מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור
March 14th, 2016
הפרוטוקולים המוצגים מתארים שתי טכניקות מבוססות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA) לחקירה מהירה של אינטראקציות ליגנד-קולטן: הבדיקה הראשונה מאפשרת קביעת קבוע דיסוציאציה בין ליגנד לקולטן. הבדיקה השנייה מאפשרת סינון מהיר של פפטידים חוסמים לאינטראקציות ליגנד-קולטן.
המטרות של שיטה מבוססת ELISA זו הן ראשית לקבוע את זיקת הקישור של ציטוקין לקולטן שלו ושנית, למדוד את ההשפעות החוסמות של פפטידים מעכבים של אינטראקציה בין ליגנד לקולטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות בין חלבון לחלבון, כגון קשירת ציטוקין-קולטן. זיקות קשירה וחסימה של אלה עשויים להגביר את ההבנה הכללית של דינמיקת אינטראקציה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא, שהיא קלה לביצוע, היא מייצרת קולטני תוויות, והיא זולה יחסית, בשל הגישה הקלה של קורא זמין כגון ELISA. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציה של קולטני ציטוקינים, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון אינטראקציות כלליות של חלבון-חלבון ותכנון תרכובות חוסמות כדי לעכב את האינטראקציות הספציפיות. הכן את הפתרונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הקפד לסנן את מאגר הציפוי הפחמתי עם קרום PES של 0.22 מיקרון. השתמש בוואקום. כמו כן, הכינו 10 ריכוזים שונים של כל ליגנד או פפטיד.
ישנן שתי בדיקות המתוארות בסרטון זה, הראשונה היא אינטראקציה ישירה של קולטן ליגנד, ELISA. ניתן להשתמש בו כדי למדוד את קבוע הדיסוציאציה של קולטן-ליגנד, המייצג זיקה קשירת קולטן-ליגנד. הבדיקה השנייה היא אינטראקציה עם ליגנד-קולטן תחרות שאופטימיזציה לאחרונה ELISA.
זה מאפשר הקרנה של פפטידים ותרכובות חוסמות אחרות, הפועלות להפריע לאינטראקציה בין הקולטן לליגנד. ליעילות, התכוננו להשתמש בפיפטות רב-ערוציות לצלחות של 96 בארות, ובעת הסילוק, פשוט זרקו את תכולתן. התחל הליך זה על ידי ציפוי הצלחת בקולטן רקומביננטי.
ראשית, יש לדלל את הקולטן במאגר קרבונט ל-100 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, טען את בארות הצלחת עם 100 מיקרוליטר של תמיסת קולטן. אל תכלול את הקירות החיצוניים כדי להימנע מהתמודדות עם חפץ קצה הצלחת.
מכסים את הצלחת ומדגרים אותה בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בצע את כל דגירות הצלחת במערבולת עדינה. למחרת, הסר את תמיסת הציפוי ושטוף את הצלחת שלוש פעמים עם תמיסת הכביסה, PBS עם נגיעה של טווין 20.
לאחר מכן, חסום את אתרי קשירת הקולטנים החופשיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 5% PSA. תן לצלחת לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי להשלים את החסימה. מאוחר יותר, רוקנו את הבארות ושטפו את הצלחת כמו קודם.
כעת, טען את הבארות ב -100 מיקרוליטר מהדילולים השונים של ליגנד תג רקומביננטי. טען כל ריכוז בשכפול. טען את הבארות הריקות ב-PBS בלבד.
לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה עם הליגנדים, יש לשטוף את הצלחת שלוש פעמים בתמיסת כביסה. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של נוגדן חד שבטי ראשוני נגד העכבר שלו לכל באר ודגירה על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
לאחר שטיפת הנוגדן, לכל באר, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדן משני IGG נגד עכבר עיזים בשילוב HRP. עטפו את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע את האור. לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
השתמש בטכניקת הכביסה הסטנדרטית כדי להסיר את הנוגדן המשני. כעת, לכל באר, הוסף 100 מיקרוליטר של TMB טרי שהוכן מכמויות שוות של תמיסות מצע מלאי A ו-B.לאחר מכן, שמור את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן, לאחר פיתוח צבע מספיק, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מלאי לכל באר.
הפרוטוקול מבוסס על ההנחה שהאות שנשלח עולה מכריכה ספציפית. ייתכן שיהיה צורך להעריך את התרומה של קשירה לא ספציפית לאות. לאחר מכן, קרא את ערכי ספיגת הצלחת ב-450 ננומטר והמשך בחישוב ערך ה-KD.
נוהל ה-LRA התחרותי עוקב אחר אותם שלבים כמו נוהל ה-LRA הישיר, למעט כמה שינויים חשובים. לאחר שטיפת ליגנדות הציפוי העודפות מהצלחת, חסום את בארות הצלחת. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת BSA 5% לכל באר ודגר את הצלחת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
במהלך הדגירה, הכינו את הליגנדים הרקומביננטיים שלו בריכוז קבוע של 10 ננוגרם למיליליטר ב-PBS. לאחר מכן, הכינו את הפפטיד החוסם בריכוזים שונים ב-PBS, הנעים בין 10 ננו-מולרי ל-100 מיקרומולר כדי להבטיח עקומת מינון-תגובה. לפיכך, ניתן למצוא את ערך ה-IC50 עבור הפפטיד החוסם.
בבארות הבקרה, טען את ריכוז הליגנד הקבוע ללא פפטיד כדי להפיק את הכריכה המקסימלית. בבארות הריקות מוסיפים רק PBS ללא ליגנד או פפטיד. בבארות האחרות מוסיפים 50 מיקרוליטר מהליגנדים ו-50 מיקרוליטר מכל ריכוז פפטיד.
לאחר מכן, דגרו את הצלחת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר והמשיכו כרגיל. קבועי הדיסוציאציה בין שלושה פפטידים שונים של ליגנד אינטרפרון ותת-יחידת אלפא של הקולטן IL28R-a נקבעו באמצעות ה-LRA הישיר, החלק של אתרי הקישור התפוסים משורטט כנגד הלוגריתם של ריכוז האינטרפרון המתאים. תוצאות אלו ממחישות עקומת קישור שניתן לנתח כדי להעריך את ערך ה-KD על ידי התאמת הנתונים למשוואת היל.
תרשים סקצ'ארד ממחיש שיתוף פעולה בקשירת ליגנד, בסופו של דבר לליגנד אינטרפרון 1 הוא בעל הזיקה הגבוהה ביותר, ואחריו ליגנד אינטרפרון 2 וליגנד אינטרפרון 3. ערך מקדם היל של יותר מ-1 מצביע על זיקה מוגברת לליגנדים נוספים לאחר האינטראקציה הראשונית של קולטן הליגנד. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-LRA תחרותי כדי לכמת את ההשפעה של פפטיד חוסם על האינטראקציה בין פפטידי ליגנד האינטרפרון לבין תת-יחידת הקולטן.
חלק אתרי הקישור התפוסים לפפטיד ליגנד אינטרפרון ב-10 ננוגרם למיליליטר משורטט כנגד הלוג של ריכוז פפטיד האינטרפרון. מנתונים אלה הוערכו ערכי ה-IC50. על פי הערכים המחושבים, הפפטיד החוסם עיכב את האינטראקציה בין אינטרפרון ליגנד 3 ל-IL28R-a במידה הגדולה ביותר.
לאחר שליטה, טכניקה זו, ניתן לעשות זאת תוך שמונה שעות. אם זה מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי כל ריכוז רוויה של קשירת קולטן ליגנד, בעקבות הליך זה, ניתן לבצע את השיטות האחרות כמו כדי לקבל ערכי KD מפורטים יותר.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האינטראקציות בין ליגנד לקולטן לחקור חומרים מעכבים לחסימת אינטראקציות אלה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שתי טכניקות מבוססות ELISA לחקר אינטראקציות ליגנד-קולטן. השיטה הראשונה קובעת את קבוע הדיסוציאציה, ואילו השנייה מסננת פפטידים חוסמי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיית תאים
- אינטראקציות חלבון-חלבון
רקע
- הבנת אינטראקציות ליגנד-קולטן היא חיונית בתהליכים ביולוגיים שונים.
- ELISA היא שיטה נפוצה לכימות חלבונים וחקר אינטראקציות.
- זיקות קשירה מספקות תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות אלו.
- פפטידים חוסמים ניתנים לעיצוב כדי לעכב אינטראקציות ספציפיות.
מטרת המחקר
- לקבוע את זיקת הקשירה של ציטוקינים לקולטניהם.
- למדוד את ההשפעות של פפטידים מעכבים על אינטראקציות ליגנד-קולטן.
- לשפר את ההבנה של הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-חלבון.
שיטות ששימשו
- טכניקות מבוססות Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
- הכנת תמיסות על פי הפרוטוקול המפורט.
- מדידת זיקות קשירה ואפקטים של חסימה.
- יישום למערכות שונות של אינטראקציות חלבון-חלבון.
תוצאות עיקריות
- קביעה מוצלחת של קבועי דיסוציאציה לזוגות ליגנד-קולטן.
- זיהוי פפטידים חוסמים יעילים.
- תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות ציטוקין-קולטן.
- יישומים פוטנציאליים בעיצוב מעכבים לאינטראקציות ספציפיות.
מסקנות
- השיטות מבוססות ELISA יעילות לחקר אינטראקציות ליגנד-קולטן.
- טכניקות אלו נגישות ובעלות עלות נמוכה.
- הן מספקות תובנות חשובות על אינטראקציות חלבון-חלבון.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid, quantitative assessment of ligand-receptor binding and competitive inhibition is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. ELISA-based binding and competition assays provide scalable, reproducible platforms for evaluating affinity and inhibitory potential, directly informing lead identification and portfolio triage. These methods enable confident progression decisions by delivering actionable binding constants and inhibitor potencies in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Quantifies ligand-receptor binding affinities to support functional target validation.
- Enables mechanistic de-risking by measuring dissociation constants (KD).
- Facilitates identification of competitive inhibitors for pathway interrogation.
- Supports predictive confidence in target engagement and downstream effects.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative ELISA platforms for reproducible screening.
- Generates robust dose-response and inhibition curves for compound evaluation.
- Enables high-throughput assessment of blocking peptides or small molecules.
- Provides validated readouts for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns binding and inhibition data with disease-relevant receptor-ligand systems.
- Supports translational biomarker development by quantifying functional interactions.
- Bridges discovery findings to preclinical model validation when relevant.
- Reduces risk of late-stage attrition by confirming mechanistic hypotheses early.
Pipeline & Workflow Integration
ELISA-based binding and competition assays integrate at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical validation, providing quantitative data for go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct measurement of binding and inhibition.
- Screening: Offers reproducible, scalable assay formats for compound and peptide evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative KD and IC50 values for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro binding data with disease-relevant targets when supported by system selection.
- Enterprise Reuse: Provides a broadly applicable platform for diverse protein-protein interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes affinity and inhibition measurements for cross-team comparability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go and triage decisions, improving capital allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and inhibitors.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ELISA assay design and quantitative data analysis.
- Needs access to standard ELISA instrumentation and plate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay conditions and controls.
- May require adaptation for different ligand-receptor or protein-protein systems.
- Signal specificity and non-specific binding must be carefully controlled and quantified.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Preparations and Introduction of Assays
2:14
Direct Ligand-Receptor-Interaction Assay (Direct LRA)
5:05
Competition Ligand-Receptor-Interaction Assay (Competition LRA)
6:24
Results: Binding Between INFL 1-3 Peptides and Their Receptor Sub-unit IL28RA
7:48
Conclusion
