רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבנות מחדש באופן פונקציונלי תעלות מזקל לממשק טיפות, מערכת דו-שכבתית, ולבחון את התגובה של תעלות רגישות למכאנו לגירויים מכניים הרמוניים. שיטה זו מאפשרת לחקור את הפעילות החשמלית המכנית של מוטנט המסקל V 23 T בתגובה לעירור מכני הרמוני לאחר בנייה מחדש לממשק טיפות על ידי מערכת שכבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מנצלת את היתרונות הטכניים הן של טכניקת מהדק התיקון והן של ממשק הטיפות בשיטות שכבות עם יכולת מזעור כמו גם היכולת לשלוט בהרכב הכימי של כל צד של הממברנה.

כדי לנסח ליפוזומים, הכינו 10 מיליליטר של תמיסת שומנים של שני מיליגרם למיליליטר על ידי הוספת 10 מיליליטר של חוצץ אשלגן כלורי ל-20 מיליגרם של ליפידים סינתטיים D-P-H-P-C שנרכשו כאבקה ליופילית. ודא שגם רכבי השומנים וגם תמיסת החיץ מעורבבים היטב. התערובת צריכה להיראות הומוגנית ומעורפלת כשהכל מומס.

מקפיאים את התערובת במינוס 20 מעלות צלזיוס כעת מפשירים לחלוטין את תערובת השומנים החדשה, נותנים לתערובת להפשיר בטמפרטורת החדר ולא בסביבה מחוממת. לאחר סך של שישה מחזורי הפשרת הקפאה, השתמש במכבש זמין מסחרית כדי להוציא את השומנים על ידי אילוץ כל תרחיף השומנים תחילה דרך מסנן ממברנה פוליקרבונט 0.4 מיקרון, ולאחר מכן שש פעמים דרך מסנן ממברנה של 0.1 מיקרון. תהליך זה מניב חלקיקים בקוטר הקרוב ל-100 ננומטר.

כדי לייצר את מאגר הנפט, קדחו שני חורים מנוגדים דרך הקיר של גליל אקרילי בקוטר שני אינץ' ובאורך 1.5 סנטימטר. החורים צריכים להיות בקוטר של מילימטר אחד וסנטימטר אחד מלמטה. לאחר מכן קדחו שני חורים של ארבעה מילימטר קונצנטריים לחורים של מילימטר אחד שנקדחו בעבר.

עומק החורים צריך להיות מילימטר אחד כל אחד. הקפד לא לקדוח אותם עד הסוף. חורים אלה עשויים להתאים לאטמי הגומי.

הנח והדבק שני אטמי גומי בקוטר פנימי של מילימטר אחד בחורים הגדולים יותר על מנת למנוע דליפת שמן. לאחר מכן הדביקו את המכונה לצילינדר ליריעת אקריליק דקה בגודל 10 ס"מ על 10 ס"מ באמצעות כל אפוקסי רב תכליתי ביום הניסוי, חתכו חוטי כסף בקוטר 2 250 מיקרון באורך שבעה סנטימטרים, ולאחר מכן טבלו את קצותיהם באקונומיקה למשך שעתיים. ליצירת ציפוי כלוריד כסף צבע אפור מציין שנוצר ציפוי כלוריד כסף

בעזרת חותך זכוכית פיצלו נימי זכוכית סיליקט באורך 10 ס"מ בקוטר חיצוני של מילימטר אחד ובקוטר פנימי של 58 מילימטר לשני נימים של חמישה סנטימטרים. בעזרת מזרק מיליליטר אחד עם מחט קצה קהה בגודל 18, מלאו את הנימים בהידרוג'ל P-E-G-D-M-A כדי למנוע מההידרוג'ל המיובש להתנפח מהנימים. שמרו על מרווח של שלושה מילימטרים בקצוות וודאו שאין בועות אוויר בנימים.

הכנס את האלקטרודות הכסופות והכסף כלוריד לנימים המלאים בהידרוג'ל. ריפוי ההידרוג'ל P-E-G-D-M-A באמצעות פילמור פוטו רדיקלים חופשיים בחשיפה לאור אולטרה סגול למשך שתי דקות בואט אחד באמצעות נקודה אולטרה סגולה, הניסוי מוגדר מתחת לכלוב פאראדיי מקורקע לחיבור הארקה במגבר התיקון. חבר את אחת הפיפטות המיקרו למחזיק מיקרו אלקטרודה ישר בעל מחבר זכר.

לאחר מכן חבר את מחזיק המיקרו אלקטרודה לשלב הראש של מגבר התיקון. כדי לחבר את הראש stage לקרקע הלחמה חוט נחושת מבודד 18 מד למחבר מתאים לראש stage התקן את הראש stage על מיקרו מניפולטור ידני בעל שלושה צירים על ידי חיבור ראשtagלוחית ההרכבה למיקרו מניפולטור, ולאחר מכן חיבור הראש stage ללוחית ההרכבה. בעזרת הברגים המתאימים, חבר את המיקרו פיפטה השנייה למפעיל הליניארי דרך מחבר מתוצרת מעבדה ולאחר מכן הרכיב את שניהם על מניפולטור מיקרום שני.

הפיפטות המיקרו צריכות להיות מנוגדות זו לזו מיושרות ומפולסות אופקית. הבא בבקבוקון זכוכית מערבבים 0.1 מיליליטר של ליפוזומי D-P-H-P-C עם 0.01 מיליליטר של תמיסת ליפוזום פרוטיאה מסקל V 23 T. בעזרת מחט מיקרו-מילוי בגודל 34, מלאו את קצות שתי הפיפטות המיקרו בתמיסת פרוטאוזום.

הנח את המאגר על גבי מיקרוסקופ זקוף והזין את המיקרו-פיפטות דרך החורים המנוגדים של מילימטר אחד. לאחר מכן מלאו את המאגר אל פני השטח ב-hexa decane כדי ליצור את הטיפות הכדוריות בקצה המיקרו-פיפטים. השתמש במיקרו פיפטה שלישית מזכוכית סיליקט בקוטר 10 מיקרון המותקנת על מניפולטור מיקרומטר שלישי כדי להוציא תמיסת ליפוזום פרוטיאה מסקל V 23 T מדוללת בקצות המיקרו פיפטות וליצור את הטיפות.

שלוט בגודל הטיפות על ידי הקטנת או הגדלת הנפח כרצונך, ותן להן לנוח במשך 10 דקות עד שהחד-שכבות ייווצרו לחלוטין. ואז הביאו את הטיפות למגע אחר שכבה. ההיווצרות תתרחש תוך דקה עד שתיים.

לאחר הגדרת התוכנה והציוד כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השתמש בכבל BNC כדי לחבר את הפלט של מחולל צורות גל למתג הקדמי של כניסת הפקודה החיצונית. שלח צורת גל משולשת של 10 הרץ, שיא של 500 מילי-וולט לשלב הראש. שימוש במניפולטור מיקרום.

הזיזו את המיקרו פיפטות הזכוכית אופקית כדי להביא טיפות למגע עד שהן נוגעות מעט והמתינו להתרחשות דילול דו-שכבתי. ניתן לראות את התקדמות תהליך היווצרות הדו-שכבתי באופן ויזואלי דרך המיקרוסקופ וניתן לעקוב אחריה על ידי מדידה נוכחית. התאם את גודל הדו-שכבתי לקוטר של כ-250 מיקרון על ידי שליטה במיקום הטיפה המותקנת על המפעיל באמצעות המניפולטור, ניתן להעריך את גודל הדו-שכבתי באופן חזותי באמצעות המיקרוסקופ.

לאחר שהשכבה הדו-שכבתית נוצרה ויציבה, עורר את הטיפות על ידי שליחת אות סינוסואידלי באמצעות מחולל פונקציות כדי לעורר את חלבון המסקל המשולב בשכבה הדו-שכבתית. שלח צורת גל סינוסואידלי עם שיא של 175 מיקרון למשרעת שיא, תדר 0.2 הרץ ומחזור עבודה של 50% לבקר השרת החשמלי של Pieto. הקלטת זרם לא טיפוסית בזמן אמת מוצגת כאן.

הקיבול הנמדד של הדו-שכבתי גדל בפתאומיות, מה שמעיד על דילול והיווצרות דו-שכבתיים לפני שהוא מגיע למצב יציב. ניתן לשלוט בשכבה הדו-שכבתית על ידי שינוי מיקום הטיפות כאשר ה-DIB מגורה מכנית תוך שמירה על פוטנציאל DC קבוע על פני הממברנה. מוטנט ה-V 23 T של מזקל מייצר פעילויות אמינות הכוללות בעיקר מצבים תת-מוליכים ולעיתים אירועי פתיחה מלאים.

שער מתרחש בעיקר בשיא הדחיסה, מה שמצביע על כך שהוא קשור לעלייה במתח הדו-שכבתי כפי שמוצג בתרשים הקוטבי. כאן, היכולת של טכניקה זו לשמש לבדיקת סוגים אחרים של ביומולקולות מודגשת כאן. Ethin, שהיא תעלת יונים מגודרת מתח, מגבירה את חדירות הממברנה עם יישום פוטנציאל טרנסממברני DC מאסטר אחד.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לשבור בטעות את נימי הזכוכית או אחרת. עליך להפעיל מחדש את ההתקנה ולוודא שכל החוטים מחוברים לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התעלות המופעלות על ידי מתיחה לחקור שיטות חדשות שדרכן ניתן להעביר כוחות חיצוניים לשער של תעלות רגישות למנגנון משובץ DIB. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ממשק טיפות על ידי שכבות, לשלב תעלות רגישות למכאנו בממברנות המלאכותיות ולעורר את התעלות הללו באופן מכני.