בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד אנדוספורים חיידקיים מדגימות קהילה מיקרוביאליות מורכבות, כגון משקעים שיטה זו מסייעת לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה על נוכחות ושפע של אנדוספורים בדגימות טבעיות. הוא מבוסס על הבדל בעמידות בין אנדוספורים לתאים צמחיים כלפי כימיקלים וחום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשיטה אינה הרסנית עבור אנדוספורים ולכן ניתן להשתמש בהם לניסויים במורד הזרם כמו טיפוח, כימות ובדיקות מטבוליות.

למרות שתכננו שיטה זו לעבודה עם האקולוגיה של חיידקים היוצרים אנדוספורים, ניתן להשתמש בה גם בתחומים כמו אקסוביולוגיה או תעשיית המזון, בהם נבגים יכולים להועיל או להזיק. לאחר הכנת פתרונות וציוד על פי פרוטוקול הטקסט, תחת ארון בטיחות ביולוגית מעוקר UV השתמש בכפות מתכת להבות אתנול כדי להוסיף שלושה גרם של דגימת משקעים לצינורות סטריליים של 50 מיליליטר שנשקלו מראש. בעזרת בורט סטרילי ומדורג הוסף לדגימה 15 מיליליטר של תמיסת נתרן הקסמטפוספט סטרילית ומסוננת 1% או SHMP.

בעזרת מפזר נוזלי או הומוגנייזר ורוטור פיזור סטרילי, הומוגניזציה של הדגימה ב-17, 500 סל"ד למשך דקה אחת. הניחו לדגימה לנוח שתי דקות וחזרו על ההומוגניזציה. הניחו לדגימה לנוח במשך 10 דקות עד שהחלקיקים הכבדים ביותר ישקעו.

העבירו את הסופרנטנט המכיל את הביומסה של התא לצינור נקי של 50 מיליליטר, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה. הוסף עוד 15 מיליליטר של SHMP לגלולה המשקעת וחזור על ההומוגניזציה לפני איסוף הסופרנטנט ושילובם עם האליקוט הראשון. צנטריפוגה של הדגימה ב-20 פעמים G למשך דקה אחת והעבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה של 50 מיליליטר לפני השלכת הגלולה.

לאחר הכנת יחידת הסינון ומשאבת הוואקום על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בלהבת אתנול כדי לעקר מלקחיים כדי להוסיף קרום ניטרוצלולוזה סטרילי ליחידת הסינון. הוסיפו מחצית מדגימת ה-supernatant שהוכנה זה עתה ליחידת סינון הממברנה והשתמשו במשאבת הוואקום כדי לאסוף את התאים על הממברנה. כאשר הנוזל עבר במלואו דרך המסנן, עצור את משאבת הוואקום.

השתמש במלקחיים מעוקרים כדי להסיר בזהירות את הממברנה ולהניח אותה בצלחת פטרי סטרילית. בעזרת חתיכת קרום סטרילי טרייה, חזור על הסינון עם המחצית הנותרת של התמיסה. כדי להפריד אנדוספורים מתאים צמחיים בביומסה שזה עתה נאספה, הפשירו את הממברנה אם היא הייתה קפואה והשתמשו במספריים מעוקרים להבות אתנול כדי לחתוך אותה לחתיכות קטנות יותר.

העבירו את חלקי הממברנה לצינור סטרילי של שני מיליליטר והוסיפו 900 מיקרוליטר של מאגר TE 1X. מערבבים היטב על ידי מערבולת כדי לשחרר את הביומסה מהממברנה. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ו-80 סל"ד למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוציאו את הצינור מהחממה ותנו לו להתקרר במשך 15 דקות. הוסף 100 מיקרוליטר של ליזוזים טרי מוכן לריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר ודגר את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס ו-80 סל"ד למשך 60 דקות כדי ליזוז את התאים הצמחיים. לאחר השלמת הליזה, הוסף לדגימה 250 מיקרוליטר של 3 נתרן הידרוקסיד רגיל ו-250 מיקרוליטר של תמיסת SDS 6%.

דגירה בטמפרטורת החדר ו 80 סל"ד למשך 60 דקות. לאחר מכן, הכינו יחידת סינון סטרילית המחזיקה ממברנות בקוטר 25 מילימטר על ידי חיטוי. לאחר שיחידת הסינון מתקררת, הניחו עליה קרום ניטרוצלולוזה בקוטר 25 מילימטר 0.2 מיקרומטר.

הוסף את הדגימה לממברנה והשתמש במשאבת הוואקום כדי לסנן את הנוזל, ללכוד את האנדוספורים על הממברנה, בזמן שחומר התא הצמחי עובר דרכו. כדי לשטוף שאריות חומרי ניקוי, הוסף שני מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית סטרילית לקרום והחל את משאבת הוואקום. כאשר הנוזל מסונן במלואו, כבה את המשאבה והשאיר את הממברנה על יחידת הסינון.

כדי לבצע טיפול DNase ישירות על הממברנה, הוסף 450 מיקרוליטר מים סטריליים, 50 מיקרוליטר של מאגר תגובה 1X DNase ו-0.5 מיקרוליטר של אנזים DNase על הממברנה ותן לו לעמוד על כ-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ה-DNA החוץ-תאי ששוחרר בעבר מתאים ליזים מתעכל אנזימטית ולאחר מכן נשטף. זה מבטיח שהכנת האנדוספור הסופית נקייה מ-DNA חיצוני שהוא המפתח לניתוח במורד הזרם כגון ניתוח מולקולרי.

חשוב לזכור שלא אמורה להיות דליפה על מנגנון המסנן, והדגימה לא מתייבשת. לאחר הדגירה הוסף מיליליטר אחד של תמיסה פיזיולוגית והפעל את המשאבה כדי לשטוף את שאריות האנזים מהדגימה. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הממברנה המכילה אנדוספורים לצלחת פטרי סטרילית.

נתח את המדגם על פי פרוטוקול הטקסט. הפרוטוקול שהודגם בסרטון זה של ליזה ממוקדת של תאים צמחיים מביא לדגימת אנדוספור מטוהרת ולעלייה משמעותית בחלק האנדוספורים היוצרים פירמיקוטים. בריצוף אמפליקון של גן ה-RNA הריבוזומלי 16S, firmicutes בדגימות לא מטופלות תואמות רק 8% עד 19% מהרצפים.

לעומת זאת, לאחר הטיפול ייצגו פירמיקוטים 90.6% ו-83.9% מהמדגם העשיר באנדוספורין. שני הסדרים העיקריים של ה-Firmicutes היוצרים אנדוספורים, bacillales ו-clostridiales, הועשרו בעוד ש-Firmicutes שאינם יוצרים אנדוספורים כמו lactobacillales נעדרו. יעילות הטיפול הודגמה גם באמצעות תרביות טהורות.

טופלו תכשיר אנדוספור ותרבית תאים וגטטיבית, כל התאים הודגרו ונמדדה צפיפות אופטית של 600 ננומטר. כפי שמוצג כאן, נצפתה צמיחה עבור תרביות האנדוספורים, בעוד שלא נצפתה צמיחה בתרבית E.Coli שטופלה, מה שמצביע על כך שתאים צמחיים נפגעים באופן בלתי הפיך. לאחר השליטה, ואם הוכנו בעבר פתרונות וציוד, יש לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות.

חשוב לזכור להימנע מכל זיהום על ידי עבודה בתנאים סטריליים והקפדה על סטריליות של התמיסות וכל הציוד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו גידול, בידוד ובדיקות מטבוליות על מנת לענות על שאלות נוספות על זיהוי הזן והפוטנציאל המטבולי של אנדוספורים. כמו כן, ניתן לבצע מיצוי DNA במורד הזרם וריצוף מטאגנומי כדי לנתח את מגוון המינים ונוכחות הגנים.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להפריד אנדוספורים מדגימות סביבתיות. אל תשכח שעבודה עם חומרי ניקוי כגון SDS עלולה להיות מסוכנת ביותר. אל תשכח ללבוש ציוד מגן אישי.