Name: משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: למדו שיטה להכנת משטחי כרומוזומים משמרים ולצביעתם באימונופלואורסצנציה. השיטה מאפשרת הדמיית חלבונים הקשורים לכרומוזומים במיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסייעת בחקר ביולוגיית התא והגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי GM50936 מענק NIH ל-DKB.

הערה: חלק מהצעדים להלן דורשים הפרוטוקול עובדים במנדף נקי. בנוסף, השיטה דורשת מיקרוסקופ לנתיחה שמרי הטטרדה מצויד מטרת מרחק 10X עבודה ארוכה כדי לפקח spheroplasting. מיקרוסקופ יש להגדיר בשכונה לפני הזמן. הסר את זרוע micromanipulator ובעל צלחת מההיקף ולמקם את הפריטים האלה במקום בטוח הרחק מאזור העבודה. 1. הכנת Spheroplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתנאי שמרים רצויים. השתמש על 2 x 10 8 תאים עבור כל דגימה, למשל 4 מיליליטר של תרבות בOD600 1.4 = 5 x 10 7 תאים / מיליליטר. למרות עיבוד מיידי של דגימות עשוי להיות עדיף במקרים מסוימים, עבור מרבית היישומים, ניתן לאחסן aliquots הסלולרי בקרח לעד 8 שעות לפני העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות וספין בצנטריפוגה קלינית בהגדרת 5 (2,345 סל&quot;ד / 857.5 XG) במשך 3 דקות עד גלולה התאים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג טיפול לקיחה הבינוני לא לאבד את התאים מגלולים. בעדינות resuspend התאים במאגר ZK מיליליטר 1 ולאחר מכן להוסיף 40 dithiothreitol μl M 1 (DTT). דגירה 2 דקות עם ערבוב עדין. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורים גלולים במאגר ZK 1 מיליליטר. הוסף 5 μl של פתרון מוכן טרי של 100T zymolyase שכבר מעורב באופן יסודי. דגירה במשך 20-30 דקות על 30 מעלות צלזיוס להסיר את דופן התא ולייצר spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay אגל 10 μl של השעיה תא בשקופית מיקרוסקופ כדי לקבוע אם spheroplasting הוא מלא. תאים שנצפו תחת מיקרוסקופ לנתיחה ללא coverslip. תאים אמורים להופיע נפוחים ועגולים ולא מעט מוארכים וצריכים lyse הבא תוספת של 20 μl של מים. אם תאים לא מצליחים lyse, להחזיר את המדגם ל -30 מעלות צלזיוס ומחדש assay כל 10 דקות עד תמוגה מים מושרה הוא ציין בקלות. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend ולשטוף אני תא גלולהn 2.5 מיליליטר MES / חיץ סורביטול קר. תאים גלולה כמו קודם (ראו שלב 1.2). בעדינות resuspend תא גלולה ב300-400 MES / חיץ סורביטול קר μl. יכולים להיות כל הזמן בתאים על קרח בשלב זה לכמה שעות. </li></ol> 2. כרומוזום הפצת הערה: משטחי הזכוכית שעליו כרומוזומים ייפרסו-או שקופיות או coverslips-צריך להיות מוכנים מבעוד מועד. כל שקופית או coverslip צריכה להיות שקוע במים, ואז EtOH, אז להתייבש, ומלוטש עם נייר עדשה. אם הכרומוזומים יתפרסו על coverslips, coverslip צריך להיות מודבקים לשקופית עם סקוטש או מלט גומי. אלא אם נאמר אחרת, שאר הפרוטוקול יתארו מתפשטים משני שקופיות או coverslip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipettor P20, pipet 20 μl של השעיה תא על פני השטח של שקופית נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor P200, להוסיף 40 μl של 3% פתרון PFA / סוכרוז ולערבב בעדינות solution על ידי &quot;מתערבל&quot; השקופיות עם היד עד קווי Schlieren ייעלמו. מניחים שקופיות תחת מיקרוסקופ ולאשר כי תאים הם בפוקוס. את פתרון PFA צריך להיות מוכן טרי-במנדף ביום שימוש. הערה: אם החלבון של עניין לא נבדק על ידי השיטה בעבר, מומלץ להכין שקופיות נוספות באמצעות פתרונות המכילים 2 ו -4% PFA כדי לקבוע אם השמירה של החלבון רגישה לתנאי קיבעון. פתרון / סוכרוז 4% PFA משמש במקרים שבם רצוי לדמיין microtubules טובולין קשור. החסרון של הריכוז גבוה יותר הוא שמקבע את הכרומוזומים יהיו &quot;underspread,&quot; 2% PFA גם נוטה להניב כרומוזומים &quot;underspread&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor P200, להוסיף 80 μl של 1% Lipsol, מערבולת כמו קודם לערבב פתרונות שלמים ככל האפשר, להתחיל טיימר. במידת Lipsol לא זמין, 80 μl 1% NP40 או 80 μl DH 2 O יכולים להיותהוחלף (ראה נציגי תוצאות, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בתאים בזהירות ובעדינות מערבולת השקופית כל 15 שניות. כאשר כ -80% מהתאים lysed (נעלם) לעצור את שעון העצר, להסיר באופן מיידי את השקופית ממיקרוסקופ, להוסיף 80 μl של פתרון PFA / סוכרוז, ומערבולת לערבב. תמוגה צריכה להתרחש מבין 30 ל 90 שניות לאחר תחילת שעון העצר. הערה: אם כמה שקופיות להראות תמוגה בערך באותו הזמן, אחד יכול סופו של דבר להשמיט ניטור מיקרוסקופי לשארית השקופיות ופשוט זמן תקופה שבין תוספת של lipsol ותוספת של aliquot הסופי של מקבע בזהירות. עם זאת, קיצור זה רק אמין בעת ​​הכנת שקופיות מרובות מאותה הדגימה. עדיף לפקח תמוגה של כל דגימה מיקרוסקופית כאשר שקופיות שונות מוכנות מדגימות שנלקחו בזמנים שונים או מתרבויות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על משטח נקי ושטוח ולהפיץ את הנוזל על פני surfac unfrosted כלדואר של השקופית באמצעות הצד של pipet נקי, חד פעמי מרעה שנערך מתחת להמניסקוס של &quot;השלולית&quot; אבל מעל פני השטח של השקופית עצמה, כלומר. לא &quot;לגרוף&quot; את פני השטח של השקופיות עם pipet. אל תעשה שימוש חוזר pipet בשקופיות שונות, כדי למנוע זיהום של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את השקופיות לייבוש למשך הלילה במנדף. רכיבים גרעיניים מסיסים יישבו על פני השטח השקופיות ולהיקשר אליו. לניסויים גדולים, מתכנן את השימוש בחלל לצעד הייבוש חשוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתייבש, תוצאות אופטימליות מתקבלות על ידי התקדמות לשלב immunostaining באותו היום. עם זאת, פתרון סוכרוז המיובש מטביע כרומוזומים התפשטות ב&quot; דבש &quot;המאפשר הקפאה של דוגמאות: ניתן להעביר שקופיות לתיבת שקופיות פלסטיק ומאוחסנות ב -20 ° C במשך שנים. </li></ol> 3. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות בתמונה 0.2%-פלו למשך 30 שניות. כדי להסיר דבש. שקופיות להישען עלקצה, עם הקצה מונח על מגבת נייר, כדי להסיר תמונה-פלו שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות ב1x TBS במשך 5 דקות לשטוף. הסר נוזל עודף על ידי נשען שקופיות על קצה, אבל לא נותן להם להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות חלבית צד עד, pipet 300 μl TBS / BSA לשקופית מעבר לחלק unfrosted של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתא לח על RT במשך 15 דקות. (מיכל פלסטיק גדול מרופד במגבות נייר מים רוויים בתיבת שקופיות לוחית מתכת או פלסטיק מחוררת עם מגבות נייר רוויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים שקופיות על ידי מנוחה קצה קצר של השקופית על מגבת נייר ונשען השקופית נגד תמיכה מתאימה (כגון מדף מבחנה). אל תאפשר משטח לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחיל 80 μl של חיץ TBS / BSA המכיל את הדילול המתאים של נוגדן ראשוני. אם נוגדן הגבלה, להשתמש 40 μl וcoverslip 22 מ&quot;מ x 22. לסרום ארנבת גולמי, זה בדרך כלל בין דילול 1/50 ו1/500. הערה:בצע titrations להכנות נוגדן חדשים. ההכנה לדלל ביותר שתשואות גבוהות אות מעל הרקע נבחרה. כדי לשלוט על הרמה של מכתים רקע, צריכים להיות מוכנים מזן המוטציה המחיקה המתאים ו / או שקופיות כפולות גרעינים צריכים להיות מוכתם בדם לפני חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip 22 x 50 מ&quot;מ מלוטש בשקופית הימנעות בועות. לעשות זאת על ידי החזקת coverslip בין האגודל והאצבע לאורך הקצה הארוך בעמדות ליד קצה אחד קצר. מחזיק coverslip בביחס זווית של 30 מעלות כדי להחליק, הרחוק ביותר מקצה קצר האצבעות הוא הוריד עד שהיא נחה בשקופית רק בתוך קצה &quot;השלולית&quot; הקרוב ביותר לאזור החלבית של השקופית. אז לאט לאט להוריד את coverslip בתנועה חלקה עד האצבעות מחזיקות את מגע שקופיות הספסל, ולאחר מכן שחרר. אל תנסה להתאים את המיקום של coverslip רגע שנוחת. הערה: אם מרווחי כרומוזום הוכנו עלcoverslips המודבק (ולא ישירות על פני השטח של שקופיות), coverslip מדגם זה יישאר מודבקים לשקופית בכל שלבי הצביעה וכביסה. Coverslip נוסף יוצב על גבי coverslip המדגם להפיץ את פתרון הנוגדנים באופן שווה במהלך מכתים ולאחר מכן הושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בתא לח אטום ודגירת הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק העברת הקצה החלבית השקופיות למדף צביעת שקופיות זכוכית ולצלול בצנצנת מכתים המכילה TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לטבול את השקופית למעלה ולמטה כדי להסיר את coverslip. נסה לא להשתמש בכוח רב מדי כדי לעשות את זה. שטוף את שקופיות 2x 10 דקות על ידי השריית בTBS. הסר שקופיות ממדף וניקוז נוזל עודף על ידי הנגיעה קצה למגבת נייר. אל תתנו יבש פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אור עמום, מייד להוסיף 80 μl TBS / BSA המכיל דילול פי 1/1000 של נוגדן fluorochrome מצומדות המשני (או 40 μl עם coverslip 22 x 22 מ&quot;מ). מודעהcoverslip ד כמו קודם ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 בתא הלח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverslips כמו קודם, לנקז שקופיות, ולאפשר משטח לייבוש באוויר ל1-2 שעות בחושך. שקופיות להישען על מגבות נייר כמו קודם. הערה: אם הפצה בוצע על coverslip רכוב, לנתק את coverslip מהשקופית לפני הייבוש. אז coverslips מיובש כפי שתואר עבור שקופיות בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת אור מאופק, להוסיף כ -30 μl של הרכבה בינונית מכיל DAPI (שלוש 10 טיפות μl) ולאחר מכן להוריד את coverslip בזהירות. אם המרווחים הם על coverslips, למקם את הטיפות של מדיום הרכבה בשקופית נקייה ולהפחית את coverslip, צד כרומוזום למטה, לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדיין באור עמום, לחכות 2 דקות לcoverslip להתיישב ולאטום קצוות של coverslip עם לק ברור. מניחים שקופיות בתיבת שקופיות שטוחות. הערה: למיקרוסקופיה STED, הר עם להאריך זהב. השתמש 30 μl של להאריך זהבללא DAPI ולאפשר לרפא לילה. איטום עם לק הוא מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בשקופיות על ידי מיקרוסקופ epifluorescence widefield עם 40 או אובייקטיבי 100X באמצעות מסנן להגדיר מתאים לDAPI להתמקד. לחלופין לאחסן את השקופית בחושך על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לא להקפיא. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הופעתם של גרעינים מפוזרים תלויה באופן קריטי באיזון בין קיבוע לטיפול בליזיס/דטרגנטים. כפי שנדון לעיל, שימור מבנים תאיים משתנים מחייב שימוש בריכוזי PFA שונים. עבור רוב החלבונים, 3% PFA הוא אופטימלי. עם זאת, שימור צירים דורש שימוש ב-4% PFA. אפילו עם קבוצה אחת של ריאגנטים, תזמון הליזיס ביחס לקיבוע יכול להשפיע גם על איכות הגרעינים המתפשטים. לקבלת התוצאות העקביות ביותר, יש לנרמל את זמן הליזיס עבור כל דגימת ספרופלסט על ידי תצפית ישירה על ליזה במיקרוסקופ אור. לעין המאומנת, ספרופלסטים עגולים מתכהים כשהם מתנפחים לפני הליזיס; ל...

שמרי ניצני Saccharomyces cerevisiae מציעים יתרונות רבים ללימודים של מנגנונים מולקולריים של תהליכים ביולוגיים, כוללים המחקר של חלבונים השולטים פונקצית כרומוזום. למרות שיש יתרונות ידועים של שמרי ניצנים למחקרים גנטיים, מולקולריים, וביוכימיים, מחקרי ציטולוגית של ההפצה של חלבונים בגרעין התא מסובך על ידי גודלו הקטן. יש שמרי הגרעין הטיפוסי בקוטר של פחות ממיקרון אחד, וזה רק על 5 פעמים גבול הרזולוציה של אור הנראה. לפיכך, כמות המידע על ההפצה של חלבונים גרעיניים שניתן להשיג מimmunostaining הקונבנציונלי או באמצעות תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מוגבלת. גישה שימושית לאפיון הפצת subnuclear של חלבונים היא משטח כרומוזום הפצה. גישה זו כרוכה בהסרת קיר התא, שיבוש תא וקרום גרעין, וllowing תוכן בלתי מסיס של הגרעין להתיישב על פני השטח של שקופיות מיקרוסקופ. רכיבים מסיסים אלה כוללים את המטריצה ​​הגרעינית וכרומוזומים. בנוסף מאפשר הסרת תוכן גרעיני מסיס, אשר משפרת את היכולת לזהות חלבונים מחויבים הכרומטין, כרומוזום הפצת תוצאות שיטה בלחץ משמעותי של כרומוזומים כך שיש לי גרעיני התפשטות קטרים ​​של 3 עד הסביבות 5 מיקרומטר (לגרעיני meiotic דיפלואידי) ו 2 עד 3 מיקרומטר לגרעיני mitotic דיפלואידי. לחץ זה מאפשר זיהוי של מסד גרעיני שקשה יחסית או בלתי אפשרי לפתרון בגרעינים שלמים. חסרון ברור לכרומוזום הפצה הוא האפשרות שהליך הפצה עשוי באופן חלקי או לחלוטין לשבש את המבנה של עניין. מדאיג במיוחד הוא שחלבון כרומוזום מחויב מסוים עלול ללכת לאיבוד כתוצאה מההליך מתפשט. שו סיבוך פוטנציאלי זהLD לזכור כאשר לפרש נתונים. דוגמא אחת של חלבון שהוא רגיש להליך הפצה היא בטא טובולין. בתנאים מסוימים, הציר, המורכב בעיקר מטובולין, נשמר במהלך הפצת 3. ויזואליזציה של הציר היא לעתים קרובות שימושית לשלב גרעינים של עניין. עם זאת, הדמיה טובולין דורשת טיפול עם מקבע ריכוז גבוה; צירים הולכים לאיבוד בתנאים הסטנדרטי המתוארים להלן. דוגמא זו ממחישה כי, בעת ניתוח ההפצה של חלבון uncharacterized בעבר, חשוב לגוון את הריכוז של מקבע כדי לקבוע כיצד רגיש החלבון הוא וריאציה כזו. למרות הדאגה לגבי ההשפעה של תנאי הפצה במבנה הכרומוזומים, השירות וכוחה של שיטת הפצה הודגם בהקשרים רבים ויש לו שירות רחב באפיון של mitotic ו, במיוחד תאי meiotic 4-7. Two שיטות הפצה נעשתה שימוש נרחב. הראשון של שיטות אלה, שפותחו על ידי השידה וג&#39;ירו 8, ימנע את השימוש בחומרי הניקוי ויכול להניב הכנות התפשטות שנראה שיש לי מורפולוגיה כרומוזום יחסית השתמרה היטב כאשר מוכתם עבור DAPI צבע DNA הספציפי. עם זאת, שיטה זו היא קשה יחסית למושלם והאיכות של גרעיני ההתפשטות משתנה באופן דרמטי, כאשר אזור אחד של שקופית בהשוואה לאזורים אחרים. בעיה זו יכולה לסבך גישות כמותיות שכרוכות הדמיה רבות גרעינים שלא נבחרו משקופית אחת, כדי למנוע הטיה רכישת נתונים. כרומוזום השני הפצת שיטה, שפותח על ידי Loidl ו1 קליין, כרוך איזון קיבעון על ידי paraformaldehyde, עם תמוגה ולחץ הכרומטין מקודם על ידי תמיסת ניקוי. כאשר מבוצעים כהלכה, שיטה זו נותנת תוצאות מאוד לשחזור עם פחות וריאציה אזור לאזור בהשוואה לשיטת השידה וג&#39;ירו. מצגת זו מתמקדת בmodifieגרסת ד של השיטה של ​​Loidl וקליין, בגלל האמינות והפשטות שלה. כרומוזום הפצה היא לא מסובכת או זמן רב; ניתן להכין עד 100 שקופיות עבור immunostaining ביום אחד. יתר על כן, הכנות ההתפשטות ניתן לאחסן במקפיא במשך שנים לפני immunostaining, ובכך מעבדות יכולות לפתח מאגר של ממרחי כרומוזום קפוא, שניתן להשתמש בי שאלות ביולוגיות חדשות להתעורר או חומרים כימיים צביעה חדשות הופכים לזמינים. שיטת כרומוזום הפצה היא נפוצה ביותר בשילוב עם immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, אבל אפשר גם להכין שקופיות לשיטות אור ברזולוציה סופר מיקרוסקופיות כגון דלדול פליטה המאולץ מיקרוסקופיה (STED).

<table><tbody><tr><td>זימוליאז</td><td>ארה"ב ביולוגית&nbsp;</td><td>Z1004</td><td>הכן תמיסה של 20 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"מ Tris pH 7.5 בתוספת 2% גלוקוז. מכינים טרי כל ניסוי ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד שמוכן לשימוש.</td></tr><tr><td>ליפסול&nbsp;</td><td>ל.י.פ. בע"מ&nbsp;</td><td>כבר לא זמין מסחרית</td><td>הכן תמיסה של 1% (v/v) במים. יש לאחסן על קרח.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>הכן תמיסה של 1% (v/v) במים. יש לאחסן על קרח.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip סטנדרטי</td><td>Fisher</td><td>12-544-E או 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips ברזולוציה גבוהה</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>הכן תמיסה של 0.2% (v/v) במים.&nbsp;</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 24.7 מ"מ Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>הכן תמיסה של 1% (w/v) ב-TBS. אחסן ב-4&deg; C עד חודש.</td></tr><tr><td>נוגדן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ראשי Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) נוגדן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה מדיה עם DAPI</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong זהב</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק שקופיות תיבת</td><td>פישר</td><td>03-448-1</td><td>אחסן שקופיות המכילות ממרחים מיובשים בחריצים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. כמו כן, השתמש כתא רטוב.</td></tr><tr><td>קופסת שקופיות קרטון</td><td>פישר</td><td>12-587-10</td><td>השתמש להובלה נוחה של שקופיות מוכתמות/אטומות או לאחסן ב-4&deg;C.</td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td>פישר</td><td>08-816</td><td>לשימוש ככיור למגלשות.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

משטח הפצת וimmunostaining של כרומוזומים שמרים

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

הגודל הקטן של גרעיני השמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae מגביל את התועלת של מיקרוסקופ אור לניתוח ההתפלגות התת-גרעינית של חלבונים הקשורים לכרומטין. התפשטות פני השטח של גרעיני שמרים מביאה להתרחבות הכרומטין ללא אובדן חלבונים קשורים. שיטה להתפשטות פני השטח מאזנת קיבוע של חלבונים הקשורים ל-DNA עם טיפול בחומרי ניקוי. השיטה שהודגמה שונה מעט מזו שתוארה על ידי יוזף לוידל ופרנץ קליין1,2. השיטה שימשה לאפיון לוקליזציה של חלבונים רבים הקשורים לכרומטין בשלבים שונים של מחזור התא המיטוטי, אך היא שימושית במיוחד לחקר מבני כרומוזומים מיוטיים כגון רקומבינוזומים מיוטיים והקומפלקס הסינפטונמלי. אנו מתארים גם שינוי שאינו דורש שימוש בליפסול, חומר ניקוי קנייני, שנדרש בהליך המקורי, אך אינו זמין עוד מסחרית. מתואר גם פרוטוקול צביעה חיסונית התואם לשיטת התפשטות הכרומוזומים.

המראה של גרעיני התפשטות ביקורתי תלוי באיזון בין קיבעון כרומוזום ודה-דחיסה. גם כאשר ריאגנטים מאוזנת כראוי, וריאציה במידת כרומוזום דה-דחיסה יכולה להתרחש באזורים שונים של אותה השקופית ו / או בין שקופיות שונות. לפיכך, את האיכות של מרווחים באזור נתון של שקופית יש לבחון לפני תמונות מתפרשות. ההשפעות של &quot;פורש&quot; ו- &quot;underspreading&quot; ניתן להדגים באמצעות נוגדנים נגד חלבוני רקומבינציה meiotic. באיור...

מוצגת שיטה לכרומוזומים המתפשטים על פני השטח משמרים ניצנים. שיטה זו נגזרת משיטה שתוארה בעבר על ידי לוידל וקליין. בנוסף, אנו מדגימים הליך לצביעה חיסונית של כרומוזומים מפוזרים.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ויזואליזציה של חלבונים הקשורים לכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת דופן התא באמצעות טיפול באנזימים. אני אוליס.השלב השני הוא ליזיס של התא לממברנות גרעיניות באמצעות הלם אוסמוטי, בדרך כלל בעזרת דטרגנט. פעולה זו מתבצעת בנוכחות ריכוז נמוך של חומר מקבע כדי לשמר את מבנה החלבון. לאחר ליזיס התא, מעלים את ריכוז חומר הקיבוע כדי לייצב עוד יותר את מבני החלבון.לאחר מכן, התאים שעברו ליזיס מועברים לפסחית מיקרוסקופ, ונותנים לגרעינים לשקוע על פני השטח של הפסחית. השלב הסופי הוא צביעה אימונוהיסטוכימית של הדגימות. שיטת הצביעה האימונוהיסטוכימית העקיפה המוצגת כאן משתמשת בנוגדן ראשוני הנקשר לחלבון הנחקר ובנוגדן משני המסומן פלואורסצנטיתי הנקשר לנוגדן הראשוני.בסופו של דבר, מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה משמשת לבחינת ההפצה של חלבונים הקשורים לכרומוזומים. תמונות מייצגות אלו הן של גרעין מיטוטי פרוס, שצבעו אימונו-היסטוכימית עבור חלבוני הרקומבינציה DMC1 ו-RAD51. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני השיטה הנפוצה האחרת, שהוצגה על ידי Mike Dresser ו-Craig Deru, הוא שרוב שטח הפסח של הפסיתה יכיל גרעינים פרוסים באופן אופטימלי, מה שמקל על השגת תמונות של מספר רב של גרעינים פרוסים מפסיתה אחת.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בחקר מבנים תת-גרע

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד...

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

בפרוטוקול זה, הגן ביטוי שמרים...

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למדו שיטה להכנת משטחי כרומוזומים משמרים ולצביעתם באימונופלואורסצנציה. השיטה מאפשרת הדמיית חלבונים הקשורים לכרומוזומים במיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסייעת בחקר ביולוגיית התא והגנטיקה.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

גלה סרטונים נוספים