מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור

המטרות של השיטה המבוססת על ELISA הן ראשית לקבוע את זיקת הקישור של ציטוקין לקולטן שלו ושנית, למדוד את השפעות החסימה של פפטידים מעכבים של אינטראקציית ליגנד-קולטן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציות חלבון-חלבון, כמו קישור ציטוקין-קולטן. זיקות קישור וחסימה של אלה עשויות להגדיל את ההבנה הכללית של דינמיקת האינטראקציה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא, שהיא קלה לביצוע, היא מייצרת קולטנים מסומנים, והיא זולה יחסית, בשל הגישה הקלה לזמינות כמו קורא ELISA. אף על פי ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אינטראקציית קולטן הציטוקין, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כמו אינטראקציות חלבון-חלבון כלליות ועיצוב תרכובות חוסמות לעכב את האינטראקציות הספציפיות. הכן את הפתרונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ודא לסנן את מאגר ציפוי הפחמן עם ממברנת PES של 0.22 מיקרון. השתמש בשאיבה. בנוסף, הכן 10 ריכוזים שונים של כל ליגנד או פפטיד.

יש שתי בדיקות המתוארות בסרטון זה, הראשונה היא אינטראקציית ליגנד-קולטן ישירה, ELISA. ניתן להשתמש בה למדידת קבוע הדיסוציאציה קולטן-ליגנד, המייצג את זיקת הקישור קולטן-ליגנד. הבדיקה השנייה היא ELISA אינטראקציית ליגנד-קולטן תחרותית שאופטימה לאחרונה.

זה מאפשר סינון של פפטידים ותרכובות חסימה אחרות, אשר פועלים להפריע באינטראקציית קולטן-ליגנד. לצורך יעילות, הכן לשימוש פיפטות רב-ערוציות לצלחות 96 באר, ובעת השלכה, פשוט שופכים את תוכנן. התחל בהליך זה על ידי ציפוי הצלחת בקולטן רקומביננטי.

ראשית, דלל את הקולטן במאגר פחמן ל-100 ננוגרם למיקרוליטר. טען את בארות הצלחת עם 100 מיקרוליטר של תמיסת קולטן. הרחק את הקירות החיצוניים כדי להימנע מהתמודדות עם ארטיפקט קצה הצלחת.

כסה את הצלחת ודגר אותה ב-4 מעלות צלזיוס למשך לילה. בצע את כל דגירת הצלחת עם נענוע עדין. למחרת, הסר את תמיסת הציפוי ושטוף את הצלחת שלוש פעמים עם תמיסת השטיפה, PBS עם טיפת טווין 20.

לאחר מכן, חסום את אתרי הקישור החופשיים של הקולטן על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 5%PSA. תן לצלחת להדגר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר להשלמת החסימה. מאוחר יותר, רוקן את הבארות ושטוף את הצלחת כמו קודם.

כעת, טען את הבארות עם 100 מיקרוליטר של דילולים שונים של ליגנד היס-טאג רקומביננטי. טען כל ריכוז בשכפול. טען את הבארות הריקות עם PBS בלבד.

לאחר מכן, דגר את הצלחת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בעקבות הדגירה עם הליגנדים, שטוף את הצלחת שלוש פעמים עם תמיסת שטיפה. לאחר מכן, טען 100 מיקרוליטר מהפיפטה של נוגדן עכברי מונוקלונלי ראשוני נוגד היס לכל באר ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר השטיפה של הנוגדן, לכל באר, הוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדן משני עכברי נוגד IGG מצומד HRP. עטף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע את האור. לאחר מכן, הדגר את הצלחת למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.

השתמש בטכניקת השטיפה הסטנדרטית כדי להסיר את הנוגדן המשני. כעת, לכל באר, הוסיף 100 מיקרוליטר של TMB טרי שנעשה מכמויות שוות של פתרונות מצע מלאי A ו-B. לאחר מכן, שמור את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן, לאחר התפתחות צבע מספקת, הוסיף 50 מיקרוליטר של פתרון מלאי לכל באר.

הפרוטוקול מבוסס על ההנחה כי האות המסופק נובע מקישור ספציפי. ייתכן שיהיה צורך להעריך את תרומת הקישור הלא ספציפי לאות. לאחר מכן, קרא את ערכי ספיגת הצ