מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca ^{2 +} ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

המטרה הכוללת של הליך זה היא למפות בו זמנית אופטית את הרטיקולום התוך-סרקופלזמי, הסידן והפוטנציאל הטרנסממברני בלב הארנב המבודד השלם. זה מושג על ידי כריתת לב הארנב תחילה וקנולציה של אבי העורקים לזלוף לאנור לאחור. השלב השני הוא ביטול התכווצות על ידי הוספת ניתוק התכווצות עירור לשמונה הפרפו.

לאחר מכן, הזלוף מועבר ללולאת מחזור בנפח קטן ומתווסף מחוון סידן בעל זיקה נמוכה בטמפרטורת החדר. השלבים האחרונים הם לחמם את הלב ל-37 מעלות צלזיוס באמצעות לולאת השפע בנפח גדול ולהוסיף את הצבע הרגיש למתח. לפיכך, במהלך הניסוי נמדדים שינויים בסידן ובפוטנציאל הטרנסממברני על ידי גירוי הלב באור כחול ומדידת האור הנפלט במצלמות CM OS במהירות גבוהה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור ישירות רשתית סרקופלזמית או SR עבור דינמיקת סידן קצרה ללא הפרעה מאותות סידן טרנסממברניים. שיטה זו יכולה גם לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות לתפקיד הטיפול בסידן SR בתרומה להפרעות קצב, מכיוון שפוטנציאל טרנסממברני נרשם במקביל לסידן SR, בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שאותות סידן SR אופטיים הם משרעת נמוכה מאוד. לכן, טעינה נכונה של מחוון הסידן חיונית לפרוטוקול זה, יש צורך בתמיסת טירו טרייה בהישג יד.

ארבעה ליטר יספיקו. אל תערבב את תמיסות המלאי המרוכז ללא דילול. כמו כן, הכינו את התמיסות האחרות מראש לפי ההוראות בפרוטוקול הטקסט בועות את אספקת הטירוס עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני, והתאימו את זרימת הגז כדי להגדיר את ה-pH של התמיסה קרוב מאוד ל-7.4.

הפתרון צריך להיות בטמפרטורת החדר. הכן את מערכת הזלוף L אנדורף המחזורית על ידי הנחת מסנן ניילון מוטבע עם נקבוביות של 11 מיקרון לסינון ה-perfu sate. כעת הפעילו את מערכת השפע הראשית עם כשני ליטרים של טירוס מחומצן.

הנפח הכולל של שני ליטר כולל את התמיסה במאגר. לאחר מכן, הכינו והקימו קו שפע קצר שעוקף את מאגר התמיסה על מנת ליצור לולאת שפע מחזורית בנפח קטן לשפעת או חמש בבוקר. הורדת הנפח הכולל במערכת המחזור הקטנה יותר צריכה להיות כ-150 מיליליטר.

כדי להכין את מערכת ניטור הלחץ, חבר מתמר לחץ לקו השפע וחבר את הפלט של המתמר למגבר גשר טרנס. כעת הפעל את מערכת רכישת הנתונים. הגדר אותו לניטור רציף של האק"ג ולחץ השפע.

לאחר מכן, התאם את לחץ הזלוף הבסיסי לאפס מילימטרים של כספית. לבסוף, יישר את מצלמת המיפוי האופטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל לאבטח את הארנב ולהרדים אותו עם פנטוברביטל, יחד עם בולוס של 1000 יחידות הפרין.

כסו את העיניים כדי להרגיע את הארנב. התחל בחתך בקו האמצע כדי לחשוף את עצם החזה והצלעות באמצעות מספריים עם קצה קהה. חותכים את עצם החזה בין ה-xiphoid ל-meibum.

לאחר מכן, פתח בזהירות את עצם החזה מבלי לפגוע בלב ופזר את הצלעות כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן הסר במהירות את כל גוש ריאות הלב על ידי חיתוך כל כלי הדם והרקמות שמסביב. העבירו את גוש ריאות הלב לכ-100 מיליליטר של תמיסת טירו קרה כקרח.

בגוש הרקמה שנכרתה, אתר את אבי העורקים וחתך את אבי העורקים העולה בדיוק קרוב לשלושת הענפים של קשת אבי העורקים. לאחר מכן קנול את אבי העורקים עם צינורית שמונה מד המחוברת למערכת השפע. אבטח את אבי העורקים לצינורית בעזרת חתיכת תפר משי אפס USP.

לאחר אבטחת הצינורית, נתחו בזהירות את קנה הנשימה, הריאות והשומן האפיקרדיאלי. לאחר מכן, זהו את המסתם המיטרלי והשתמשו בזהירות במלקחיים חדים ובמספריים כדי לפגוע בעלון אחד או להסיר אותו. לפיכך, גודש בתמיסה בחדר השמאלי לא יכול להתרחש.

המשך על ידי טבילת הלב בתא הזלוף אופקית כשהצד הקדמי כלפי מעלה. מניחים את הצינורית על חתיכת סארד. אבטח את הצינורית בעזרת סיכות בצורת U המוכנסות דרך חתיכת הסארד ולתחתית הסיליקון של צלחת הזילוף.

זה ימנע מהלב לנוע. במהלך ההדמיה, ניתן להשתמש בסיכת חרקים קטנה כדי לייצב את הקודקוד במידת הצורך, למדוד את כמות תמיסת הטיירו המשמשת במהלך הקנולציה ולהחליף אותה בתמיסה טרייה כדי לשמור על תמיסת המחזור הכוללת על שני ליטר. כעת טבלו את אלקטרודות האק"ג באמבטיה משני צידי הלב, אך לא במגע עם הלב.

לאחר מכן ודא שזה גורם למורפולוגיה של א.ק.ג נורמלית. בינתיים, שמור על לחץ אבי העורקים ב-60 עד 70 מילימטרים של כספית על ידי התאמת זרימת הפרפוסים בין 25 ל-35 מיליליטר לדקה. כעת, כבו את אורות החדר והוסיפו 0.3 עד 0.6 מיליליטר של תמיסת מלאי סטטינים BLEs לשמונה PERFU לריכוז סופי של 10 עד 20 מיקרומולר.

לאחר 10 עד 15 דקות, התכווצויות הלב אמורות להיפסק. לאחר מכן עברו למערכת השפע בנפח קטן. אחד המפתחות להדמיית סידן SR מוצלחת הוא טעינה נכונה של צבע הזרימה של חמישה N am.

זה דורש זלוף בנפח קטן כדי להשיג ריכוז צבע גבוה ותנאי טמפרטורת החדר. כדי למנוע אסטריפיקציה D של ה-D בציטוזול, הכינו כעת 500 מיקרוליטר של תמיסת העמסה של שפעת O 5 N am וערבבו אותה עם 500 מיקרוליטר של תמיסת כביש. לאחר מכן הוסף אותו לשמונה PERFU.

תן להורדה להמשיך במשך 45 דקות ולאחר מכן הפעל את אמבט המים במחזור כדי לחמם את המערכת ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר שעה של הורדה, חזור לנפח הגדול יותר של Perfu eight. לאחר מכן, מערבבים 50 מיקרוליטר של הצבע הרגיש למתח RH 2 37 לתוך מיליליטר של טירוס חם.

הזרקו אותו לאט למערכת במשך כחמש דקות והמשיכו במיפוי האופטי של הלב. כדי להתחיל, מקד את מצלמות המיפוי האופטי בשדה המתאים כדי להפחית את התנועה על משטח שמונה PERFU. צף החלקת כיסוי על התמיסה.

כעת כוונן את אלומת האור LED כדי לספק תאורה אחידה ללב. עבור כל הקלטה אופטית, הגדר את פרוטוקול הקצב הרצוי. הפעל את נורית העירור ואסוף שניה עד ארבע שניות של נתונים תוך שעה עד שעתיים.

רעש מצבע שדלף ישים קץ לניסוי. לאחר מכן שטפו את המערכת במים נטולי יונים. לאחר מכן 70% אתנול ומסיימים בשטיפה נוספת של מים נטולי יונים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר, ניתן להפריד בין ההפרדה הספקטרלית של אות הפוטנציאל הטרנסממברני לבין הרטיקולום הסרקופלזמי או אות הסידן SR. עקבות אופטיים במהלך קצב רציף תועדו גם הם. לאחר מכן נבנו מפות הפעלה מהנתונים על ידי התוויית זמן ההפעלה של כל פיקסל.

בגרף איזוכרונלי, יש עיכוב אופייני של שמונה עד 10 אלפיות השנייה בין שני האותות. ניתן היה לכמת את השינוי היחסי ב-SR הדיאסטולי. עומס סידן ומשרעות שחרור סידן SR סיסטולי במחזורי קצב שונים. טיפול פתולוגי בסידן SR נצפה בעקבות יישום אגוניסט קולטן בטא אדרנרגי איזופרוטרנול.

החצים האדומים מצביעים על דליפת סידן ברורה מה-sr. בתנאים אלה, יכול להתרחש טריגר בתיווך סידן של פוטנציאל פעולה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבצע מיפוי אופטי בו זמנית של פוטנציאל טרנסממברני ואותות סידן SR בלב הארנב השלם של לאנג אנדורף.