Name: בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: חקור שיטה לבידוד אנדוספורות חיידקיות מדגימות סביבתיות מורכבות כמו משקעים. טכניקה זו מבוססת על הבדלי עמידות בין אנדוספורות לתאים גטטיביים לכימיקלים וחום, ומאפשרת ניסויים המשך כגון גידול ומיצוי DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים שוויצרי הקרן הלאומית למדע למענק מס &#39;31003A-132358/1, 31003A_152972 ומס&#39; 151,948, ומרכז המחקר הספרדי פייר מרסייה pour la מדע.

1. הכנת כימיקלים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר של 1% hexametaphosphate נתרן (SHMP) (Napo 3) n פתרון ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים לעקר nitrocellulose (NC) (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 47 מ&quot;מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מסנני NC (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 25 מ&quot;מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולב המשקל הריק של 50 מיליליטר צינורות סטרילי (עם כובע על) (צינור אחד לדגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-EDTA-חיץ 1x (TE-חיץ): להפוך את הפתרון של 10 מ&quot;מ טריס (טריס aminomethane (hydroxymethyl)) וחיץ 1 mM EDTA. התאם ל- pH 8 ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון יזוזים (20 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי המסת 0.02 גרם של יזוזים ב 1 מיליליטר TE-חיץ. באופן אידיאלי, לעשות טרי בכל פעם. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ 1 בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיסיולוגי על ידי המסת 8 גרם נתרן כלורי / L(NaCl) במים מזוקקים. לעקר ידי מעוקר. </li></ol> 2. הפרדה של ביומסה ממשקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 גרם של מדגם משקעים מראש שקל סטרילי 50 מיליליטר צינורות באמצעות סקופים מתכת-בער אתנול. לבצע את זה ב, ארון בטיחות ביולוגית UV מעוקר נקי, כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP למדגם באמצעות סטרילי סיים ביורטה. פתרון SHMP גם יכול להיות מסונן כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המשקעים ופתרון SHMP עם disperser הנוזלית / homogenizer (למשל, homogenizer-Turrax Ultra). 70% אתנול לעקר או החיטוי הרוטור הפיזור לפני השימוש. הפעל את המגון 1 דקות ב17,500 סל&quot;ד. תן את שאר המדגם למשך 2 דקות ולחזור על הומוגניות דקות 1 באותה מהירות הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו המדגם לעמוד במשך 10 דקות. בשלב זה, החלקיקים הכבדים ביותר (מינרלים) יישבו. התאים וכל רכיבים אורגניים של המדגם עם זאת wחולה יישאר בפתרון. לאחר מכן, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לתוך צינור 50 מיליליטר נקי, תוך הקפדה שלא להפריע גלולה המשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלולת המשקעים להוסיף שוב 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP באמצעות סטרילי סיים ביורטה. אז חזור על שלבים 2.3 ו -2.4. חזרה זו מבטיחה את ההפרדה מהסכום המרבי של תאים וחלקיקים אורגניים ממרכיב המינרלים של המשקעים. Supernatant של הפרדה שנייה זה יכול להיות התמזג עם supernatant מההפרדה הראשונה. הערה: כל השלבים הבאים נעשים על supernatant (המכילים ביומסה תא). רכיב המינרלים (גלולה משקעים) יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 20 XG דקות 1. צעד זה מגדיל את G-Force מספיק כדי ליישב חלקיקים מינרליים קטנים בעוד שחומר התא הביולוגי עדיין בפתרון. לאחר צנטריפוגה, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לשפופרת 50 מיליליטר נקי. זורק את כדור המינרלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הנפח הסופי של התמיסה המכילה ביומסה על ידי שקילת המדגם. קביעת המשקל נמנעה צורך להעביר את הדגימה לגליל סיים ומפחיתה את הסיכון לזיהום. </li></ol> 3. אוסף של ביומסה בממברנה הסינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחידת סינון (47 מ&quot;מ קרומי קוטר) ומשאבת ואקום. לעקר את יחידת הסינון או על ידי מעוקר או (אם פיירקס זכוכית) על ידי ריסוס אותו עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר לפני שימשיך בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קרום NC סטרילי ליחידת הסינון באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מחצית ממדגם supernatant (משלב 2.6) על גבי יחידת סינון קרום ולאסוף תאים בקרום באמצעות משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות איתןol-להבה מעוקרת מלקחיים. מניחים את הקרום לצלחת פטרי סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרום במחצית באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. להוסיף כל מחצית של הקרום לצינור נפרד 2 מיליליטר. מחצית מהקרום תשמש להפקת DNA וניתוח של קהילת החיידקים כולה. החצי השני של מסנן יאוחסן ב -80 ° C ומשמש כגיבוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קרום NC החדש על יחידת הסינון ולאסוף ביומסה מהמחצית השנייה של נפח דגימה (משלב 2.6) תוך שימוש במשאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. מניחים את כל הקרום לתוך צינור נפרד 2 מיליליטר. מדגם זה ישמש לטיפול להפריד endospores מתאי צמח. המדגם ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. </li></ol> 4. תמוגה של תאים גטטיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעטיפול להפריד endospores מהתאים של צמח ביומסה שנאספו בעבר על קרום NC (שלב 3.6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקרום הוקפא, להשאיר אותו על RT במשך 10 דקות כדי להפשיר. לאחר מכן למקם את הקרום בצלחת פטרי סטרילי ולחתוך אותו (כ 4 פעמים) לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. אז למקם את כל חלקי מסנן הקרום לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של חיץ 1x TE (טריס-EDTA) (ראה 1.5) לצינור המכיל קרום המדגם ומערבבים היטב על ידי מערבולת. בשלב זה, ביומסה היא להסיר את הקרום לפתרון TE-החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בחממה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו -80 סל&quot;ד. לאחר מכן להסיר את הצינור מהחממה ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של ליזוזים מוכן טרי (ראה 1.5) 100 μl להגיע לריכוז סופי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר. אל תוסיף יזוזים לפני המדגם התקרר עד 37 ° C, כמו זה יכול מעלותRade האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ו -80 סל&quot;ד, התנאים אופטימליים ליזוזים לlyse תאי צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תמוגה הושלמה, להוסיף 250 μl של 3 הידרוקסיד N נתרן (NaOH) ו -250 μl של 6% פתרון סולפט dodecyl נתרן (SDS) לדוגמא. על ידי הוספה זו, נפח הדגימה מגיע 1.5 מיליליטר ויש ריכוז סופי של 0.5 N NaOH וריכוז סופי של 1% SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זו תערובת על RT במשך 60 דקות ו -80 סל&quot;ד. הוספת הבסיס וחומרי הניקוי תעזור בתמוגה תא סופית. הריכוז של חומרי ניקוי אלה כבר מותאם כדי לא לפגוע בendospores, בעוד lysing תאי צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחידת סינון סטרילי שמחזיקה קרומי קוטר 25 מ&quot;מ על ידי מעוקר, או (אם פיירקס זכוכית) ריסוס זה עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קרום 0.2 מיקרומטר NC (25 מ&quot;מ קוטר) על יחידת הסינון באמצעות מלקחיים אתנול-להבה מעוקרת. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את המדגם מהצעד 4.7 על הממברנה ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. כאשר הנוזל עבר דרך, לכבות את משאבת ואקום. בשלב זה, את חומר התא וגטטיבי lysed מוסר, כפי שהוא לא שמר על הממברנה. רק endospores יישאר על הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית סטרילי כדי לשטוף את חומרי ניקוי שיורית ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נוזל מסונן באופן מלא, לכבות את משאבת הוואקום. השאר את הקרום ביחידת הסינון. </li></ol> 5. DNase טיפול הערה: בצע את טיפול DNase ישירות על קרום המסנן. חשובה שיחידת הסינון לא תדלוף ומשאבת הוואקום כבויה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 450 μl של מים סטריליים, 50 μl של חיץ תגובת DNase (1x) ו -0.5 אנזים DNase μl ישירות על גבי קרום המסנן ולתת לו לעמוד במשך 15 דקות. במידת האפשר, לעשות עיכול זה בחדר שהוא מעט מלחמהmer מ RT הממוצע, מאז האנזים עובד טוב יותר בטמפרטורות של 25 מעלות צלזיוס ומעלה. הערה: שמירה על המבער בונזן צד יחידת הסינון גם מעלה את הטמפרטורה ויש יתרון הנוסף של שמירה על הסביבה סטרילית, ולכן הפחית את הסיכון לזיהום של הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עיכול DNase הוא סיים, להפעיל משאבת ואקום כדי להסיר את האנזים מהמדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את האנזים שיורית על ידי הוספה וסינון 1 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הנוזל עבר באופן מלא, לכבות את משאבת ואקום ולהסיר את הקרום המכיל מסנן endospores באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי סטרילי. הערה: המדגם של endospores המופרד מוכן כעת לניתוח במורד הזרם. חנות ב -20 ° C אם משתמשת בו להפקת DNA או לחלופין על 4 מעלות צלזיוס אם משתמש בו לנביטה וטיפוח. </li></ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההתנגדות של endospores לגורמים חיצוניים אגרסיביים physicochemical (למשל, טמפרטורה או בדטרגנטים) שימשה כדי להמציא שיטה להפריד endospores חיידקים מהתאים של צמח בדגימות סביבתיות. זוהי השיטה המקיפה הראשונה לבודד endospores מדגימות סביבתיות באופן שאינו הרסני. שיטות קודמות לכמת, לזהות או לנתח endospores בדגימות המבוססות על המדידה של פרוקסי הספציפי לendospores כגון חומצת dipicolinic או גני סמן ספציפיים. לעומת זאת, בפרוטוקול שהוצג כאן, רכיבי מדגם אחרים מאשר endospores יוסרו וכך e...

המטרה של עבודה זו היא לספק פרוטוקול להפרדת endospores חיידקים מתאי חיידקים וגטטיבי בדגימות סביבתיות. ההיווצרות של endospores חיידקים היא אסטרטגיית הישרדות, בדרך כלל מופעל על ידי רעב, שנמצאה במספר קבוצות חיידקים המשתייכות למשפחה החסרה 1 Firmicutes. חיידקי יוצרי Endospore נלמדים היטב, בעיקר בגלל מספר זני פתוגנים ומכאן חשיבות רפואית (למשל, anthracis Bacillus או קלוסטרידיום). זני סביבה של חיידקי יוצרי endospore היו מבודדים מכמעט כל סביבה (קרקע, מים, משקעים, בטן חיות אוויר, קרח, מעיים אנושיים, ועוד) 1-3. לכן, Firmicutes הוא המערכה הזאת השנייה בשכיחותו באוספי תרבות 4. בגלל חלבוני הקליפה חיצונית וליבת מגן הקשוח שלהם, endospores יכול לשרוד בתנאי הסביבה קיצוני החל frהתייבשות אום לקרינה גבוהה, טמפרטורות קיצוניות וכימיקלים מזיקים 5. התנגדות יוצאת דופן זה עושה את זה אתגר לחלץ DNA מendospores 6-8. זה סביר מסביר מדוע הם התעלמו במחקרי רצף סביבתי 9,10. שיטות אחרות, כגון מיקוד של endospores בדגימות סביבתיות על ידי נוגדני ניאון 11, כימות של חומצת dipicolinic (DPA) בקרקע 12 ומשקעים 13, cytometry זרימת 14 או פסטור וטיפוח לאחר מכן 15,16 כבר משמשים לאחזור או לכמת endospores ב דגימות סביבתיות. בשנים האחרונות, שיטות מיצוי DNA מותאם כמו גם פריימרים ספציפיים מולקולריים למקד רצפי גני endospore ספציפי פותחו 10,17-20. זה עזר לחשוף יותר מגוון ביולוגי בקרב קבוצה זו של חיידקים 21 וגם הוביל ליישומים בתעשייה וברפואה לצורך זיהוי של endospores, למשל באבקת חלב 19. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על ההבדל בהתנגדות לתנאי physicochemical מזיקים (כגון חום וחומרי ניקוי) של endospores חיידקים ביחס לתאים של צמח. להשמיד תאים של צמח במדגם, שנתקיים ברצף להחיל חום, יזוזים וריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי. הזמן והכוח של טיפולים אלה כבר מותאמים כדי לא להרוס את הנבגים, אבל לlyse כל תאי הצמח. תאים מסוימים בבריכת תא סביבתית הם עמידים יותר מאחרים, ולכן כדי להגדיל את ההסתברות של השמדת כל התאים של הצמח, אנו מיישמים את שלושה טיפולים שונים. היתרון והחידוש של שיטה זו הוא שendospores לאחר הטיפול הוא עדיין שלם ויכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם. אלה כוללים מיצוי DNA, PCR (qPCR) וamplicon או רצף metagenomic (מיקוד במיוחד הקבוצה של endospores וכך להקטין דiversity, תוך הגדלת כיסוי). Endospores יכול לשמש גם לטיפוח או כימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי במורד הזרם, cytometry זרימה, או זיהוי של DPA. תכונה חשובה של שיטה זו היא שעל ידי השוואת מדגם שלא טופל עם מדגם מטופלים, אחד יכול להסיק את הכמות ומגוון של endospores במדגם סביבתי בנוסף לרכיב המקביל לשל צמח תאים.

<table><tbody><tr><td>מסנני קרום ניטרוצלולוזה של Whatman, 0.2 & # 956; גודל נקבוביות מ', קוטר 47 מ"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>ליזוזים מחלבון ביצת עוף</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>62971 אבקת פלוקה</td><td>, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax הומוגנייזר T18 בסיסי</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>מחזיקי מסנני זכוכית ל 47&nbsp; ממברנות מ"מ, זכוכית פיירקס</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום כימית</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 הרץ</td></tr><tr><td>סעפת דגימה סינון עבור 25&nbsp; ממברנות מ"מ</td><td>Millipore</td><td>1225 סעפת דגימה</td><td>פוליפרופילן</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0303S</td><td>ללא Rnase</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3771 סיגמא&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מסנני קרום ניטרוצלולוזה של Whatman, 0.2 & # 956; גודל נקבוביות מ', קוטר 25 מ"מ</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>WHA7182002 אולדריץ'</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד פיזי של endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

היווצרות אנדוספור היא אסטרטגיית הישרדות הנמצאת בקרב חיידקים מסוימים ממשפחת Firmicutes. במהלך היווצרות נבגי אנדוספור, חיידקים אלה נכנסים למצב מנוחה מורפו-פיזיולוגי המשפר את ההישרדות בתנאים סביבתיים קשים. למרות ש-Firmicutes יוצרי אנדוספורים הם אחת מקבוצות החיידקים המועשרות והמבודדות בתדירות הגבוהה ביותר במחקרי תרבות, הם נעדרים לעתים קרובות ממחקרי גיוון המבוססים על שיטות מולקולריות. ההתנגדות של ליבת הנבגים נחשבת לאחד הגורמים המגבילים את התאוששות ה- DNA מאנדוספורים. פיתחנו שיטה המנצלת את העמידות הגבוהה יותר של אנדוספורים כדי להפריד אותם מתאים אחרים בקהילה מיקרוביאלית מורכבת בשיטות ליזה פיזיקליות, אנזימטיות וכימיות. התכשיר האנדוספורי בלבד המתקבל כך יכול לשמש לתרבית מחדש או לביצוע ניתוח במורד הזרם כגון מיצוי DNA מותאם אישית המותאם לאנדוספורים וריצוף DNA לאחר מכן. שיטה זו, המיושמת על דגימות משקעים, אפשרה העשרה של אנדוספורים ולאחר ריצוף, חשפה מגוון גדול של יוצרי אנדוספורים במשקעי אגמי מים מתוקים. אנו מצפים כי יישום שיטה זו על דגימות אחרות יניב תוצאה דומה.

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 10,21. אנא עיין במאמרים אלה לפרשנות והדיון הסביבתיים של נתונים. ההליך הכולל מסוכם באיור 1 ומתאים לשלושה שלבים עיקריים: ראשון, ההפרדה של ביומסה ממשקעים או כל מטריצה ​​סביבתית אחרת; שני, ההרס של תאים של צמח; והשלישי, הניתוח במורד הזרם של endospores המופרד. ניתוח במורד הזרם יכול להיות מורכב, למשל, של מיצוי DNA ורצף amplicon לקבוע גיוון. מיצוי DNA צרי...

פותחה שיטה לזיהוי אנדוספורים חיידקיים מקהילות מיקרוביאליות מורכבות לביצוע תרבית מותאמת אישית או מחקרים מולקולריים של קבוצת חיידקים זו.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפריד אנדוספורות חיידקיות מדגימות של קהילות מיקרוביאליות מורכבות, כגון משקעים. שיטה זו מסייעת במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה בנוגע לנוכחותן ולשכיחותן של אנדוספורות בדגימות טבעיות. היא מבוססת על הפרש בעמידות בין אנדוספורות לתאים וגטטיביים כלפי כימיקלים וחום. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהשיטה אינה הורסת את האנדוספורות, כך שניתן להשתמש בהן לניסויים המשכיים כגון טיפוח, כימות ובדיקה מטבולית.למרות שתכננו שיטה זו לעבודה עם האקולוגיה של חיידקים יוצרי אנדוספורות, ניתן להשתמש בה גם בתחומים כגון אקסוביולוגיה או תעשיית המזון, שבהם נבגים יכולים להיות מועילים או מזיקים. לאחר הכנת התמיסות והציוד בהתאם לפרוטוקול הכתוב, תחת מ𒅊 ביו-בטיחותי שעומדר ב-UV, השתמשו בכפות מתכת שעברו עיקור בלהבת אתנול כדי להוסיף שלושה גרמים של דגימת משקע למבחנות סטריליות של 50 מיליליטר שנשקלו מראש. באמצעות ביורטה סטרילית ומדורגת, הוסיפו 15 מיליליטר של תמיסת sodium hexametaphosphate בריכוז 1%, מסוננת וסטרילית, או תמיסת SHMP, לדגימה.בעזרת מפזר נוזלים או הומוגניזר ורוטור פיזור סטרילי, הומוגניזרו את הדגימה ב-17,500 RPM למשך דקה אחת. המתינו שתי דקות והחזרו את פעולת ההומוגניזציה. השאירו את הדגימה למנוחה למשך 10 דקות כדי לאפשר לחלקיקים הכבדים ביותר לשקוע.העבירו את הנוזל העליון המכיל

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: Schlimpert, S., et al. הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים השלם של S. venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את הגידול והבידוד של נבגים מ-Streptomyces venezuelae. נבגים, תאים רדומים המסייעים לחיידקים לשרוד עקה, מיוצרים במהלך הגבלת חומרים מזינים ונאספים באמצעות צנטריפוגה. השיטה מבטיחה תרחיף נבגים טהור ומאוחסן בקור עבור יישומים במורד הזרם.

 הכנה ובידוד של נבגי Streptomyces venezuelae מתרבית נוזלית 

מקור: וונדרלין, ט. ואחרים. בידוד פיזי של אנדוספורות מדגימות סביבתיות באמצעות פירוק ממוקד של תאים צמחיים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים שיטה לבידוד אנדוספורים מדגימה סביבתית המכילה גם תאים וגטטיביים וגם חיידקים שונים. ההליך כולל סינון, שיבוש מכני וטיפול כימי סלקטיבי להחלשת ופירוק תאים וגטטיביים תוך שמירה על האנדוספוגרים. השלב האחרון מבודד את האנדוספורות העמידות באמצעות סינון ממברנה.

בידוד אנדוספורות מדגימה סביבתית באמצעות ניתוק ממוקד של תאים וגטטיביים 

כאן, אנו מתארים בדיקה קולורימטרית לאיתור נוכחות של סוכרים מפחיתים במהלך נביטת נבגי חיידקים.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים החשובים רצופים הנדרש כדי להעריך את הרלוונטיות של ניטור חיוניות פרמטר בתהליכי תיקון ה-DNA להחיות Bacillus subtilis נבגים לאחר הטיפול עם לחץ נמוך פלזמה על-ידי מעקב מתויג פלורסצנטיות DNA תיקון חלבונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים זמן לפתור קונפוקלית וסריקה.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

פטריות הזימה לגרום למחלות רבות החקלאי הרסנית. הם מופצים כמו teliospores רדום זה לנבוט בתגובה לאותות סביבתיים. אנו מכינים שתי שיטות כדי לחקור את השינויים המולקולריים במהלך הנביטה: מדידת נשימה עלייה כדי לזהות מטבולית הפעלה והערכה שינוי האירועים המולקולריים המתרחשים על-ידי בידוד teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים.

חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

חקור שיטה לבידוד אנדוספורות חיידקיות מדגימות סביבתיות מורכבות כמו משקעים. טכניקה זו מבוססת על הבדלי עמידות בין אנדוספורות לתאים גטטיביים לכימיקלים וחום, ומאפשרת ניסויים המשך כגון גידול ומיצוי DNA.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

גלה סרטונים נוספים