מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב
27 בינואר 2016
טכניקות הקלטת וידאו ומיפוי מרחבי-זמני (STmap) הזמינות לאחרונה מאפשרות לדמיין ולכמת הן דפוסי התפשטות והן ערבוב של תנועתיות המעיים. מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את היצירה והניתוח של STmaps באמצעות מערכת ניטור תנועתיות מערכת העיכול (GIMM).
המטרות הכלליות ליצירת מפה מרחבית-זמנית מקיפה של מעיים ex vivo הן לחקור את התגובה לתכולת הלומן על ידי תצפית על התנועה המפורטת של דופן המעי לאורך מקטע שלם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להקליט ולהשוות את הפעילות באזורים שונים של אותו מקטע רקמה במרחב ובזמן, מה שמאפשר זיהוי של דפוסי מוטיליות מורכבים ולא רק התכווצות או הרפיה פשוטות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מוטיליות תקינה של המעי, ניתן להשתמש בה גם לזיהוי השפעות של תרופות שונות וחומרים אינטרלומינליים, כגון רכיבי תזונה או דפוסי מוטיליות.
בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו יתקשו בהתחלה, כיוון שמפות מרחביות-זמניות עשויות להיות קשות לפירוש. אך עם הזמן, ניתן יהיה לזהות דפוסים מורכבים במבט חטוף. כדי להתחיל, הוצא את המעי הגס או המעי מדובב של חזיר גינאה שהורדם.
קבעו את הרקמה באמצעות סיכות בתמיסת Krebs חמה. בתוך מגש הניתוח, הסירו את כל התוכן התוך-לומנלי על ידי פרפוזיה עדינה של באפר Krebs דרך הלומן. השתמשו במזרק עם קטטר בעל קצה קהה והימנעו ממתיחה מוגזמת של מקטע המעי הגס במהלך הפרפוזיה.
בשלב הבא, חברו שתי פיסות של צינור פוליאתילן באורך של שני עד שלושה מילימטרים לשני קטטרים של צינור זכוכית שעברו התלהוט (fire-polished), שקוטרם שלושה מילימטרים. במגש ניתוח מחומם, הכניסו קטטר אחד אל הקצה האוראלי של תכשיר הרקמה וקשרו תפר מאחורי פיסת הצינור הקטנה, מסביב לקטטר, באמצעות קשר כירורגי. נסו למשוך בעדינות את הקטטר החוצה כדי לוודא שהקשר הדוק.
פיסת צינור הפוליאתילן הקטנה מונעת החלקה של התפר. חזור על תהליך זה באמצעות הקטטר השני בקצה האבוראלי (aboral) של הרקמה. לאחר מכן, הסר את הקרום (mesentery) מהכנת הרקמה.
לאחר ששני הקטטרים מקובעים, העבירו את הדגימה ממגש הנתיחה לאחד מאמבטי האיברים של GIMM ומקמו את הרקמה כך שהקצה הפהי יפנה הרחק מהמשתמש. לאחר מכן, קבעו את קטטרי צינורות הזכוכית לאמבט האיברים באמצעות חימר פיסול, על ידי הצמדת קצה צינור הזכוכית לדופן האמבט, או באמצעות תפסים מפלסטיק להצמדת הקטטרים למוטות שמעל האמבט המשמשים לקיבוע המצלמות. כעת, חברו קטע צינור באורך חמישה סנטימטרים לקצה הפתוח של כל קטטר.
עבור הקטטר הפומי, חברו את קטע הפבינה הקצר לקטע פבינה ארוך יותר באמצעות חיבור luer lock. לאחר מכן, חברו מזרק של 5 mL למחבר ה-luer lock. זה ישמש להזרקת בופר לתוך הדגימה של הרקמה.
עבור הקתטר האבוראלי (aboral), השתמשו בצינור כדי להוביל את הזרימה מהלומן אל תוך מיכל איסוף. כעת, באמצעות המזרק המצורף, שטפו באיטיות את הרקמה בבופר Krebs מחומם כדי לוודא שיש זרימה טובה, כפי שניתן לראות מהנוזל היוצא מהקתטר האבוראלי. המשיכו בכיול של מערכת הקלטת הווידאו בזמן שהרקמה עוברת שיווי משקל למשך 30 דקות.
כייל את מיקום גובה המצלמה, את הגדרות הווידאו עבור בהירות וניגודיות ואת המרחק האופקי באמצעות תוכנת ה-GIMM. לחץ על לשונית הניסוי כדי שהמצלמה תכויל. לאחר מכן, בתפריט File, לחץ על Calibrate.
ברגע שהווידאו מופיע בחלון כיול תחנת העבודה, כוון את המצלמה לגובה שבו התמונה כוללת את קצות הקטטרים שהוכנסו ללומן של המעי הגס. לאחר מכן, כייל את המרחק האופקי הנראה בתמונה על המסך באמצעות מדד המדבקה השקוף המחובר לכל אמבטיה. באותו חלון כיול תחנת עבודה, כוון את קווי ההדריך האנכיים האדומים כך שהמרחק ביניהם יהיה 10 מילימטרים.
לאחר מכן, הקלידו מרחק זה לחלון סמן המרחק ולחצו על כפתור ה-Cal. השתמשו במכווני העליות (gain), הבהירות והסגר (shutter) בחלון כיול תחנת העבודה כדי לגרום למקטע הרקמה להיראות כצללית כהה על רקע בהיר. לבסוף, כוונו את גלגלי המיקוד והמפתח (aperture) במצלמה עצמה כדי לשפר את התמונה עוד יותר.
כדי להשלים את כיול התמונה, לחצו על Save ולאחר מכן על Yes במסך הקופץ. לבסוף, לחצו על Exit. לאחר תקופת שיווי המשקל של חצי שעה, התחילו בניסוי.
התחילו במתן שם לניסוי. לאחר מכן, חסמו את חלל הצינור הבולט מהקטטר האבוראלי באמצעות התסמיך הפלסטי. לאחר מכן, הזרים כ-7 milliliters של Krebs buffer אל חלל המעי הגס הפרוקסימלי.
המטרה היא לספק התרחבות מספקת כדי להתחיל התכווצויות דוחפות. ברגע שהקטע התרחב על ידי נוזל לומנלי, התחל את הקלטת הווידאו. בתוכנה, לחץ פעמיים על הניסוי ששמו נקבע כדי לפתוח את תצוגת המצלמה הניסויית, ולאחר מכן לחץ על מתג ההפעלה למצב on כדי לצפות בשדה המצלמה.
אספו נתוני וידאו באורך שנקבע מראש. בסיום ניסוי הרחבה מבוקר ראשוני זה, שחררו או הסירו את התסמיך כדי לאפשר למקטע הרקמה לדחוף את הנוזל המרחיב אל מחוץ ללומן. אפשרו לרקמה להגיע לשיווי משקל מחדש במשך 10 עד 20 דקות, ולאחר מכן חזרו על הפרוצדורה תוך שימוש בטיפול.
ניתן להעביר דגימת רקמה בודדת עד חמישה טיפולים של 10 דקות, במידה ונשמרות תקופות מנוחה מתאימות בין הבדיקות. יש לשים לב להסרה של שכבת הרירית (mucosal sloughing), המהווה סימן לדגרדציה של הרקמה. כדי לנתח את ההקלטה, יש ללחוץ פעמיים על שם ניסוי ספציפי כדי לפתוח את חלון הניתוח לבניית מפת ST.
בתוך אזור השמעת הווידאו, התאימו את מדדי הניגודיות והבהירות כדי להפוך את התמונה למתאימה לניתוח. צרו צללית שחורה של הרקמה על רקע בהיר. לאחר מכן, הגדירו את קווי העזר האדומים האופקיים והאנכיים בחלון תמונת הווידאו כדי לבודד את אזור הרקמה לניתוח ולהסיר אזורים המכילים ארטיפקטים.
לאחר מכן, הגדירו את זמן האנליזה. לחצו על כפתור A הירוק כדי לבחור את נקודת ההתחלה, ולחצו על כפתור B הצהוב עבור נקודת הסיום כאשר סרגל הזמן נמצא במיקומים הנכונים. בשלב הבא, בחרו בלשונית Motor Analysis כדי לפתוח את חלון מפת ה-ST, ולאחר מכן לחצו על כפתור השעון העומד.
התחילו ביצירת מפת ה-ST על ידי לחיצה עם סמן כוונת העינית בתוך הצללית השחורה של הרקמה. יצירת המפה עשויה להימשך מספר דקות. לאחר בניית מפת ה-ST, בחרו באפשרות הזום כדי להגדיל את התמונה.
לאחר מכן, בחר באפשרות הצבע כדי לראות את התמונה בצבע במקום בגווני אפור. בשלב הבא, בחר ב-"enable" כדי שניתן יהיה להשתמש בסמן לבחירת הפיקסל לצורך ניתוח. עבור הרקמה הקשורה לפיקסלים שנבחרו, השינוי בקוטר הלומן לאורך זמן מנותח ומוצג כמעקב אחר קוטר הגרעין מימין למפת ה-ST.
לאחר הניתוחים, בחרו ב-Exit. כעת ייצאו את מפת ה-ST למטרות אחרות על ידי בחירה ב-File ולאחר מכן ב-Export Data, ולאחר מכן ב-Metafile. תנו שם לקובץ ושמרו אותו כקובץ emf על ידי לחיצה על Save.
המפות הנוצרות באמצעות טכניקה זו מציגות שינויים בקוטר הלומן של הרקמה הן במרחק והן בזמן. המרחק האופקי מיוצג על ציר ה-X, והזמן על ציר ה-Y, כאשר זמן ההתחלה נמצא למעלה וזמן הסיום למטה. בפינה הימנית העליונה מופיע מקרא, המציג את קטרי הלומן המינימליים והמקסימליים, וכן את קנה המידה עבור צירי ה-X וה-Y.
לפיכך, גוונים שונים של פיקסלים בתוך תמונת סולם האפור תואמים לקטרים לומנליים שונים. פיקסלים כהים יותר תואמים לקטרים רחבים יותר, ופיקסלים בהירים יותר תואמים לקטרים קטנים יותר. גלי התכווצות של השריר המעגלי יופיעו כאזורים של פיקסלציה בהירה יותר בשל ההפחתה בקוטר הלומן.
לעומת זאת, התפשטות של הלומן עקב הרפיה של השריר המעגלי או בולוס גדול של נוזל מוצגת כפיקסלים כהים יותר. בנוסף לגלי התכווצות מתקדמים, ניתן להבחין גם בדפוס תנועתיות של ערבוב המכונה סגמנטציה. התכווצויות קטנות וסטטיות מתרחשות באזורים שונים בו-זמנית.
עם הזמן, התכווצויות קטנות אלו נעות לעבר הקצה האנאלי האבוראלי. קרומי מזוטיקה (Mesentery) שנותרו על הרקמה עלולים לגרום לארטפקטים, הנראים כקווים אנכיים כהים. ניתן להשתמש בתנועה האופקית של קווים אנכיים ארטפקטורליים אלו כדי לקבוע את תזמון התנועה של השריר האורכי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להכין מקטעי מעי להקלטה בווידאו וכיצד ליצור את הייצוג העוקב של תנועתיות המעי כמיפויי מרחב-זמן (spatiotemporal maps). בעקבות הליך זה, ניתן להוסיף רכיבים תזונתיים שונים לתמיסה הלומנלית כדי לקבוע כיצד רכיבים טבעיים משרים דפוסי תנועתיות ספציפיים במטרה להקל על העיכול והספיגה. ניתן להשתמש באגוניסטים או אנטגוניסטים פרמקולוגיים ספציפיים של קולטנים לגורמים הומורליים עצביים כדי לקבוע את המנגנונים שבאמצעותם התנועתיות מתחילה ומתפשטת.
טכניקה זו עשויה לסייע בהפקת נתונים שימושיים לקביעת תרכובות המועילות לטיפול בהפרעות בניידות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירה ולניתוח של מפות מרחביות-זמניות (STmaps) של מוטיליות מעית באמצעות מערכת ה-GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM). הטכניקה מאפשרת ויזואליזציה של תבניות מוטיליות מורכבות במעיים ex vivo, ובכך משפרת את הבנתנו לגבי תנועות דופן המעי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- גסטרואנטרולוגיה
- פיזיולוגיה
רקע
- טכניקות של מיפוי מרחבי-זמני מאפשרות תצפית מפורטת על מוטיליות המעי.
- הבנת דפוסי התנועתיות חיונית לחקר השפעות של תרופות ואינטראקציות של חומרי תזונה.
- הפרשנות הראשונית של STmaps עלולה להיות מאתגרת עבור משתמשים חדשים.
- מחקרים ex vivo מספקים תובנות לגבי תנועתיות תקינה ושינויים בתנועתיות.
מטרת המחקר
- להדמיה וכמות של דפוסי תנועתיות במעי.
- להקל על ניתוח התגובות לטיפולים שונים.
- לשיפור ההבנה של דינמיקת תנועתיות מורכבת.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת רקמת מעי מחזירי חולדה.
- שימוש בתמיסת Krebs לתחזוקת הרקמה.
- כיול של מערכות הקלטת וידאו ללכידה מדויקת של נתונים.
- יצירת STmaps באמצעות ניתוח וידאו וכלי תוכנה.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של דפוסי תנועתיות במעי.
- זיהוי של דינמיקות מורכבות של התכווצות והרפיה.
- יכולת לנתח את השפעות התוכן הלומנלי על התנועתיות.
- הדגמה של ישימות השיטה במחקרים פרמקולוגיים.
מסקנות
- מערכת ה-GIMM מספקת פלטפורמה חסונה לחקר מוטיליות המעי.
- מיפוי מרחבי-זמני (Spatiotemporal mapping) משפר את ההבנה של תפקוד מערכת העיכול.
- שיטה זו עשויה להיות בעלת ערך למחקרים עתידיים בפיזיולוגיה ובפרמקולוגיה של המעי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי מרחבי-זמני (Spatiotemporal mapping) של מוטיליות מעית מאפשר ויזואליזציה מפורטת של דפוסי התכווצות ברקמה ex vivo, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות למערכת העיכול. על ידי לכידת הכיוון, המהירות, התדירות ועוצמת המוטיליות לאורך מקטעי רקמה, השיטה מספקת ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות (target validation) להפרעות מוטיליות. גישה זו מקלה על הרצף התרגומי מהשלב המוקדם של הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית של השפעות תרופות על הדינמיקה של חלל המעי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של האופן שבו גירויים לומנליים מעוררים או ממירים דפוסי מוטיליות.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה מקבילה של פעילות באזורים שונים של אותו מקטע רקמה לאורך זמן.
- ערך אסטרטגי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות המעורבות במוטיליות פריסטלטית, אנטי-פריסטלטית או סגמנטצית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של משתנים תלויים של שינויים בקוטר הלומן כעצמת גווני אפור או צבע.
- ערך תפעולי: מפיק מפות STmaps הניתנות לשחזור וניתן להריצן בקווי זמן שונים לצורך ניתוח דפוסים מפורט.
- ערך אסטרטגי: מתקנן את הערכת התנועתיות לצורך סריקת תרכובות המשפיעות על דפוסי דחיפה או ערבוב.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר תצפיות ex vivo למערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול תגובות לחומרים מזינים ולסוכנים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק רציפות של מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת שינויים בהשראת תרופות בכיוון ובחוזק התנועתיות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים בהתבסס על תובנות מכניסטיות לגבי התחלת דפוסים והמרתם.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי באמצעות בדיקת השערות על מנגנוני ניידות, בסינון באמצעות מוכנות של בדיקה להערכת תרכובות, ובמחקר תרגומי על ידי תמיכה ברציפות פרה-קלינית בפארמקולוגיה של מערכת העיכול.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות באמצעות בידוד משתנים בלתי תלויים, כגון התרחבות הלומן או אגוניסטים של קולטנים, כדי לבחון שינויים תלוים בדפוסי התנועתיות.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה של בדיקות ופלט כמותי באמצעות יצירת STmap, מה שמאפשר השוואה מהימנה של דינמיקה התכווצית בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספקת יכולות ניתוח סטטיסטי באמצעות מדידות של כיוון התנועתיות, מהירות, משך, תדירות ועוצמה מתוך עקבות ה-STmap.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודה פרה-קלינית על ידי ניתוח האופן שבו פעילות באזור אחד משפיעה על אזור אחר, באופן המשקף קואורדינציה in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה שניתן להשתמש בה שוב להערכת תרכובות מגוונות על תנועתיות המעיים ללא צורך בעיצוב מחדש של זרימת העבודה המרכזית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות ויזואליזציה של אינטראקציות מוטיליות מורכבות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות הקלטת וידאו מכויילת ויצירה עקבית של STmap.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בפרמקולוגיה של מערכת העיכול.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעות על דפוסי מוטיליות דוחפים לעומת דפוסי ערבוב.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, קנולציה וניתוח מוטיליות מבוסס וידאו.
- תלוי באמבטיות איברים מסוג GIMM, מערכות מצלמה מכויילות ותוכנה ליצירה וייצוא של STmap.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של לחצי פרפוזיה לומנלית וחלונות זמן לניתוח.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על אזורי מעי שונים או מינים שאינם מעי גס של חזיר גינאה.
- מוגבל למוטיליות הגורמת לשינויים בקוטר הלומן; אינו מודד לחץ תוך-לומנלי או מתח שרירי באופן ישיר.
