שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של Falciparum Plasmodium

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum. בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקידם של מיקרו-RNA אריתרוציטים בוויסות גנים לאחר שעתוק של תעתיקי פלסמודיום פלציפרום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המלריה, כגון כיצד אירועי שחבור RNA עם RNA קטן מארח או טפיל יכולים להשפיע על פוטנציאל התרגום של mRNA היתוך. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת ללכוד רנ"א כולל וקטן יחד במאגר אחד, מה שמדגים את נוכחותם של רנ"א קטנים ורנ"א היתוך בתא אחד.

בנוסף, הליך זה משתמש בפרופיל פוליזום כדי להראות כיצד אותם RNA קטנים משפיעים על תרגום תוצרי ה-mRNA שלהם. כדי להתחיל, הגדר את הטרנספקציה על ידי סנטיף 300 מיקרוליטר של כדוריות דם אדומות במדיום מלריה מלא ב-800 פעמים G למשך חמש דקות. שטפו את האריתרוציטים פעמיים עם מדיום RPMI, השעו את התאים בתערובת ציטו מלאה ב-50% המטוקריט.

לאחר מכן, העבירו את התאים לבדיקת אלקטרופורציה והוסיפו 10 מיקרוגרם של מיקרו RNA מצומד ביוטין או מיקרו RNA בקרה שלילית לא מצומדת. כדי לאלקטרופוטציה של התאים, הנח את הווט במכשיר חשמלי והעביר פולס יחיד. לאחר מכן צלחת את התאים והדביקו אותם בפלסמודיום פלציפרום לאחר ארבע שעות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזים ארוזים ומופשטים ל-10 מיקרוגרם של רנ"א טפילי בצינור מיקרו-מרכזי, ודגרו את הצינור בסיבוב למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של הרצועה והחרוזים ב-800 פעמים G למשך 30 שניות, ולאחר מכן שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של מאגר RNP המכיל דילול של 1 עד 1000 של מעכב RNA. לאחר מכן, ה-RNA מהחרוזים של Resus, משהה אותם ב-200 מיקרוליטר של RNA.

ללכוד חוצץ פליטה המכיל עודף ביוטין. דגרו את החרוזים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. לאחר מכן צנטריפוגה את החרוזים ב-800 פעמים G למשך 30 שניות ואספו את ה-RNA העל-טבעי.

זה קריטי לנטרל עודף ביוטין ולהשתמש בכמות המינימלית של סטרפטוקוס וחרוזים כדי להבטיח פליטה ספציפית נכונה. זה מפחית את העשרת ה-RNA ברקע. לבסוף, קבע את מידת ההעשרה של תעתיקי P falciparum והעשרת מיקרו RNA על ידי R-T-P-C-R כמותי כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי להתחיל בהפרדת פוליזומים.

ראשית הכניסו חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז של 50% לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן שכבה בזהירות חמישה מיליליטר של תמיסת סוכרוז של 15% על תמיסת 50%. לאחר מכן, אטמו את צינור השיפוע עם פרפיל והטו בזהירות את הצינור עד שהוא מונח אופקית על הספסל.

ודא שהצינור במצב יציב כדי למנוע גלגול. שמור את הצינור במצב זה לפחות שעתיים כדי לאפשר לשיפוע להיווצר. בינתיים, אסוף כ-100 מיליליטר של תרבית אסינכרונית של דם נגוע בפלסמודיום ב-3 עד 5% פרסיט.

לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום תרבית המכיל שני ציקלו מילי-מולרי, היידה, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים ב-500 פעמים G למשך שבע דקות ולאחר מכן שטפו אותם פעמיים עם 80 מיליליטר PBS המכילים 200 מיקרו-מולארי cyclo heide resus. השעו את הגלולה ב-PBS עם ציקלוהקסימיד והניחו אותה על קרח.

גלולה את התאים והסר את הסופרנטנט כדי להעריך את נפח הגלולה. לאחר מכן יש להניח את התאים בנפח סופי של 4.25 מיליליטר ליזה, לחצץ ולדגור למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. ניסיונות קודמים לפרופיל פוליזום ומינים הגורמים למלריה חשפו בעיקר מונוס מכיוון שליזיס פוננט מוביל לפירוק הפוליזום לאזורי מונו.

כאן אנו משתמשים במאגר ליזה שמפרש את האריתרוציט והטפילים בו זמנית כדי לשמר את דפוס הפוליזום של פלסמודיום פלציפרום, להעביר את הליזאט לצינורות מיקרו צנטריפוגות ואז להסתובב ב-16,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בצינור אולטרה-צנטריפוגה נפרד מקורר מראש של חמישה מיליליטר, הוסף 1.25 מיליליטר של תמיסת כרית סוכרוז קרה 0.5 מולרית באמצעות מזרק עם מחט בגודל 27. שכבה בזהירות של 3.75 מיליליטר של סופרנטנט הליזאט מעל כרית הסוכרוז.

צנטריפוגה את הדגימה ב-366,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 146 דקות. במהלך תקופה זו, החזר לאט את צינור האולטרה-צנטריפוגה שנרצח בסוכרוז למצב אנכי ותן לו לעמוד על הקרח למשך 15 דקות לפחות. לאחר הוצאת הליזאט מהאולטרה-צנטריפוגה, אסוף בזהירות את הסופרנטנט בשניים חרוטיים של 15 מיליליטר.

אחסן את הסופרנטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לשמר את חלק ה-RNA שאינו קשור על ידי הריבוזומים. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור הריבוזום ב-500 מיקרוליטר של תרחיף Resus, חצצו על ידי פיפטינג למשך חמש דקות כדי לערבב צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כדי להסיר חומר בלתי מסיס הסר בזהירות את אטם הפרם על צינור השיפוע כדי למנוע הפרעה לשיפוע, ולאחר מכן שכב את המתלה הריבוזומלי מעל עם מזרק ומחט 27.

לאחר צנטריפוגה של הצינור ב -200, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 180 דקות, אחסן את השיפועים בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לטעינה על המפרק. הנח צינור אולטרה-צנטריפוגה ריק לתוך מפצל השיפוע ושטוף את המערכת במים נטולי RNA למשך חמש דקות. במהלך הכביסה, הגדר את הרגישות של גלאי ספיגת ה-UV ל-254 ננומטר ל-0.2.

אם כי ייתכן שיהיה צורך להתאים זאת בהתאם לאות. לאחר מכן, הגדר את האות הבסיסי לאפס כאשר מים זורמים דרך הגלאי. לאחר שטיפת הקולט, הפוך את זרימת הנוזל דרך המפריד כדי לרוקן את הקווים ואז הסר את צינור האולטרה-צנטריפוגה הריק.

הפעל תמיסת סוכרוז של 60% דרך ה-FRACTIONATOR עד שהוא יוצא ממנגנון המחט. לאחר מכן הנח את צינור השיפוע הטעון בחלק העליון של תא הטעינה והדק את האטם. חודרים את תחתית הצינור בעזרת המחט.

לאחר מכן אפס את מהירות הזרימה של המקטע ל-12.5 על 10 ואסוף שברים של 18 שניות בצינורות מיקרו צנטריפוגה. התחל את הזרימה קדימה של תמיסת הסוכרוז של 60% כדי לחסל את השברים לפני שהטיפה הראשונה של תמיסת השיפוע נכנסת לצינור מיקרו צנטריפוגה. התחל הן את האיסוף והן את ההקלטה החיה של הספיגה באות של 254 ננומטר.

כאשר האות הסופג יורד בחדות בממשק של תמיסת סוכרוז של 50% ו-60%, עצור את הזרימה וההקלטה. אחסן את שברי מעבר הצבע במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הפוך את זרימת הנוזל עד שתמיסת ה-60% מתרוקנת מצינור האולטרה-צנטריפוגה.

הסר את הצינור והתחל לנתח את השיפוע הבא. טרנספקציה של תאי דם אדומים עם microRNA 4 5 1, ואחריה התאוששות של היברידיות micro NA mRNA ביוטיניליות, חשפו העשרה של תעתיקי היתוך PKAR. טרנספקציה של מיקרו RNA מדומה, או לא קשורה, לא העשירה את תעתיק ה-PKAR.

הנתונים מראים את הפסגות האלוקיאניות של תת-היחידות הריבוזומליות של 40 ו-60 שניות, ריבוזום DS ושברי הפוליזום המכילים את מספר הריבוזומים המצוין. הריבוזומים היו קשורים לתעתיקים שבודדו מ-PCI השוכנים בתוך כדוריות דם אדומות. ניתוח דם צפוני הראה כי הריבוזומים והפוליזום היו קשורים ל-18 S ו-28 SRNA.

יחד עם הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עיכול R nase H, מבחני הגנה על ריבונוקלאז וכתמים צפוניים על מנת לאמת בנוסף את נוכחותו של microRNA MR. היתוך NA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר מיקרו-רנ"א לאריתרוציטים ולאחר מכן ללכוד רנ"א קטן עם רנ"א כולל, כולל תעתיקים כימריים. אתה אמור גם להיות מסוגל לשחזר פוליזום כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ומכאן את פוטנציאל התרגום של תעתיקי היתוך אלה.