערה: סקירה של הוראות יצרן החיישן צריכה להיעשות בשלבי תכנון הניסוי ולפני השימוש בם. ההנחיות באות יפיק תוצאות אופטימליות בעת שימוש בחיישנים. 1. חיישן כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות טריים לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור מאגר המכיל 10 מ&quot;מ חיץ NaPi, 100 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו -2 גליצרול מ&quot;מ. התאם את ה- pH 7.4 באמצעות NaOH. אחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בריכוז ATP המניות (100 מ&quot;מ) מאוחסן ב -20 ° C, ליצור פתרון כיול טרי 10 מ&quot;מ ATP על ידי הוספת מניית 10 μl 90 μl של א &#39;המאגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות חיישן ה- ATP על ידי הצבת קצהו (איור 2) לtהוא תא להחזרת נוזלים המכיל מאגר לפחות 10 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר התייבשות, לא צריכה להיות חשוף לאוויר החיישנים ליותר מ -20 שניות או רגישות החיישן עשויה להיות מופחתת. אם חשיפות ארוכות לאוויר צפויים, לטבול את החיישן בקצרה לפתרון של גליצרול. החיישנים יכולים לשמש לניסויים מרובים אך אלה חייבים להתרחש באותו היום כמו התייבשות חיישן. ניתן לאחסן את החיישנים בתא להחזרת נוזלים עם הצפת עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את potentiostat הערוץ הכפול (איור 3) ולהפעיל את תוכנת מערכת הקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא כיול עם 3 מיליליטר של חיץ א מקום האלקטרודה ההתייחסות לתא הכיול. קח כל חיישן מהתא להחזרת נוזלים, אז לצרף אותו למניפולטור ולהכניס אותו לתוך תא פתרון כיול. הערה: השתמש בצלחת פטרי סיליקון המצופה סטנדרטית כתא כיול. לבצע את כל הכיולים ורחudies בכלוב פאראדיי על שולחן אוויר מעבדה ביצועים גבוהים כדי להפחית את רעש האות במהלך הקלטות amperometry (איור 4). כיולים נעשים הטובים ביותר קרובים לתחילת איסוף הנתונים ככל האפשר. עבור יישומים בvivo הזמן האופטימלי לכיול הוא בתקופת ההתאוששות שלאחר ניתוח בבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vivo לשעבר כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע voltammetry המחזורית בתא הכיול ידי רכיבה על אופני החיישנים מ-500 mV ל+500 mV בשיעור של 100 mV / sec במשך 10 מחזורים. זה משפר באופן משמעותי את הרגישות של החיישנים. ראה איור 5 לעקבות שנצפו מ10 המחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקטב החיישנים לmV 600 אחרי המחזור האחרון. החיישן הנוכחי ידעכו לאסימפטוטה. קריאה יציבה מושגת לאחר מינימום של 5 דקות. רשום את הקריאה אפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכיול חיישן vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תבצעו את voltammetry המחזורית בin vivo הצרRS. במקום זאת, לקטב את החיישן בתא הכיול במשך 30 שניות ל+500 mV. לאחר מכן קבע את potentiostat ל0 mV ולאפשר הנוכחי החיישן לעלות לאסימפטוטה. החיישן הנוכחי ייקח לפחות 2 דקות לאסימפטוטה. רשום את הקריאה אפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות להוסיף כמויות סט של פתרון ה- ATP לתא לייצר קו כיול מקיף טווח גילוי רצוי. פתרון ה- ATP מייצר שיא חד באות החיישן בתחילה, ואחריו ריקבון כATP מפזר באופן אחיד בכל התא. ערכי אות שיא פעם אחת את רמת האות התייצב לאחר כל הוספת ATP. 6A דמויות ועקבות 7 תכנית והציעו ריכוזי ה- ATP לשני vivo לשעבר ובמחקרי vivo, בהתאמה. הערה: חשוב כדי לאשר את הסלקטיביות של אלקטרודות באמצעות אוכלי נבלות של analytes. הפרוטוקול הנוכחי משמש apyrase כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן ה- ATP וcatalase לH &lt;תת&gt; 2 O 2 אות (6B דמויות). אם תרופות הן להינתן, מדידות של תגובתיות שלהם עם החיישנים צריכים להיקבע לפני המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של apyrase ממלאי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר (89 האו&quot;ם / מ&quot;ג) כדי לבדוק ספציפי של חיישן ה- ATP (הנוכחי מיוצר על ידי יישום ה- ATP צריך להפחית לרמת אפס (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μl של catalase ממלאי של 2mg / מיליליטר (100 האו&quot;ם / מ&quot;ג) כדי לבדוק את הספציפיות של חיישן null (הנוכחיות מיוצר על ידי H 2 O 2 יישום צריך להפחית לקריאת אפס). </li></ol> 2. ניתוח בעלי חיים לחיישן לימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לvivo לשעבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה הניסיונית עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. 15 &#39;12 בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. רחובתגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה מסוגלת משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. הערה: להרדים בעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו IACUC. בסיום כל ההליכים שאינם ההישרדות להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת במצב שכיבה. תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע של כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליה השמאלית ולחשוף את אב העורקים בבטן דיסטלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף מייתר סביב צליאק ועורקי mesenteric מעולים, ואב העורקים בבטן מעל העורקים האלה, אבל לא לקשור. לעטוף שני חיבורי אותיות סביב אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את אב העורקים בבטן מעל חיבורי האותיות. לקשור את המייתר נמוך יותר. קטטר אב העורקים בבטן עם צינורות פוליאתילן (PE50). Secure את הקטטר עם מייתר אב העורקים השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המהדק ולקשור את עורקי mesenteric וצליאק. Perfuse הכליות בשעת 6 מיליליטר / דקה עם הנקס מאוזן תמיסת מלח על RT במשך 2-3 דקות, עד שהכליה החווירה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו הכליות וקטטר, מחוברים חלק של אב העורקים. מניחים את הכליות ל3 מיליליטר צלחת פטרי מלא פתרון אמבטיה. הערה: פרוטוקול ניסוי יכול להתבצע על RT. פתרון האמבטיה מכיל במ&quot;מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7.35 מותאמים עם NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח לin vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש תוך שימוש בפרוטוקולי IACUC אושר. לניתוח בvivo להרדים חולדות עם קטמין (20 מ&quot;ג / קילוגרם IM) וinactin (50 מ&quot;ג / IP קילוגרם). בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח רמה נאותה של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עומק הרדמה נכון הוא לקבלאד, מניח את החולדה במצב שכיבה על משטח מוארק טמפרטורה מבוקרת ממוקם על שולחן האוויר. המשטח צריך להיות שחומם מראש ונשמר על 36 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על עומק הרדמה מתאים, לעשות חתך קו האמצע כ 5 סנטימטרים בקו אחד עם הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתפר להסיט ולעגן את רקמת עור ותת עורי, כך שכל הכליה היא גלויה. מניחים את הכליות בכוס כליות כדי למזער את חפצי תנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעירוי של BSA 2%: 0.9% NaCl ב 1 מיליליטר / 100 שעות / g דרך וריד הצוואר לשמור נפח דם. Cannulate שני השופכנים לאיסוף שתן. קשרי מקום סביב עורקי mesenteric וצליאק מעולים וaortal דיסטלי למניפולציה של לחץ פרפוזיה (10A דמויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם היישום של סוכנים תרופתיים נדרש במהלך ניסויי in vivo, החדרת קטטר ביניים מומלצת (10 ב איורים </strong&gt;). </li></ol></li></ol> התקנת 3. רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תכנית רכישת נתונים ולהגדיר הקוטביות שלה לשני vivo לשעבר ובניסויי vivo לאנודית חיובית. הגדר את התכנית כדי לשמור את הנתונים כקוד ASCII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את micromanipulators להחדרה מהירה של החיישנים לכליות. הערה: לחלופין, להשתמש בבדיקת דמה שצורפה לmicromanipulator כדי לעזור להשיג את המיקום הרצוי של חיישנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vivo לשעבר רכישת נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הכליות עם פתרון אמבטיה (מ2.1.6) דרך אב העורקים cannulated בקצב קבוע של 650 μl / דקה. בעזרת מספריים כירורגיות, להסיר בזהירות את הקפסולה הכליות, אשר הכרחית להחדרת חיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הכליות עם גומיות קשורות על הכליות ומחוברות לצלחת מצופה סיליקון עם סיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה ההתייחסות קרובה לכליה בצלחת פטרי עם הקצה שלה שקוע בפתרון החיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכישת נתונים vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכליות בכוס כליות. בהתאם לזן וגיל של החיה להשתמש בגודל של כוס שמחזיקה את הכליות באופן רופף. איור 8 מראה שני גדלים של כוסות כליות. כוסות דומות משמשות לגישות פיסיולוגיות שונות המתמקדות בניתוח של תפקוד כליות כגון micropuncture וכו &#39;16. הערה: המיקום של כוס הכליות הוא קריטי כדי להסיר את הרעש המכני המיוצר על ידי הנשימה של בעלי החיים, אבל לא צריך להפריע או לחסום זלוף כליות או זרימת שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 45 דקות של זמן התאוששות לפני ביצוע איסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 26-30G, לעשות חור לנקב במיקום והעומק הרצויים של החיישן בכליות. למחוק את חור פני השטח כדי להסיר דם הקרין. להוסיף פתרון גליצרול אל פני השטח של הכליה. זה ימנע את פני השטח בכליות מהתייבשות במהלך הניסוי. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיישן הראשון מהתא להחזרת נוזלים ולצרף אותו לmicromanipulator. במהירות, תוך 20 שניות, להכניס את האלקטרודה לתוך החור הטרי שנוצר בכליות. חזור על שלבים 3.5-3.9 לחיישן null. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האלקטרודה ההתייחסות לכליות, כ 1 סנטימטר מהחיישנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את potentiostat ולהפעיל את תכנית ההקלטה במחשב. איור 9 מציג את ההגדרה הסופית של vivo לשעבר רכישת נתונים הכליות. איור 10 מראה את ההתקנה הסופית של in vivo רכישת נתונים כליות עם קטטר שהוכנס. </li></ol> ניתוח נתונים 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את קובץ נתוני ASCII למקור או כל תוכנה דומה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביחס נוכחית ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציה מתאימה / לחיץ ליניארי לבנות ריכוז ליניארי (ציר ה- X) למערכת יחסים הנוכחית (y -axis) ל- ATP או H 2 </sub&gt; נקודות O 2 כיול (איורים 6 ו -7). קו ליניארי בכושר: = MX + b y </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות הנוכחי לריכוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את העקבות המדודות של חיישן null מאלה של חיישן ה- ATP להשיג הנוכחי בפועל מיוצר על ידי ATP תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את ערכי ה- ATP ברשות הפלסטינית מתקבלים על ידי amperometry לננומטר באמצעות משוואת הכיול מפורטת ב4.2.1. קבע את הריכוז של עקבות נתונים מופחתים של חיישן ה- ATP על ידי יבוא כל נוכחית מותאמת לערך &quot;x&quot; ופתרון לy (ריכוז אנליטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה, לחשב H 2 O 2 ריכוז מהמשוואה כיולה במידת צורך. </li></ol>

<ol><li>Palygin, O., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+substances+with+enzymatic+microelectrode+biosensors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous substances with enzymatic microelectrode biosensors in the kidney.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 305, 89-91 (2013).</li>
<li>Clark, L. C., Lyons, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+systems+for+continuous+monitoring+in+cardiovascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery.</a> Ann N Y Acad Sci. 102, 29-45 (1962).</li>
<li>Haruyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+nanobiotechnology+for+biosensing+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micro- and nanobiotechnology for biosensing cellular responses.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55, 393-401 (2003).</li>
<li>Huckstepp, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+hemichannel-mediated+CO2-dependent+release+of+ATP+in+the+medulla+oblongata+contributes+to+central+respiratory+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin hemichannel-mediated CO2-dependent release of ATP in the medulla oblongata contributes to central respiratory chemosensitivity.</a> J Physiol. 588, 3901-3920 (2010).</li>
<li>Lopatar, J., Dale, N., Frenguelli, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+contribution+of+ATP+P2+receptors+to+electrically-evoked+electrographic+seizure+activity+in+hippocampal+slices%3A+Evidence+from+purine+biosensors+and+P2+receptor+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minor contribution of ATP P2 receptors to electrically-evoked electrographic seizure activity in hippocampal slices: Evidence from purine biosensors and P2 receptor agonists and antagonists.</a> Neuropharmacology. 61, 25-34 (2011).</li>
<li>Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Marshall, S. P., Pena, D. M., Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+inhibition+of+dopamine+release+in+striatum+is+mediated+by+a+new+diffusible+messenger%2C+H2O2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent inhibition of dopamine release in striatum is mediated by a new diffusible messenger, H2O2.</a> J Neurosci. 23, 2744-2750 (2003).</li>
<li>Frenguelli, B. G., Wigmore, G., Llaudet, E., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+mechanistic+dissociation+of+ATP+and+adenosine+release+during+ischaemia+in+the+mammalian+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Temporal and mechanistic dissociation of ATP and adenosine release during ischaemia in the mammalian hippocampus.</a> J. Neurochem. 101, 1400-1413 (2007).</li>
<li>Lalo, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+of+ATP+from+astrocytes+modulates+phasic+and+tonic+inhibition+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Exocytosis of ATP from astrocytes modulates phasic and tonic inhibition in the neocortex.</a> PLoS Biol. 12, e1001747(2014).</li>
<li>Heinrich, A., Ando, R. D., Turi, G., Rozsa, B., Sperlagh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+depolarization+evokes+ATP%2C+adenosine+and+glutamate+release+from+glia+in+rat+hippocampus%3A+a+microelectrode+biosensor+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">K+ depolarization evokes ATP, adenosine and glutamate release from glia in rat hippocampus: a microelectrode biosensor study.</a> Br.J Pharmacol. 167, 1003-1020 (2012).</li>
<li>Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+in+hypothalamic+tanycytes%3A+potential+roles+in+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling in hypothalamic tanycytes: potential roles in chemosensing.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 237-244 (2011).</li>
<li>Gourine, A. V., Llaudet, E., Dale, N., Spyer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+ATP+in+the+ventral+medulla+during+hypoxia+in+rats%3A+role+in+hypoxic+ventilatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Release of ATP in the ventral medulla during hypoxia in rats: role in hypoxic ventilatory response.</a> J Neurosci. 25, 1211-1218 (2005).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H2O2+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H2O2 release in freshly isolated kidneys.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2013).</li>
<li>Thome-Duret, V., Gangnerau, M. N., Zhang, Y., Wilson, G. S., Reach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+sensitivity+of+glucose+sensor+implanted+into+subcutaneous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Modification of the sensitivity of glucose sensor implanted into subcutaneous tissue.</a> Diabetes Metab. 22, 174-178 (1996).</li>
<li>Wilson, G. S., Gifford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+for+real-time+in+vivo+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors for real-time in vivo measurements.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2388-2403 (2005).</li>
<li>Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Channel+Analysis+of+TRPC+Channels+in+the+Podocytes+of+Freshly+Isolated+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-Channel Analysis of TRPC Channels in the Podocytes of Freshly Isolated Glomeruli.</a> Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).</li>
<li>Stockand, J. D., Vallon, V., Ortiz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+analysis+of+tubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo analysis of tubule function.</a> Compr Physiol. 2, 2495-2525 (2012).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+Fundamentals+and+applications+-+Historic+book+now+open+access%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors: Fundamentals and applications - Historic book now open access.</a> Biosens. Bioelectron. 65C, A1(2014).</li>
<li>Kauffmann, J. M., Guilbault, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+electrode+biosensors%3A+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem+Anal%22%5BJournal%5D)">Enzyme electrode biosensors: theory and applications.</a> Methods Biochem Anal. 36, 63-113 (1992).</li>
<li>Barlett, P. N., Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immobilization+of+enzymes+in+electropolymerized+films%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A review of the immobilization of enzymes in electropolymerized films.</a> J Electroanal Chem. 362, 1-12 (1993).</li>
<li>Kano, K., Morikage, K., Uno, B., Esaka, Y., Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+microelectrodes+for+choline+and+acetylcholine+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme microelectrodes for choline and acetylcholine and their applications.</a> Anal Chim Acta. 299, 69-74 (1994).</li>
<li>Llaudet, E., Hatz, S., Droniou, M., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+biosensor+for+real-time+measurement+of+ATP+in+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microelectrode biosensor for real-time measurement of ATP in biological tissue.</a> Anal Chem. 77, 3267-3273 (2005).</li>
<li>Llaudet, E., Botting, N. P., Crayston, J. A., Dale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-enzyme+microelectrode+sensor+for+detecting+purine+release+from+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A three-enzyme microelectrode sensor for detecting purine release from central nervous system.</a> Biosens Bioelectron. 18, 43-52 (2003).</li>
<li>Cosnier, S., Lepellec, A., Guidetti, B., Isabelle, R. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+biosensor+sensitivity+in+aqueous+and+organic+solvents+using+a+combination+of+poly%28pyrrole-ammonium%29+and+poly%28pyrrole-lactobionamide%29+films+as+host+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electroanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of biosensor sensitivity in aqueous and organic solvents using a combination of poly(pyrrole-ammonium) and poly(pyrrole-lactobionamide) films as host matrices.</a> J Electroanal Chem. 449, 165-171 (1998).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Kluess, H. A., Stone, A. J., Evanson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+overflow+in+skeletal+muscle+1A+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">ATP overflow in skeletal muscle 1A arterioles.</a> J. Physiol. 588, 3089-3100 (2010).</li>
<li>Nishiyama, A., Jackson, K. E., Majid, D. S., Rahman, M., Navar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+fluid+ATP+responses+to+arterial+pressure+and+tubuloglomerular+feedback+activation+during+calcium+channel+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial fluid ATP responses to arterial pressure and tubuloglomerular feedback activation during calcium channel blockade.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H772-H777 (2006).</li>
<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+renal+perfusion+pressure+on+renal+medullary+hydrogen+peroxide+and+nitric+oxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Effects of renal perfusion pressure on renal medullary hydrogen peroxide and nitric oxide production.</a> Hypertension. 53, 1048-1053 (2009).</li>
<li>Khan, A. S., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li>
</ol>

חיישנים להקלטת וידאו של כתב היד הזה נמסרו על ידי סריסה ביו-רפואי מוגבל (קובנטרי, בריטניה).

הפרוטוקולים הנוכחיים פותחו כדי לספק רזולוציה של זמן ומרחב משופר של ה- ATP ו- 2 O 2 H איתות לכליות-perfused דם מבודדים vivo לשעבר, perfused וin vivo. ההבדלים בין הפרוטוקולים והחיישנים המשמשים כאן לספק נתונים רכישה אופטימלית לשני סוכנים תרופתיים או מחקרים פיסיולוגיים. הפרוטוקולים מורכבים של 1 כיול) חיישן, 2) הליך כירורגי, 3) התקנת רכישת נתונים, ו -4) ניתוח נתונים. הם מאפשרים מדידות בזמן אמת של analytes לתנאי ניסוי רבים. זה יוביל לתובנות גדולות...

חיישני microelectrode האנזימטית (גם בהפניה כמו חיישנים בכתב היד הנוכחית) היו כלי רב ערך ללימוד תהליכי איתות דינמיים בתאים חיים ורקמות. החיישנים יספקו גדלו רזולוציה של זמן ומרחב של מולקולות איתות תא בריכוזים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. במקום דגימה וניתוח נוזלים תאיים נלקחו במרווחים על פני תקופות זמן ארוכות, חיישנים אלה מגיבים מהר ככל האנזימים שלהם מגיבים לאנליטי, ובכך לייצר מדידות בזמן אמת 1,2. זיהוי מהיר של ריכוזי ביניים של גורמי autocrine ואוטוקריני, כמו purines או מי חמצן, ואת הדינמיקה של שחרורם ניתן להשתמש כדי להקים פרופיל להשפעות של תרופות בתנאים נורמלים ופתולוגיים 3. נכון לעכשיו, רוב היישומים באמצעות חיישנים היו בחתכי רקמת מוח ותרביות תאים 4-10. הפרוטוקולים מפורטים במטרת כתב היד הזה ללהקים את האמצעים כדי למדוד במדויק ריכוזים של analytes בכל כליות בזמן אמת. הפרוטוקולים הבאים פותחו ללמוד ATP ביניים ו- H 2 O 2 איתות בכליות. בסביבה המקורית של הכליות, ATP התאי catabolized במהירות על ידי ectonucleotidases אנדוגני לנגזרותיו (ADP, AMP ואדנוזין). החיישנים המשמשים כאן הם מאוד סלקטיבית לATP על purines אחרת או מוצרים פגומים ATP 11. זו מציעה יתרון גדול שכן היא מאפשרת ניטור מדויק של ריכוזים קבועים ודינמיים של שחרור ATP ותפקוד האיתות שלה. ריכוז ה- ATP ביניים נמדד באמצעות שילוב של שני microelectrodes, חיישן ה- ATP וחיישן ריק. חיישן ריק בשילוב עם יישומי catalase הוא מסוגל לזהות H ביניים 2 O 2 ריכוזים 12. הפרוטוקולים הבאים משתמשים בשני עיצובים שונים של הצרRS שיש להן מאפיינים אופטימליים לשני vivo לשעבר או ביישומי vivo. שני העיצובים מבוססים על התגובה קטליטי רציפה של קינאז גליצרול ומונואמין גליצרול-3-פוספט הכלול בשכבה האנזימטית חיישן ומונע על ידי הנוכחות של ה- ATP. בסט של חיישנים המשמשים במחקרי vivo לשעבר, H 2 O 2, מוצר התגובה האנזימטית הסופי, הוא זוהה על ידי חמצון על פלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). חיישנים ללימודים בvivo מבוססים במקום על H 2 O 2 הפחתה באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שמוצגת באיור 1 היא ערכה של שני הפרוטוקולים שתוארו בכתב היד הזה. חיישן ריק זהה לחיישן ה- ATP המקביל שלה חוץ מזה שחסר את האנזימים מחויבים. לכן, בנוסף לגילוי של H 2 O 2 עם אנזים catalase, מאה שהחיישן ריקsures הפרעות ספציפיות. ריכוזי ATP מחושבים על ידי הפחתת ריק זוהה הפרעות ספציפיות וH רקע 2 O 2 מאות חיישן ה- ATP. כמה חיישנים גם זמינים מסחרי כדי לזהות analytes האחר כוללים אדנוזין, ionosine, hypoxanthine, אצטילכולין, כולין, גלוטמט, גלוקוז, חומצת החלב, ד-סרין ליישומי vivo לשעבר או אדנוזין, ionosine, וhypoxanthine לin vivo כאשר יחד עם ריק המקביל חיישן. היכולת של החיישן לזיהוי מדויק analytes תלויה בטרום הנכון וכיולים שלאחר 13. זה מבטיח שהניתוח מהווה להיסחף ברגישות חיישן המתרחש במהלך שימוש ברקמות ביולוגיות. החיישן מחזיק מחסן של גליצרול המשמש כמגיב בתגובות אנזימטיות החיישן. אם החיישן לא נעשה שימוש בפתרונות אמבטיה המכילים גליצרול, זה יהיה לשטוף החוצה לאורך זמן. r הקצרפעמים ecording אז הם הכרחיים כדי למזער להיסחף החיישן. בנוסף חיישן עכירות על ידי פרוטאזות אנדוגני ושברי חלבון יכול להפחית את הרגישות של החיישנים 14 מאוד. כתב היד הנוכחית קובעת את השימוש בחיישני microelectrode האנזימטית לvivo לשעבר ובהכנות כליות vivo. כימות אנליטי בזמן אמת מספקת פירוט חסר תקדים של איתות תאית שעשויות לחשוף תובנות רומן לתוך המנגנונים של מחלות כליה וסוכנים תרופתיים.

<table><tbody><tr><td>ערכת חיישנים</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>הערכה כוללת בקבוק אחסון, תא התייבשות, מובילי אלקטרודות ואלקטרודות ייחוס.&nbsp; כמו כן כלול בערכה בחירת החיישנים של המשתמש.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>אחסן ב-2-8 oC לפני השימוש</td></tr><tr><td>ב-Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>חנות ב 2-8 oC לפני השימוש</td></tr><tr><td>בחיישן אפס Sarissaprobe 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>אחסן ב-2-8 oC לפני השימוש</td></tr><tr><td>בחיישן אפס Sarissagold 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>חנות ב-2-8 oC לפני השימוש</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>Faraday cage&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוטנציוסטט דו-ערוצי</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>כלוב פאראדיי Type II</td></tr> תוכנית <tr><td>רכישת נתונים</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>משאבת זלוף</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>דגם R99E</td><td></td></tr><tr><td>מאיר סיבים אופטיים</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי מיקרומניפולטור</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>שולחן אוויר</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>מאוורר isoflurane</td><td>LEI רפואי</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל צלחת פטרי</td><td>פישר מחט</td><td>S3358OA</td><td></td>מדעית</tr><tr><td>סנטה</td><td>קרוז</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>סיכות</td><td></td><td></td><td>חיתוך סטנדרטיות</td></tr><tr><td>קטטר</td><td></td><td></td><td>צינורות פוליאתילן (PE50)</td></tr> <tr><td>דבק רקמות קטטר</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>תפר</td><td>מראה</td> גומיות <td></td> SP117 <td></td></tr><tr><td></td><td>כל גומיות ברוחב 2-4 מ"מ</td>סיליקון Momentive RTV-615 שקוף 1 # מהדק כלי מדע עדינים 18052-03 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>ערכת <td></td><td></td><td>דיסקציה סטנדרטית</td><td>הערכה צריכה לכלול אזמל ודיסקציה sissors&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td>כליות</td><td>בעיצוב עצמי</td></tr><tr><td>כימיקלים סטנדרטיים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 מ"מ תמיסת ATP</td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>אפיראז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>קוצץ</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>אינקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ</td><td>קטמין</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>הנקס תמיסת מלח מאוזנת&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש באנזימתי biosensors לכמת אנדוגני atp או h<sub&gt; 2</sub&gt; o<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

חיישני microelectrode אנזימתי היו בשימוש נרחב כדי למדוד איתות תאית בזמן אמת. רוב השימוש בם הוגבל לפרוסות מוח ותרביות תאים עצביות. לאחרונה, טכנולוגיה זו הוחל על כל האיברים. התקדמות בתכנון חיישן שהתאפשרה המדידה של איתות תא בכליות vivo-perfused דם. הפרוטוקולים הנוכחיים רשימת הצעדים הדרושים כדי למדוד 2 O 2 איתות ATP ו- H בinterstitium כליות חולדה. שני עיצובי חיישן נפרדים המשמשים לvivo לשעבר ובפרוטוקולי vivo. שני סוגים של חיישן מצופים בbiolayer האנזימטית דק על גבי שכבת permselectivity לתת חיישנים מהירים להגיב, רגישים וסלקטיבית. שכבת permselectivity מגנה על האות מinterferents ברקמות ביולוגיות, והשכבה האנזימטית מנצלת את תגובת קטליטי רציפה של קינאז גליצרול וגליצרול-3-phosמונואמין phate בנוכחות ATP לייצר H 2 O 2. הסט של חיישנים המשמשים למחקרי vivo לשעבר זוהה נוסף אנליטי על ידי חמצון של H 2 O 2 בפלטינה / אירידיום אלקטרודה חוט (PT-עיר). החיישנים למחקרי in vivo מבוססים במקום על ההפחתה של H 2 O 2 באלקטרודה זהב מתווך מצופה מיועדת לרקמה-perfused דם. שינויי ריכוז סופיים מזוהים על ידי amperometry בזמן אמת ואחרי כיול לריכוזים ידועים של אנליטי. בנוסף, את הספציפיות של אות אמפרומטריים יכולות להיות מאושרות על ידי התוספת של אנזימים כגון catalase וapyrase כי לשבור H 2 O 2 ו- ATP בהתאמה. חיישנים אלה גם מסתמכים במידה רבה על כיולים מדויקים לפני ואחרי כל ניסוי. שני הפרוטוקולים הבאים להקים המחקר של זיהוי של ה- ATP ו- H 2 בזמן אמתO 2 ברקמות כליה, ויכול להיות שונה נוסף להאריך את השיטה המתוארת לשימוש בתכשירים ביולוגיים אחרים או כל איברים.

העיצוב של biosensor microelectrode האנזימטית מאפשר זיהוי של analytes בכל כליות בזמן אמת. עיצוב הניסוי הכללי לאו vivo לשעבר או במחקרי vivo מודגם באיור 1 חיישני .the משמשים והניתוחים שונים בהתאם אם המחקר הוא vivo לשעבר או in vivo. כדי להשיג תוצאות לשחזור, מראש מדויק וכיולי פוסט הם קריטי. איור 6 א מציג עקבות נציג של האות ראתה מחיישן ה- AT...

חיישנים ביולוגיים של מיקרואלקטרודות אנזימטיות מאפשרים מדידות בזמן אמת של איתות תאים חוץ-תאיים בריכוזים רלוונטיים מבחינה ביולוגית. הפרוטוקולים הבאים מרחיבים את היישומים של חיישנים ביולוגיים לזיהוי ex vivo ו-in vivo של ATP ו-H 2O2 בכליה.

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

המטרה הכללית של פרוצדורות אלו היא למדוד בזמן אמת ריכוזים אינטרסטיציאליים אנדוגניים של TP ומימן פראוקסיד בכליות שלמות. דבר זה מושג תחילה על ידי רהידרטציה וכיול של חיישנים ליישומים ex vivo ו-in vivo בריכוזים ידועים של TP ומימן פראוקסיד. לצורך התקנת החיישנים ex vivo, הכליה הוכשרה כירורגית ונכתה מדם.פרוצדורה זו מבוצעת על ידי שטיפה של הכליה דרך האאורטה. לאחר מכן, הכליה של החולדה מבודלת בניתוח, מוצבת בתא הקלטה ומבוש perfusion במי מלח. TP ומימן פראוקסיד נמדדים באמצעות חיישנים ex vivo עבור הפרוצדורה in vivo.מתבצעת חתך כדי לאפשר ויזואליזציה של הכליה המוחדרת בדם. הכליה ממוקמת תחת כיסוי ייצוב, וניתן להתקין קטטר אינטרסטיציאלי להגשת תרופות. ריכוזי ATP ומימן-פרוקסיד אינטרסטיציאליים כלייתיים נוספים נמדדים באמצעות חיישנים in vivo.בסופו של דבר, פרוטוקולים אלו מקלים על השימוש בביוסנסורי מיקרו-אלקטרודה אנזימטיים למדידות בזמן אמת של TP ומימן פראוקסיד באינטרסטיציום של הכליה. היתרון המרכזי של ביוסנסורים אנזימטיים הוא יכולתם למדוד באופן ישיר ריכוזים אינטרסטיציונליים אנדוגניים ברקמות ביולוגיות. כאן נעשה שימוש בטכנולוגיה זו כדי לזהות ריכוזי TP ומימן פראוקסיד באינטרסטיציום של כליה מבודדת המבושפפת במי מלח, או in vivo.דיוקם של החיישנים הביולוגיים האנזימטיים מאפשר מדידות בזמן אמת של הבקרה הבסיסית והדינמית של ריכוזי ATP או מימן-פרוקסיד חוץ-תאיים. מדידות אלו יכולות לקבוע פרופילים של יישום תרופתי או מחלה עבור אזורים שונים תפקודית בכליות. יש להחזיר את הלחות לשני החיישנים, הן לחיישן ה-ATP והן לחיישן ה-null, על ידי הנחת קצותיהם בתאי רהידרטציה נפרדים המכילים buffer A למשך 10 דקות לפחות בטמפרטורה של שני עד שמונה מעלות צלזיוס.הפעל את ה-POTENTIA stat בעל הערוץ הכפול והפעל את תוכנת מערכת ההקלטה. הגדר את התוכנה לשמור נתונים בפורמט A-S-C-I-I ואת קוטביות החיישן לערך חיובי אנודי (anodic positive). הכן תא כיול עם שלושה מיליליטר של בופר, והנח את אלקטרודת הייחוס בתוך התא.הוצאו כל חיישן מתהליך ההידרציה מחדש. חברו אותם למיקרו-מניפולטורים והכניסו אותם לתוך תמיסת תא הכיול. בצעו את כל הכיולים והמחקרים בתוך כלוב פאראדיי על שולחן אוויר מעבדתי בעל ביצועים גבוהים כדי להפחית רעשי אות.במהלך הקלטות הפירומטריה, בצעו טלמטריה מחזורית של המתח עבור החיישנים ה-ex vivo בתא הכיול. על ידי העברת החיישנים במחזורים ממינוס 500 millivolts לפלוס 500 millivolts בקצב של 100 millivolts לשנייה למשך 10 מחזורים, הרגישות של החיישנים תשתפר משמעותית; לאחר מכן, בצעו פולריזציה של החיישנים לפלוס 600 millivolts.לאחר המחזור האחרון, זרם החיישן ידעך לרמה יציבה. קריאה מוגדרת תושג לאחר חמש דקות לפחות. רשמו את קריאת האפס, ולאחר מכן הוסיפו באופן רציף כמויות קבועות של תמיסת ATP אל התא כדי ליצור קו כיול המקיף את טווח הגילוי הרצוי של חיישן ה-ATP.תמיסת ה-A TP תייצר שיא חד באות החיישן, שלאחריו יתרחש דעיכה ככל ש-A TP יתפשט באופן שווה ברחבי התא. יש להקליט את ערכי האות לאחר שרמת האות התייצבה. עבור כל הוספה של A TP, הוסף 3 µL ממלאי של 2 mg/mL כדי לבחון את הספציפיות של חיישן ה-A TP.הזרם הנוצר על ידי יישום TP אמור לרדת לרמת אפס; יש להוסיף באופן רציף כמויות קבועות של תמיסת מי חמצן אל התא כדי ליצור קו כיול המקיף את טווח הגילוי, ויש להקליט את ערכי אות החיישן האפסי ברגע שרמת האות תתייצב. עבור כל הוספה של מי חמצן, הוסף 3 µL של cattle lace ממלאי של 2 mg/mL כדי לבחון את הספציפיות של החיישן האפסי. הזרם הנוצר על ידי יישום מי חמצן אמור לרדת לקריאת אפס עבור מחקרי ex vivo.קשרו את העורקים הצליאקי והמסנטרי העליון ואת האבי aorta הבטני מעל עורקים אלה. אך אל תקשרו שתי קשירות סביב ה-aorta הבטני מתחת לעורק הכליתי. קשרו את ה-aorta הבטני דיסטלית, מתחת לעורק הכליתי.סגרו את האורטה בעזרת תפס (clamp) לפחות סנטימטר אחד מעל הליגטורה ומתחת לעורק הכליתי. בצעו קטטריזציה של האורטה הבטנית באמצעות צינור פוליאתילן בין הליגטורה התחתונה לבין התפס. קבעו את הקטטר באמצעות הליגטורה השנייה של האורטה.הסר את התפסן וקשור את העורקים המזנטריים והצליאקיים ואת האורטה מעל עורקים אלה. בצע פרפוזיה לכליה בקצב של six milliliters per minute באמצעות תמיסת המלח המאוזנת של האנק (Hank's balance salt solution) בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד שלוש דקות, עד שהכליה תהיה לבנה לחלוטין. בנוסף, ניתן להחדיר קטטר לווריד הכליתי לצורך איסוף נוזלי הניקוז.באמצעות פינצטה כירורגית, הסר בזהירות את קפסולת הכליה, פעולה הנחוצה להחדרת החיישן. כרית את הכליה, כולל את החלק של האורטה המחובר לקטטר. הנח את הכליה בתוך צלחת פטרי של 3 ml ממולת בתמיסת רחצה.בצעו פרפוזיה לכליה באמצעות תמיסת אמבט דרך האורטה הקנוולה בקצב קבוע של 650 microliters per minute. קבעו את הכליה באמצעות גומיות המתוחות מעליה ומחוברות לצלחת המצופה בסיליקון באמצעות סיכות. מקמו את אלקטרודת הייחוס בקרבת הכליה בתוך פטריית התרבית, כאשר הקצוות שלה טבולים בתמיסת האמבט.מקמו את המיקרו-מניפולטורים להחדרה מהירה של החיישנים אל הכליה. לחלופין, השתמשו בגשש דמה המחובר לכל מיקרו-מניפולטור כדי לסייע בהשגת המיקום הרצוי עבור כל חיישן, למשך זמן שלא יעלה על 20 שניות. הוציאו את החיישן מתא ההידרציה, חברו אותו למיקרו-מניפולטור והחדירו את החיישן לתוך תמיסת הרחצה בצלחת.אם צפויה חשיפה ממושכת יותר לאוויר, טבלו את החיישן לזמן קצר בתמיסת גליצרין לפני כל חשיפה. קטבו את החיישנים באמצעות ה-potentia stat למתח של 600+ millivolts והמתינו עד שהזרם יתייצב. הכניסו כל חיישן לאותו עומק בתוך הכליה.בצע את ניתוח הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. תכנונו של הביוסנסור בעל המיקרו-אלקטרודה האנזימטית מאפשר זיהוי של אנליטים ובכליות שלמות בזמן אמת כדי להשיג תוצאות הדירות. כילוני קדם ו후 מדויקים הם קריטיים.איור זה מציג עקבה מייצגת של האות המופק על ידי ה-X pvo, חיישן TP וחיישן null במהלך כיול של חיישן TP. הליך הכיול יוצר התאמה ליניארית המשמשת לחישוב השינויים הדינמיים של TP. חיישן ה-null מכויל באמצעות הוספת ריכוזים ידועים של hydrogen peroxide לתמיסת האמבט, והערכים הפרמטריים של asim ל-am נרשמים. הוספת זרזים לתמיסת האמבט גורמת לדעיכה מהירה של הזרם.החיישן in vivo מייצר עקבה דומה אך מזהה זרמים רדוקטיביים במקום זרמים חמצוניים, ולכן הזרם הוא שלילי. גם הכיול מניב התאמה ליניארית בטווח של 0.3 עד 80 micromolar. הסגוליות של חיישן ה-in vivo ל-TP לעומת תוצרי פורין אחרים מוצגת כאן. דמות זו מדגימה שינויים בריכוז מימן-פרוקסיד אנדוגני אינטרסטיציאלי המושרים על ידי angiotensin two בכליות שבודדו טרי מחולבים של חולדות עמידות למלח וחולדות רגישות למלח.אנגיוטנסין II גורם לשחרור חריף של מימן פראוקסיד משתי הכליות. עם זאת, האמפליטודות המקסימליות היו גבוהות באופן משמעותי בכליות של חולדות רגישות למלח, במיוחד כאשר הן הוזנו בתזונה עשירה במלח. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שקצה החיישן ופני השטח של קליפת הכליה הם רגישים, ועל כן, פגיעה באחד מהם תפגע בדיוק ההקלטות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן המדידה של חומרים אנדוגניים ושל איברים שלמים כגון הכליה. תוכלו גם לבצע במדויק כיליבibrations והליכים כירורגיים הדרושים להקלטות מוצלחות. יישמנו שיטה זו כדי לחקור רמות בסיס של TP ומימן פראוקסיד, ואת שחרורם בכליה.עם זאת, ניתן להשתמש בגישה דומה כדי לקבוע ריכוזים של adenosine glutamate, גלוקוז וחומרים נוספים כאשר נעשה שימוש בחיישנים תואמים.

use-enzymatic-biosensors-to-quantify-endogenous-atp-or-h2o2

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

סרטון זה מדגים בדיקת אנזים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי לקבוע את פעילות פירופוספוקינאז באמצעות נוקלאוטידים בעלי תווית רדיו. השיטה מספקת תובנות לגבי סינתזת נוקלאוטידים ותגובות פוספוטרנספורט.

בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

אנו מתארים את השימוש בשני חיישנים ביולוגיים, מקודדים גנטי ratiometric, המבוססים על ה-GFP, כדי לפקח על מצב חיזור המיטוכונדריה ורמות ה-ATP ברזולוציה subcellular בתאי שמרי חיים.

Biosensors רציומטרי שלמדוד את מצב חיזור מיטוכונדריאלי וה-ATP בתאי שמרי חיים

כאן אנו מתארים מבחנים ביוכימיים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין תלויי ATP על יכולותיהם 1) לזרז החלקה של נוקלאוזום תלוי ATP, 2) לעסוק במצעי נוקלאוזום, ו-3) הידרוליזה של ATP באופן תלוי נוקלאוזום או DNA.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

פרוטאזות הם מוסדרים בחוזקה אנזימים המעורבים התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, והתקדמות dysregulated פרוטאז פעילות כוננים של מחלות מורכבות כגון סרטן. בשיטה זו המטרה היא ליצור nanosensors המודדים פרוטאז פעילות ויוו על ידי ייצור לאות המחשוף שקיימים משתן מארח ומפלה המחלה.

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

למד כיצד למדוד ATP ומימן פרוקסיד בכליות בזמן אמת באמצעות ביוסנסורים אנזימטיים. הפרוטוקולים מסבירים כיול חיישנים, התקנה כירורגית ומדידות אקס ויוו ואין ויוו.

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H

גלה סרטונים נוספים