Multi-אקסון דילוג שימוש אנטיסנס קוקטייל של ניוון השרירים הצמוד X לכלבים
24 במאי 2016
דילוג על אקסונים הוא כרגע אופציה טיפולית מבטיחה ביותר בניוון שרירים דושן (DMD). כדי להרחיב את תחולת לחולים DMD וכדי לייעל את יציבות / פונקציה של חלבונים בדיסטרופין מקוצץ וכתוצאה מכך, גישה-אקסון רב דילוג באמצעות מולקולות אנטיסנס קוקטייל פותחה הראינו הצלה בדיסטרופין מערכתית במודל הכלב.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון את היעילות והרעילות של דילוג על אקסונים מרובים באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס קוקטייל או AONs במודל כלב של ניוון שרירים דושן או דושן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח במחקר תרגומי של טיפול בדילוג על אקסונים אנטיסנס, כגון האם אוליגונוקלאוטידים של אנטיסנס יכולים לגרום לדילוג על אקסונים מרובים ולהרוס ביטוי ניוון במודל של בעלי חיים גדולים. היתרון העיקרי בשימוש במודל הכלב במחקר הוא שניתן להסיק תוצאות טיפוליות בבעלי חיים גדולים יותר בצורה מהימנה יותר לחולי דושן.
למרות שדילוג על אקסונים הוא טיפול מבטיח מאוד למחלת הדושן, ניתן ליישם אותו גם במחלות גנטיות אחרות, כגון ניוון שרירים מולד וניוון שרירים בחגורת הגפיים. הדגמת הניסויים במבחנה תבוצע על ידי ד"ר יושיטסוגו אאוקי, ראש המעבדה שלנו, והדגמת הניסויים in vivo תבוצע על ידי ד"ר מוטסוקי קוראוקה, פוסט-דוקטורנט מהמחלקה שלי. לאחר תכנון AONs על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בלוחות של 6 בארות כדי לזרוע 1 עד 5 פעמים 10 עד השלישי לסנטימטר רבוע מיובלסטים CXMD בשלושה מיליליטר של DMEM עם 10% FBS ו-1% עט-סטרפטוקוק.
דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד ל-60 עד 80% מתלכדים. כאשר התאים מגיעים למפגש הרצוי, השתמש במדיום סרום מופחת כדי לדלל מגיב טרנספקציה ליפוזום קטיוני לנפח כולל של 100 מיקרוליטר, ולאפשר לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, עם מדיום סרום מופחת, יש לדלל את ה-AONs לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.
שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם ה-AONs המדוללים, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות. בינתיים, הסר את המדיום מהתאים והשתמש במדיום טרי כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף 0.8 מיליליטר בינוני לתערובת הטרנספקציה, ואז הוסף את כל התמיסה לתאים הטריים שנשטפו.
דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הוסיפו מדיום התמיינות, או DM, לתאים, ודגרו עד 10 ימים כדי להתרחש התמיינות. החל מהיום השלישי, בדוק אם יש בידול.
כדי לבצע טרנספקציה של מורפולינו של מיובלסטים של כלבים, תרבית מיובלסטים CXMD כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. מחממים מורפולינו קוקטייל בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסף מגיב להעברת פפטיד והתאם את המורפולינו לריכוז סופי של שלוש עד שש מיקרומולר.
לאחר מכן, השתמשו ב-DM כדי להחליף את המדיום במיובלסטים, והוסיפו את המורפולינו לכל באר בריכוז סופי של מיקרו-טוחנת אחת. דגירה למשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, כדי לאסוף את התאים למיצוי RNA, הוסף מיליליטר אחד של גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם לתאים כדי לנתק אותם מהצלחת.
לאחר דגירה של התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, העבירו את התאים לצינורות של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות עד שניתן לראות שלוש שכבות נפרדות, שכבת ה-RNA, שכבת החלבון ושכבת ה-DNA. צנטריפוגה לצינורות בטמפרטורה של 12, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
לאחר מכן, הסירו את השכבה העליונה של הסופרנטנט והעבירו לצינור המכיל 500 מיקרוליטר איזופרופנול. סובבו את צינורות ה-supernatant לפני הסרת ה-supernatant ושמרו את כדור ה-RNA. השתמש באתנול כדי לשטוף את הגלולה, ובצנטריפוגה ב 8, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
הפוך את הצינור למשך 15 דקות כדי לאדות את שאריות האתנול לפני הוספת 15 עד 30 מיקרוליטר מים ללא RNase. לאחר מכן, השתמש בספקטרוסקופיה UV-Vis ב-260 ננומטר כדי לכמת את ה-RNA. כדי לבצע RT-PCR, מערבבים יחד את הריאגנטים הבאים ומוסיפים מים לנפח סופי של 25 מיקרוליטר.
הנח את הדגימות בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית הבאה. בסיום הריצה, אחסן את המוצר בארבע מעלות צלזיוס או 20 מעלות צלזיוס. לביצוע הזרקה תוך שרירית, לאחר הכנת החיה לניתוח והרדמתה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש באזמל כדי לחתוך את העור כחמישה סנטימטרים לאורך מעל השוק הגולגולתי, או CT.To לסמן את אתרי ההזרקה, השתמש במחט כירורגית ובחוט כירורגי כדי לתפור את הפאשיה העמוקה על ידי יצירת שני סמני תפרים במרווחים של שני סנטימטרים.
חשוב מאוד לסמן את מקום ההזרקה בחוט מכיוון שהדבר מאפשר ביופסיה מדויקת יותר. לאחר מכן, באמצעות מחט בקוטר 27, הזריקו את הריכוז הרצוי של AONs לשריר, והשאירו את המחט למשך דקה אחת. לאחר מכן, כדי לבצע ביופסיה של שריר פתוח, השתמש באזמל כירורגי כדי להסיר פיסת רקמת שריר באורך של כשני סנטימטרים משריר ה-CT.
הנח את פאשיה השריר בחזרה על השריר והשתמש בחוט נספג 000 כדי לסגור את הרקמה. לאחר מכן, השתמש בחוט ניילון 000 כדי לסגור את העור. בעזרת מחט, יש לתת זריקה תוך שרירית של 0.02 מיליגרם לק"ג בופרנורפין הידרוכלוריד.
כדי להזריק קוקטייל המכיל כמויות שוות של כל AON לווריד הגפה, תוך החזקת החיה על פי פרוטוקול הטקסט, הכנס מחט שוכנת ורידית לווריד הגפה. בעזרת משאבת עירוי או דרייבר מזרק, הזרקו 50 מיליליטר בסך הכל ב-2.5 מיליליטר לדקה למשך 20 דקות, בהתאם להוראות היצרן. חזור על הזריקות מדי שבוע או דו-שבועיים, מכיוון שביטוי הדיסטרופין יצטבר עם זריקות חוזרות.
כדי לבצע בדיקות דם שבועיות לבדיקת רעילות, השתמש במחט כדי לאסוף שלושה מיליליטר דם מאחד הוורידים התת עוריים של הגפה הקדמית או האחורית. בהתאם להוראות היצרן, כלול את ההערכות הבאות. בצע ניתוחים נוספים על פי פרוטוקול הטקסט.
מיובלסטים הועברו עם מצבי טיפול שונים של 2'OMePS על מנת להשוות את היעילות של כל AON. הג'ל המוצג כאן מייצג דגימות RT-PCR מ-RNA שנאספו ארבעה ימים לאחר הטיפול. רצועות גבוהות יותר על הג'ל מייצגות מוצרי DMD מחוץ למסגרת, ונצפו במיובלסטים שטופלו ב-Ex8A ו-Ex8B שלא טופלו.
Ex6A, Ex6B, Ex8A והמיובלסטים שטופלו בקוקטיילים הראו מוצרים בתוך המסגרת. ריצוף cDNA אימת שאקסון 6 עד 9 דילג. כפי שניתן לראות באיור זה, אימונוציטוכימיה גילתה כי לתאי כלבים שטופלו ב-AON היו סיבים חיוביים לדיסטרופין מוגברים בהשוואה לדגימות שלא טופלו.
כדי להשוות את היעילות של מצבי טיפול שונים ב-AON, הוזרק לכלבי CXMD Ex6A, או קוקטייל של Ex6A, Ex6B ו-Ex8A במינונים שונים. דגימות שריר שנצבעו עבור DYS1 הראו עלייה בביטוי הדיסטרופין בדגימות שטופלו בקוקטיילים, וסיבים חיוביים לדיסטרופין עלו עם מינון הדיסטרופין. לאחר הזרקות סיסטמיות, כלבי CXMD שטופלו בקוקטיילים הראו ביטוי מוגבר של דיסטרופין בהשוואה לכלבי NT CXMD, הן ב-CT והן בדגימות שריר הלב.
עם זאת, שרירי השלד שטופלו ב-AON הראו ביטוי גבוה בהרבה של דיסטרופין בהשוואה לשריר הלב שטופל. בנוסף, כלבי CXMD שטופלו הראו שיפור בהיסטופתולוגיה עם ירידה משמעותית בסיבים בעלי גרעין מרכזי בהשוואה לכלבי NT CXMD. לאחר שליטה, ניתן לבצע ניסויים במבחנה וב-vivo תוך מספר שעות אם הם מבוצעים כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב בקפידה אחר מצבו הבריאותי של הכלב. לאחר פיתוחו, דילוג אקסון מערכתי סלל את הדרך לחוקרים בתחום זה להתחיל בניסויים קליניים בבני אדם בחולי דושן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטפל בכלבים עם אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את היעילות והרעילות של דילוג על מספר אקסונים (multi-exon skipping) באמצעות תערובת של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס (AONs) במודל כלבים של דיסטרופיה שרירית של דושן (DMD). הממצאים מעידים על השגה סיסטמית של דיסטרופין, ומדגישים את הפוטנציאל של גישה טיפולית זו עבור חולי DMD.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- תרפיה גנטית
- דיסטרופיה שרירית
רקע
- דיסטרופיה שרירית של דושן (DMD) היא הפרעה גנטית חמורה.
- דילוג על אקסונים (Exon skipping) הוא אסטרטגיה טיפולית מבטיחה עבור DMD.
- שילובים של AONs (קוקטיילים) יכולים להוביל לדילוג על מספר אקסונים.
- שימוש במודל כלבים מאפשר אקסטראפולציה טובה יותר של התוצאות לחולים בבני אדם.
מטרת המחקר
- להעריך את יעילותו של דילוג על מספר אקסונים (multi-exon skipping) במודל של בעל חיים גדול.
- להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של AONs in vivo.
- לבחון את התשומשיות של דילוג על אקסונים למחלות גנטיות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של מיובלסטים CXMD באמצעות AONs בעזרת ליפוזומים קטיוניים.
- מתן AONs in vivo באמצעות הזרקה לשריר ועירוי ורידי.
- הוצאת RNA וביצוע RT-PCR לניתוח ביטוי הדיסטרופין.
- בדיקות דם שבועיות לניטור רעילות במודל הכלבים.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של דילוג על מספר אקסונים במיובלסטים שטופלו.
- נצפתה הצלה סיסטמית של ביטוי הדיסטרופין במודל הכלבים.
- הוכחה היתכנותה של טיפול ב-AON עבור DMD.
- לא נצפתה רעילות משמעותית בבעלי החיים שטופלו.
מסקנות
- דילוג על מספר אקסונים באמצעות AONs מהווה אסטרטגיה טיפולית ישימה עבור DMD.
- התוצאות תומכות בהמשך חקר קליני בחולים בני אדם.
- גישה זו עשויה להועיל גם להפרעות שרירים גנטיות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דילוג על מספר אקסונים באמצעות תערובת של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס (AONs) במודל לדיסטרופיה שרירית מקושרת ל-X בכלבים, נותן מענה לפער תרגומי קריטי בפיתוח טיפולים לדיסטרופיה שרירית של דושן (DMD). גישה זו מאפשרת בדיקה רחבה של היפותזות בנוגע ליעילות מערכתית ובטיחות במודל של בעל חיים גדול, ומספקת מידע ישיר לביסוס רמת הביטחון בניבויים ולהקדמת תיק הפיתוח של טיפולים המבוססים על דילוג על אקסונים. השיטה תומכת בקבלת החלטות אסטרטגיות בנקודת המפגש בין תיקוף המטרה להפחתת סיכונים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות עבור דילוג של מספר אקסונים (multi-exon skipping) במערכת רלוונטית למחלה.
- מספק תיקוף תפקודי של המטרה באמצעות השחזור של ביטוי הדיסטרופין במודל של בעל חיים גדול.
- תומך בביטחון ניבוי עבור תרגום קליני לחולי DMD בני אדם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקיים מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכה כמותית של יעילות דילוג על אקסון.
- מסייע בסטנדרטיזציה ובשחזור של הבדיקה באמצעות קריאות של RT-PCR ואימונוציטוכימיה.
- מאפשר השוואה מהימנה בין תערובות של AON לבין טיפולים ב-AON בודד לצורך סריקה המשכית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם סמנים ביולוגיים הרלוונטיים למחלה על ידי כימות של השחזור של הדיסטרופין בשריר השלד ובשריר הלב.
- מספק רצף מתיקוף במבחנה (in vitro) להגשה סיסטמית בתוך הגוף (in vivo) ולהערכת בטיחות.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על פרופילי יעילות ורעילות במודל תרגומי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים, זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) והתיקוף הפרה-קליני, על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת יעילות ובטיחות של דילוג על מספר אקסונים (multi-exon skipping) במודל של בעלי חיים גדולים.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת היפותזות עבור דילוג על מספר אקסונים ומבהיר מנגנונים ביולוגיים של השחזת דיסטרופין.
- סריקה: מספק תוצרי RT-PCR כמותי וצביעה אימונוהיסטוכימית להערכת יעילות ניתנת לשחזור.
- אנליטיקה: מספק השוואה סטטיסטית של תנאי טיפול ומערכות יחסי תגובה למנה.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים פרה-קליניים למוכנות לניסויים קליניים על ידי הדגמת הצלה סיסטמית במודל רלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר להערכת תערובות של oligonucleotides antisense במודלים של מחלות גנטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון הניבוי ומפחית עמימות מכניסטית באסטרטגיות של דילוג על אקסונים (exon-skipping).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להערכת יעילות ורעילות in vitro ו-in vivo.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ולהקצאת הון עבור תוכניות של דילוג על מספר אקסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligonucleotide) עבור DMD ואינדיקציות קשורות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, טיפול בבעלי חיים ותכנון אוליגנוקלאוטידים אנטיסנס.
- דורש גישה ל-RT-PCR, אימונוציטוכמיה ותשתית ניתוחית לבעלי חיים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך מדידות יעילות ורעילות הניתנות לשחזור.
- התאמה למודלים גנטיים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור האקסונים המטרה ונתיבי ההחדרה.
- ניטור בריאותי קפדני ופיקוח אתי חיוניים למחקרים בבעלי חיים גדולים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts
2:59
Morpholino Transfection of Dog Myoblasts and RNA Extraction
5:18
Intramuscular Injections or Open Muscle Biopsy
6:42
Systemic Injections
7:39
Results: Multi-exon Skipping Using Antisense Oligonucleotides in the Dystrophin Gene in Dogs
9:37
Conclusion
