Name: מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca 2 + ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: למד מיפוי אופטי כפול של פוטנציאל טרנסממברני וסידן תוך-רשתיתי בלב ארנב מבודד בפרוזקול Langendorff. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של דינמיקת סידן SR ופעילות חשמלית לבבית בו-זמנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01 HL 111600) ואיגוד הלב האמריקאי (12SDG9010015).

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, ודבקו במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי מניות (25x) מרוכזות של הפתרון של Tyrode שונה מראש ולאחסן ב 4 ° C: (1) במלאי אני (מ&quot;מ: 3,205 NaCl, CaCl 2 32.5, KCl 117.5, Nah 2 PO 4 29.75, MgCl 2 26.25) ו (2) במלאי II (מ&quot;מ: NaHCO 3 500). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין הפתרון של 2 L Tyrode של הרכב הבא (מ&quot;מ): NaCl 128.2, CaCl 2 1.3, KCl 4.7, MgCl 2 1.05, Nah 2 4 1.19 PO, NaHCO 3 20 וגלוקוז 11.1 על ידי שילוב של 1,840 מיליליטר של deionized (DI) מים, 80 מיליליטר צילומים אני, 80 מיליליטר של המלאי השני, ו4 גרם של גלוקוז. אל ישירות לערבב צילומים אני וצילומים השני; להוסיף אתמ &#39;ל1,840 מיליליטר DI כדי למנוע משקעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של blebbistatin uncoupler עירור-ההתכווצות ב 10 מ&quot;ג / מיליליטר בdi-methylsulfoxide נטול מים (DMSO) מראש ולאחסן את פתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות של צבעי ניאון: (1) RH237 מתח רגיש לצבוע (1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO) ו- (2) מחוון סידן זיקה נמוכה Fluo-5N בבוקר (2 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO) על פי המלצות יצרן. השתמש בהכנות מייד כדי למנוע פירוק עם האובדן הבא של קיבולת טעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת הסירקולציה המחודשת Langendorff זלוף עם חומץ (95% O 2, 5% CO 2) הפתרון של Tyrode. התאם את הזרימה של O 2 / CO 2 כדי לשמור את ה- pH של הפתרון של Tyrode 7.4 ± 0.05. השתמש במסנן נקי ב- קו ניילון ארוג (גודל נקבובית: 11 מיקרומטר) כדי לסנן את perfusate ברציפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת זלוף ב RT, כloadi הבאng של Fluo-5N בבוקר מתבצע על RT. לטעינה בבוקר Fluo-5N, להשתמש במספר קטן של perfusate הסירקולציה המחודשת (~ 150 מיליליטר). לאחר טעינת צבע, להשתמש נפח גדול יותר של perfusate (1 - 2 L, ראה איור 1 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מערכת רכישת נתונים ולהתכונן לניטור רציף של לחץ א.ק.ג. וזלוף. הכן מערכת לחץ ניטור: חבר מתמר לחץ לקו זלוף ולפקח על לחץ זלוף עם מגבר transbridge. התאם את לחץ זלוף בסיס ל0 מ&quot;מ כספית כאשר הלב אינו מחובר למערכת זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את המצלמות אופטי מיפוי על מנת להבטיח יישור המרחבי בין מ &#39;V וCa 2 + אותות SR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להתמקד על ידי הצבת מצלמות שליט או אובייקט עם טקסט לתוך צלחת זלוף. הפעל מצלמות מיפוי למצב תצוגה חיה ולהתאים את המיקוד עד שהטקסט הוא חד וברור. לרכוש תמונת מסגרת אחת מכל מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסויתמונות ואלה להתאים את השקיפות של תמונה העליונה כך ששני התמונות הן נראה לעין. הטקסט בתמונות צריך לחפוף בדיוק. אם לא מיושר לגמרי, להתאים את הזווית של מראה dichroic או את המיקום של כל מצלמה עד שני התמונות מיושרות. </li></ol></li></ol> 2. קציר, זלוף, ודיי-טעינה של לב ארנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הארנב בעוצר ארנב אושר. עמוק להרדים באמצעות הזרקה תוך ורידית (וריד אוזן שולי) של נתרן pentobarbital (50 מ&quot;ג / קילוגרם) והפרין (1,000 IU). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוצג הארנב חסר של רפלקסים nociceptive, לעשות חתך בעור קו האמצע כדי לחשוף את עצם החזה וצלעות. לחתוך את עצם החזה עם מספריים כירורגיות בוטים-טיפ מxyphoid לmanubrium. יש להיזהר שלא לפגוע בלב בעת פתיחת עצם החזה. מורחים את הצלעות כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות בלו כל גוש לב-הריאה במהירות על ידי חיתוך כל הכלים ורקמות חיבור. Immediately למקם את בלוק לב-ריאה לפתרון של Tyrode קר כקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את אב העורקים לזלוף מדרדר. חותך את אב העורקים עולים רק הפרוקסימלי לשלושה הסניפים של קשת אב העורקים. Cannulate אב העורקים לצינורית 8 G המחובר למערכת זלוף. השתמש בפיסת תפר 0 משי USP כדי לאבטח את אב העורקים על הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את קנה הנשימה, ריאות, ושומן epicardial מהלב. עם מלקחיים חדים ומספריים לנתיחה, לאתר את שסתום צניפי ובזהירות נזק או להסיר עלון אחד כדי למנוע גודש פתרון בחדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הלב בתא זלוף-מקטורן הזכוכית אופקי עם המשטח הקדמי של הלב כלפי מעלה להדמיה. אבטח את הצינורית לפיסת Sylgard עם סיכות בצורת U על תחתית סיליקון של המנה, כדי למנוע תנועה של הלב במהלך המיפוי (1D איור). אם תרצה, להכניס סיכת חרקים קטנה בשיא של הלב לSTAbilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רל עמדה (ECG) אלקטרודות באמבטיה בצד הימין וצד שמאל של הלב. באופן מלא להטביע את האלקטרודות באמבטיה ולוודא שהם לא במגע עם משטח הלב לספק א.ק.ג.-נערך נפח מקביל לתצורה אני עופרת. ודא מורפולוגיה אני א.ק.ג. עופרת רגילה. התאם את הזרימה (25 - 35 מיליליטר / דקה) כדי להבטיח שלחץ אב העורקים נשמר 60 - 70 מ&quot;מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר ולהוסיף 0.3-0.6 מיליליטר של תמיסת blebbistatin מניות (שלב 1.2) לperfusate (הריכוז סופי 10 - 20 מיקרומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר, כדי למנוע photoinactivation של blebbistatin. במידת צורך, זרקור קטן או פנס יכול לשמש כדי לספק תאורת משימה. הערה: Blebbistatin הוא מעכב ATPase שרירן וuncoupler עירור-התכווצות. בגלל טעינת Fluo-5N דורשת תנאים מורחבים (60 דקות) RT (היפותרמיה) (ראה צעדים 2.8-2.10), ייצור אנרגיית לב עלול להיות בסכנה. הerefore, תוספת של blebbistatin לperfusate לפני לצבוע טעינה עשוי להפחית את הביקוש לאנרגיה 16 ולחסל חפצי תנועה במהלך הקלטות אופטיות עוקבות 17. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התכווצות של הלב חדל (10 - 15 דקות, מאומתות על הקלטת לחץ אב העורקים), לעבור למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-הנפח (ראה שלב 1.4.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולטעון פתרון טעינת Fluo-5N בבוקר: הוסף 0.25 מיליליטר של פתרון מניות Fluo-5N בבוקר (שלב 1.3) עד 0.25 מיליליטר 20% F127 pluronic החם. הוסף 0.5 מיליליטר הפתרון של Tyrode החם לתערובת, מערבב היטב, ולהוסיף למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-הנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח באופן רציף לחץ זלוף וא.ק.ג. ולהתאים את הזרימה במידת צורך. טעינת צבע לוקחת כ 1 שעה ב RT. 45 דקות לאחר הטעינה החלה, להפעיל את אמבט מים במחזור להתחיל מחממים את מערכת זלוף וperfusate עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות של טעינת Fluo-5N בבוקר, swiטצ זלוף למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת נפח הגדול יותר (ראה שלב 1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 μl של פתרון מניות RH237 הצבע רגיש מתח (שלב 1.3) ב 1 מיליליטר של הפתרון של Tyrode החם ולהוסיף לאט (מעל ~ 5 דקות) להפרוקסימלי נמל הזרקה לצינורית. </li></ol> 3. מיפוי אופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגעים האחרונים של טעינת צבע, למקם את הלב ולמקד את המצלמות אופטי מיפוי על מנת להבטיח את השדה המתאים מבט לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, למקם את האלקטרודה צעדה דו קוטבית על פני השטח epicardial של הלב לצעדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פלסטיק או זכוכית לכסות להחליק על פני השטח של תא זלוף להפחית חפץ תנועה על פני הנוזל שיכול להיות נוכח בשל מחזור של perfusate. הערה: כחלופה ללהחליק את המכסה, להשתמש כיסוי פלסטיק נקי 50 מ&quot;מ פטרי צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד מדריכי האור כדי להאיר את פני השטח של הלב עם דואר אחידxcitation אור. השתמש בדיודה כחולה פולט אור (LED) מקורות אור ועוד לסנן את האור עם 475-495 מסנן bandpass ננומטר (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף הקרינה נפלטת עם macroscope ושתי מצלמות מיפוי משלימות תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) אופטיות. לפצל את האור הנפלט עם מראה dichroic ב545 ננומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארוך לעבור לסנן את מחצית אורך הגל ארוכה יותר, המכיל את האות מ &#39;V, ב 700 ננומטר. להקה עוברת לסנן את מחצית אורך גל הקצרה יותר, המכיל את אות Ca 2 + SR, 502-534 ננומטר (איור 1 א). הגדר את התדירות של רכישת נתונים אופטית ל0.5-1 קילו-הרץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל הקלטה אופטית, ליזום ראשון פרוטוקול צעדה הרצוי, להדליק את אור העירור, ולאסוף 1 - 4 שניות של נתונים. אם תרצה, לסנכרן את רכישת פרוטוקולי צעדה ונתונים. הערה: לא ניתן לטעון מחדש Fluo-5N בבוקר, ולכן יחס אות לרעש (SNR) יהיה decrease לאורך הניסוי בשל לצבוע דליפה מSR. הגבל את פרוטוקול ניסוי ל1 - 2 שעות על מנת להבטיח ערכי SNR גבוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הניסוי, לשטוף את מערכת זלוף ברצף של מים DI, 70% אלכוהול מגיב, ושוב עם מים די. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן כל בסיס הנתונים עם מסנן מרחבי גאוס (רדיוס 3 פיקסלים) באמצעות חבילות תוכנה זמינות באופן מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, מרחבית ליישר מ &#39;V וערכות נתונים SR Ca 2 +. כמו בשלב 1.6, תמונות של שכבות מכל מצלמה ולוודא שהמבנים אנטומיים של הלב (כלומר., כלי דם כליליים, קצוות של הפרוזדורים או חדרי הלב) או פריטים אחרים בשדה הראייה (כלומר, צינורית, אלקטרודה צעדה) בדיוק חפיפה. אם לא, יישור המרחבי של מערכי נתונים הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shift תמונה השקופה העליונה בX וה- Y הכיוון עד חפיפה מדויקת מושגת, מה שהופך את ההערה של מספר פיקסליםהתמונה חייבת להיות מוזז לכל כיוון. בסיס הנתונים כולו המתאימים לתמונה העליונה (או מ &#39;V או Ca SR 2 +) חייבים אז להיות מוזז במספר שנקבע של פיקסלים לכל כיוון כדי להבטיח תיאום מדויק בין מ&#39; V וCa 2 + מערכי נתונים SR. </li></ol>

<ol><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22tissues.+Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li>
<li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai%282%2B%29+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBers%2C+DM+%22Excitation-Contraction+Coupling+and+Cardiac+Contractile+Force%22">Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force</a>. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).</li>
<li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li>
<li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li>
<li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+scraps%3A+local+depletions+of+free+%5BCa2%2B%5D+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2%2B+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li>
<li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Ca%282%2B%29+content+regulates+intracellular+Ca%282%2B%29+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts%3A+effect+of+exogenous+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li>
<li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li>
<li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+determines+Ca2%2B+alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+in+the+intact+heart%3A+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li>
<li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+Changes+During+Hypoxia%2C+Ischemia%2C+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+rhythm+%3A+the+official+journal+of+the+Heart+Rhythm+Society%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li>
<li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li>
<li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure%3A+mechanisms+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li>
<li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

המפתחות לטעינת צבע Fluo-5N המוצלחת הם התקנת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-נפח, המאפשרת לריכוז Fluo-5N גבוה ללא הצורך בכמויות גדולות של צבע, את משך זמן טעינה (1 שעה), ומבצעים את הטעינה ב RT. אם הטעינה מתבצעת בטמפרטורות פיסיולוגיות, פעילות האנזימטית סלולרית במהירות דבק תג -AM כאשר הצבע חוצה את קרום התא, לכידת מולקולות הצבע בcytosol ולא מאפשר להם לחצות את קרום SR. ב RT, לעומת זאת, פעילות האנזימטית מואטת וכמות מספקת של צבע יכול לחצות שני קרום התא וקרום SR לפני תג -AM הוא ביקע, ההשמנה ה...

מיפוי אופטי כפול של Ca2+ תוך-תאי ופוטנציאל טרנסממברני (Vm) בלב השלם של לנגנדורף הפך לעמוד התווך של חקירות באלקטרופיזיולוגיה של הלב, כולל מנגנונים של הפרעות קצב וצימוד עירור-התכווצות1-4. גישה זו סיפקה ידע חסר תקדים באלקטרופיזיולוגיה נורמלית וחריגה, וחשוב מכך, לקשר הדו-כיווני בין Vm ל- Ca2+ תוך-תאי. עם זאת, מיפוי אופטי של Ca2+ תוך-תאי עם אינדיקטורים פלואורסצנטיים בעלי זיקה גבוהה (כגון Rhod-2 ו-Fluo-4) מדווח רק על שינויים בתפזורת ב-Ca2+ התוך-תאי ואינו מסוגל להבחין אם שינויים אלה נובעים משטף Ca2+ טרנסממברני, שחרור וספיגה חוזרת למאגרים תוך-תאיים, או ברוב המקרים, שילוב כלשהו של שניהם. יתר על כן, לאינדיקטורים בעלי זיקה גבוהה Ca2+ יש קינטיקה איטית של הפעלה-כיבוי וייתכן שלא ידווחו במדויק על שינויים מהירים בריכוז Ca2+ 5.
כל פוטנציאל פעולה מעורר עלייה ב-Ca2+ התוך-תאי, המכונה החולף התוך-תאי Ca2+ (CaT). בלב יונקים, כ-70-90% מכלל ה-CaT נובע משחרור של Ca2+ מהרטיקולום הסרקופלזמי (SR) דרך פתיחת קולטני ריאנודין (RyRs)6. בתוך ה-SR, כמחצית מסך ה-Ca2+ קשור ל-calsequestrin (CSQ) ולמאגרים תוך-SR אחרים7, הממלאים תפקיד חשוב בהומאוסטזיס SRCa 2+ 8,9. כמות ה-SR Ca2+ החופשית מכתיבה את הכוח המניע לשחרור SR Ca2+ כמו גם לשער של RyR, ולכן יש לה השפעה משמעותית על ה-CaT התוך-תאי. יתר על כן, שינויים בשחרור או ספיגה חוזרת של SR Ca2+ יכולים, בתורם, להשפיע על Vm באמצעות חילופי Na+-Ca2+ האלקטרוגניים, שעלולות להיות להם השלכות הפרעות קצב. לכן, בנוסף ל-CaT, ניטור של SR Ca2+ חופשי יכול לספק תובנות חשובות לגבי תפקוד לקוי של התכווצות ואלקטרופיזיולוגית.
במהלך השנים האחרונות, החוקרים השיגו התקדמות משמעותית בניטור SR Ca2+ במיוציטים לבביים מבודדים וממיקום יחיד על הלב השלם. שיטה אחת כזו דורשת פולסים מהירים של קפאין כדי לפתוח RyRs ותכולת SR Ca2+ מוסקת או מחושבת מהעלייה המיידית ב-Ca2+10 התוך-תאי. גישה מסקרנת נוספת משתמשת באינדיקטורים בעלי זיקה נמוכה Ca2+, כגון Fluo-5N11 או Mag-Fluo412, הנקשרים ל-SR Ca2+ חופשי. לאינדיקטורים אלה יש קבועי דיסוציאציה (Kd) בטווח של 10 - 400 מיקרומטר ולכן מציגים פלואורסצנטיות מינימלית בציטוזול בהשוואה ללומן SR, כאשר ריכוז Ca2+ ([Ca2+]SR) נמצא בטווח המילימולרי. באמצעות אינדיקטורים בעלי זיקה נמוכה Ca2+, נחקרו מספר היבטים של רכיבה על אופניים SR Ca2+ ברמת המיוציט המבודד, כולל שחרור חלקי של SR Ca2+ והמנגנונים של Ca2+ אלטרננים13,14. עם זאת, על מנת להבין באופן מלא את האופי ההטרוגני של מחזוריות SR Ca2+ בלב השלם ואת תפקידו של SR Ca2+ בתופעות הפרעות קצב מובחנות מרחבית, נדרשות שיטות להדמיית SR Ca2+ על פני השטח האפיקרדיאלי של הלב השלם15.
מאמר זה מתאר מתודולוגיה למיפוי אופטי כפול של SR Ca2+ ו-Vm חופשי בלב הארנב השלם של לנגנדורף עם אינדיקטור Ca2+ בעל זיקה נמוכה Fluo-5N. בנוסף לחשיפת מאפייני SR Ca2+ מרחבית על פני השטח האפיקרדיאלי של הלב, לגישה זו יש יתרון של ניטור סימולטני של Vm, המאפשר חקירות של הקשר הדו-כיווני בין Vm ל-SR Ca2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>רכיב בתמיסה של Tyrode</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>רכיב בתמיסה של Tyrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>רכיב בתמיסה של Tyrode</td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M33-500</td><td>רכיב בתמיסה של טירוד</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>רכיב בתמיסה של Tyrode</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>רכיב בתמיסה של Tyrode</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>רכיב בתמיסה של טירוד</td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td>AirGas</td><td>carbogen</td><td>לחמצון ו-pH של תמיסת טירוד</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>מפריד עירור-התכווצות</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>צבע רגיש למתח</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>מחוון Ca2+ בעל זיקה נמוכה; חלופה: Invitrogen F-14204; יש לבצע טעינה בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>עבור טעינת מחוון Ca2+; יש לחמם עד שהתמיסה צלולה לפני השימוש</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>להמסת בלביסטטין וצבעים</td></tr><tr><td>מסנן</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 & #956; m מסנן בשורה</td></tr><tr><td>מתמר לחץ</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>למדידת לחץ זלוף</td></tr><tr><td>מגבר מתמר טרנסברידג'</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>למתמר/הגברת אות לחץ; ניתן להשתמש ב-PowerLab גם עם BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADstruments</td><td></td><td>מתאימים להקלטה רציפה של אותות לחץ ואק"ג</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>הגדרה אופטית מקרוסקופית. פרטים: אובייקט 0.63X (NA = 0.31), אובייקט עיבוי פי 2, שדה ראייה מתקבל = 3.1 ס"מ x 3.1 ס"מ, עומק מיקוד = ~ 1.5 מ"מ</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>מצלמות מיפוי אופטי</td></tr><tr><td>דיוק LED ספוט אור</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>מקור אור LED</td></tr></tbody></table>

מיפוי אופטי של intra-sarcoplasmic reticulum ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב langendorff-perfused

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

טיפול ברטיקולום סרקופלזמי (SR) Ca2+ ממלא תפקיד מפתח בצימוד עירור-התכווצות רגיל וידוע כי טיפול חריג ב-SR Ca2+ ממלא תפקיד משמעותי בסוגים מסוימים של הפרעות קצב. מכיוון שהפרעות קצב הן תופעות נפרדות מרחבית, יש לחקור אותן ברמת הרקמה. עם זאת, השיטות לבדיקה ישירה של SR Ca2+ בלב השלם נותרו מוגבלות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול למיפוי אופטי כפול של פוטנציאל טרנסממברני (Vm) ואינטרה-SR חופשי [Ca2+] ([Ca2+]SR) בלב הארנב של לנגנדורף. גישה זו מנצלת את אינדיקטור Ca2+ בעל זיקה נמוכה Fluo-5N, בעל פלואורסצנטיות מינימלית בציטוזול שבו התוך תאי [Ca2+] ([Ca2+]i) נמוך יחסית אך מציג פלואורסצנטיות משמעותית בלומן SR שבו [Ca2+]SR נמצא בטווח המילימולרי. בנוסף לחשיפת מאפייני SR Ca2+ מרחבית על פני השטח האפיקרדיאלי של הלב, לגישה זו יש יתרון מובהק של ניטור סימולטני של Vm, המאפשר חקירות של הקשר הדו-כיווני בין Vm ו-SR Ca2+ ותפקידו של SR Ca2+ בתופעות הפרעות קצב.

איור 1 א מציג תרשים סכמטי של התצורה האופטית למטר V כפול ומיפוי Ca 2 + SR. עם ההגדרה הזאת, יש הפרדה מוחלטת של רוח רפאים מ &#39;V וCa 2 + אותות SR (איור 1). תרשים של מערכת זלוף הכפולה לולאה משמשת לטעינת צבע Fluo-5N מודגם באיור 1 ג. 1D איור מראה את הכיוון האופקי של הלב בצלחת זלוף. מ &#39;V נציג וCa 2 + עקבות אופטיות SR במהלך צעדה רציפה ממקומות שונים על פני השטח epicard...

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ &#39;V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע מיפוי אופטי סימולטני של סידן חופשי בתוך הרשת הסרקופלזמית ושל פוטנציאל קרום התא בלב ארנב מבודד ושלם המושרש בשיטת LOR. דבר זה מושג תחילה על ידי הוצאת לב הארנב והחדרה של קנולה לאורטה לצורך פרפוזיה רטרוגרדית של הלב. השלב השני הוא ביטול הכיווץ על ידי הוספת חומר למניעת צימוד בין עירור לכיווץ לתמיסת הפרפוזיה.בשלב הבא, את הפרופוזיה מעבירים למסלול רקימה בנפח קטן, ומוסיפים אינדיקטור סידן בעל זיקה נמוכה בטמפרטורת החדר. השלבים הסופיים הם חימום הלב ל-37 °C באמצעות מסלול הפרופוזיה בנפח הגדול והוספת צבע רגיש למתח. כך, במהלך הניסוי, נמדדים שינויים בסידן ובפוטנציאל הקרום על ידי עירור הלב באור כחול ומדידת האור הנפלט באמצעות מצלמות CM OS במהירות גבוהה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לבחון באופן ישיר את הרשת הסרקופלזמית או ה-SR עבור דינמיקת סידן קצרה ללא הפרעה מאותות סידן חוצי-ממברנה. שיטה זו יכולה גם לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לתפקידו של הטיפול בסידן ב-SR בתרומה להפרעות קצב, מכיוון שהפוטנציאל חוצה-הממברנה נרשם בו-זמנית עם הסידן ב-SR. בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקלו בקשיים מכיוון שאותות סידן אופטיים של ה-SR הם בעלי אמפליטודה נמוכה מאוד. לכן, טעינה נכונה של מדד הסידן היא חיונית. לצורך פרוטוקול זה, יש להכין מ

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

דוח זה מספק תיאור מפורט של המתודולוגיה ואת התוצאות של מיפוי אופטי סימולטני endocardial ו epicardial של עירור חשמלי של אטריום נותר בשלמותו הלב Langendorff-perfused כבשה במהלך פרפור פרוזדורי למתוח-Induced.

ברזולוציה גבוהה מיפוי אופטי Endocardial ו Epicardial במודל הכבשים של פרפור פרוזדורי למתוח-induced

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיפוי אופטי של פעילות חשמלית מן אטריום ימין בעכבר במיוחד צומת סין-פרוזדורים, ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.

מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית

למד מיפוי אופטי כפול של פוטנציאל טרנסממברני וסידן תוך-רשתיתי בלב ארנב מבודד בפרוזקול Langendorff. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של דינמיקת סידן SR ופעילות חשמלית לבבית בו-זמנית.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca

גלה סרטונים נוספים