אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 2. שיטות כלליות

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים פרקטיקות בטיחותיות בעבודה במעבדת חליפות ברמת בטיחות ביולוגית 4 (BSL-4), תוך שימוש בבדיקת פלאקים (plaque assay) כדוגמה. הליך זה מדגים את ההתאמות הדרושות לביצוע בדיקת פלאקים סטנדרטית בסביבה של רמת בטיחות ביולוגית 4. את ההליך תדגים יחד איתי טרייסי ברדט (Tracey Burdette), טכנאית מהמתקן למחקר משולב (Integrated Research Facility).

עם השלמת רשימת הבדיקות היומית של המערכות הפנימיות, נקה את קבינת הבטיחות הביולוגית מסוג class II על ידי התזה של תמיסת חיטוי 5% dual quaternary ammonium על הפנים, כולל על חלון ההגנה (sash). לאחר מכן, נגב את הקבינה בעזרת מגבות נייר, והקפד להשאיר את בקבוק ההתזה המכיל את תמיסת החיטוי בתוך הקבינה לצורך התזתו על הידיים עם הכפפות במהלך סיום הבדיקה ואחריה. התז תמיסת 70% ethanol בתוך הקבינה ועל חלון ההגנה כדי להסיר את שאריות תמיסת החיטוי הדביקה.

הכינו מיכל פסולת עבור קבינת הבטיחות הביולוגית. ודאו כי הריכוז הסופי של תמיסת חיטוי dual quaternary ammonium במיכל הפסולת אינו נמוך מ-5%, תוך התחשבות בכל נוזל נוסף שיתווסף. הניחו את מיכל הפסולת המכיל תמיסת חיטוי 5% dual quaternary ammonium בתוך קבינת בטיחות ביולוגית מסוג class II.

בצע את כל העבודה קרוב ככל האפשר למרכז הפנימי של תא בטיחות ביולוגית (biosafety cabinet) מסוג class II. המרכז הפנימי תוכנן להיות המיקום היעיל ביותר להגנה עצמית. העבר 50 µL מדגימת הנגיף ומנגיף הביקורת והנח אותם לתוך 450 µL של מצע Dulbecco's Modified Eagle's עם 2% fetal bovine serum בבארות דילול.

המשיכו בביצוע דילולים סדרתיים עד למספר הנדרש. ערבבו את דגימות הנגיף לפחות חמש פעמים בעזרת טיפ של פיפט, והחליפו את טיפ הפיפט לאחר כל דילול. ערבבו באיטיות כדי למזער את היווצרות בועות אוויר בדגימות.

עם הסיום, הניחו את בארות המיהול בצד. בעת השלכת הטיפים, שטפו כל טיפ עם תמיסת חיטוי מדלי waste כדי לחטא את פנים הטיפ וחוצה לפני השלכתו לדלי ה-waste. הסירו את רוב המצע מבבוארות של פלטות תרבית תאים בעלות שישה בארות.

הוסף 100 µL מהדגימה המתאימה לתוך הבאר המתאימה בלוחות המסומנים מראש, בשכפול (duplicate). עם הסיום, רסס את הידיים במעל הכפפות בתמיסת החיטוי. השתמש בנייר סופג ספוג בתמיסת חיטוי כדי לנגב את החלק החיצוני של כל הלוחות לפני הצבתם ביד בתוך האינקובטור.

נענעו את הפלטות בתנועת שמינית כדי להבטיח פיזור נכון של הדגימה על התאים מדי 15 דקות למשך שעה אחת. הוסיפו שני מיליליטר של תערובת הכיסוי לכל באער ונענעו שוב בתנועת שמינית כדי להשיג פיזור שווה של הכיסוי על פני שטח הבאר. השקיעו לחלוטין את כל חומרי הפסולת בתוך תמיסת חיטוי 5% בדלי הפסולת למשך זמן מגע של 10 דקות לפחות.

רססו את החלק הפנימי והחיצוני של דלי הפסולת, את החלק הפנימי של קבינת הבטיחות הביולוגית מסוג class II, את החלק החיצוני של הציוד ואת הידיים במעטפות השממנים בתמיסת חיטוי בריכוז 5%. השאירו את התמיסה בדלי הפסולת ועל משטחים אחרים למשך זמן מגע של 10 דקות. לאחר מכן, הוציאו את הפריטים מקבינת הבטיחות הביולוגית והעבירו אותם לכיור.

הניחו את הפיפטה המשומשת במגש פיפטות לצורך אוטוקלאב. שפכו את תכולת דלי הפסולת למסננת בכיור. לאחר מכן, הביאו אל הכיור מכל לפסולת ביו-הזארד המרופד בשקית ביו-הזארד אדומה, ורוקנו את תכולת המסננת אל תוך השקית האדומה.

הניחו את שקית הפסולת הביולוגית על מגש אוטוקלאב שעל עגלה. סגרו את שקיות האוטוקלאב באופן רופף בעזרת סרט דביק, כך שיהיה קיטור לחדור לשקית. סמנו את אחד מסרטי האוטוקלאב בראשי תיבות של המבצע ובתאריך.

הוצא את מוט המתכת המחורר מהאוטוקלאב ופתח את המכסה. הנח מבחנה של אינדיקטור ביולוגי המכילה נבגי Geobacillus stearothermophilus לתוך מוט המתכת, כדי לשמש כבדיקה לוודא שמחזור הסטריליזציה באוטוקלאב הושלם בהצלחה. הכנס לאוטוקלאב את מגש האוטוקלאב המלא בפסולת.

הפעילו את האוטוקלאב וודאו שהמחזור התחיל. מסך התפעול של האוטוקלאב יציג את הזמן שנותר להרצה זו. לאחר השלמת תקופת הדגירה הנדרשת, הוציאו בזהירות את צלחות בדיקת הפלאקים (plaque assay) מהאינקובטור והעבירו אותן ידנית לקבלינה של רמה II נקייה.

שאבו את המצע ואת החומר העיטוף באמצעות פיפטה והעבירו אותם למכל תמיסת החיטוי. החליפו את המצע בתערובת של 10% neutral buffered formalin ו-0.8% crystal violet כדי לנטרל את הנגיף למשך זמן מגע של 30 דקות. לאחר הנטרול, הסירו בזהירות את תערובת ה-neutral buffered formalin/crystal violet והעבירו אותה למכל פסולת נפרד לצורך נטרול לפני הסליקה.

בכיור, שטפו את הצלחות כדי להסיר את הצבע העודף ולאחר מכן הניחו את הצלחות במגש לייבוש מלא. השתמשו בשולחן אור כדי לספור את הפלאקים. רשמו את כל הספירות, וחשבו את titers של הנגיף באמצעות המשוואה הסטנדרטית.

להוצאת דגימות שעברו אינאקטיבציה ממעבדת BSL-4, הניחו את המבחנות או הצלחות בשקית אטימה תרמית. רססו את פנים השקית בתמיסת חיטוי או קיבוע בריכוז 5%, כדי לחטא את פנים השקית ואת החלק החיצוני של מבחנות הדגימה. לאחר מכן, אטמו את השקית באמצעות חום.

הכנס שקית זו לתוך שקית נוספת בהתאם לאותו הליך. בצע איטום תרמי לשקית השנייה והנח את השקיות בעלות האיטום הכפול לתוך מיכל טבילה המכיל 5% תמיסת חומר חיטוי למשך 10 דקות לפחות, על מנת לחטא את החלק החיצוני של השקיות. מלא את יומן רישום מיכל הטבילה בתוך המעבדה על ידי פירוט מספר וגודל המבחנות, הנפח במבחנות, החומר שבו נעשה שימוש, שיטת ההשבתה שבוצעה והחדר אליו יועברו הדגימות.

הקפדה על נהלים נכונים בתוך מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 4 (BSL-4) היא קריטית להבטחת ביצוע בטוח ואפקטיבי של בדיקות. על ידי התייחסות לצ'ק-ליסט הבדיקה הפנימי היומי שהושלם, צוות המעבדה מוודא שהציוד תקין ופועל באופן מלא. דגימת הנגיף מדללת בסדרה כדי לקבל פלטות עם 30 עד 300 פלאקים (plaques) לבאר וכדי לקבוע את תיתור הנגיף.

מספר גורמים משפיעים על היווצרות פלאקים, כולל טרופיזם של הנגיף לתאי המאכסן, טכניקת ההזרקה, תנאים לצמיחת נגיף, טווח דילול מתאים ובחירת שכבת הכיסוי. פסולת הנוצרת בתוך תא הבטיחות הביולוגית במהלך הפרוצדורה עוברת חיטוי פעמיים. הפסולת עוברת חיטוי תקין פעם אחת לפני הוצאתה מתא הבטיחות הביולוגית.

לאחר מכן, הפסולת עוברת עיקור באוטוקלאב לפני הוצאתה מסביבת רמת בטיחות ביולוגית 4 לבעלי חיים. באמצעות הקפדה על נהלים אלו, לא תועדו זיהומים שנרכשו במעבדה במהלך מחקר ברמת בטיחות ביולוגית 4 לבעלי חיים במתקן המחקר המשולב (Integrated Research Facility) בפרדריק. ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש עד ארבע שעות, תלוי במספר הדגימות, במידה והיא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו לבצע את הדילולים בצורה נכונה, לספור את הפלאקים בהתאם ולהישמע לכל אמצעי הבטיחות, כדי להבטיח ניסוי בטוח ומצליח. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של המגבלות הפיזיות הכרוכות בשימוש בחליפות בלחץ חיובי, ושל הזמן הנוסף הנדרש להשלמת בדיקת פלאקים סטנדרטית.