הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות מוח בריאות מחיות בוגרות המתאימות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים של מהדק טלאי. לכן שיטת התאוששות מגן NMDG אופטימלית זו להכנת פרוסות מוח מאפשרת לחוקרים לחקור את התכונות הפנימיות והסינפטיות של סוגי תאי מוח על פני אזורי מוח רבים ושונים ועבור בעלי חיים כמעט בכל גיל. אז היתרון העיקרי של הטכניקה הספציפית הזו הוא שהיא מאפשרת להכין פרוסות מוח בעלות רמה גבוהה יותר של שימור עצבי בהשוואה למתודולוגיות קודמות.

וגם שפרוסות המוח הללו מתאימות יותר להקלטת מהדק תיקון. שיטה זו עברה אופטימיזציה עבור רקמת מוח של עכברים בוגרים. ניתן להשתמש בו למגוון מינים אחרים, כולל רקמת מוח אנושית שנכרתה באופן נוירוכירורגי

כדי להתחיל בהליך זה, הגדר את תחנת החיתוך עם מכונת פורס הרקמות ומכשירים כירורגיים. חבר להב מזרק קרמי זירקוניום לזרוע הלהב באמצעות דבק דבק מהיר. לאחר מכן הכנס את מחזיק הדגימה ויישר את הקצה המוביל של הלהב לשפת מחזיק הדגימה.

השארת רווח זעיר כדי להבטיח שהלהב לא יגרד את המתכת. מלאו של 250 מיליליטר ב-200 מיליליטר של NMDG HEPES aCSF. ומצננים אותו מראש על קרח עם קרבוגנציה קבועה למשך יותר מ-10 דקות.

לאחר מכן הגדר את תא התאוששות פרוסות המוח הראשוני על ידי מילויו ב-150 מיליליטר של NMDG HEPES aCSF. והניחו את החדר באמבט מים בטמפרטורה של 32 עד 34 מעלות צלזיוס. כדי להגדיר תא החזקה של פרוסות מוח, מלאו את המיכל ב-450 מיליליטר של HEPES aCSF ותנו לו להתחמם לטמפרטורת החדר תחת קרבוגנציה מתמדת עד לשימוש.

לאחר מכן, הכינו אגרוז מותך להטמעת רקמות על ידי חיתוך גוש של 2% אגרוז ממנה שהוכנה בעבר באמצעות הקצה הפתוח של בקבוקון חרוטי של 50 מיליליטר. מכסים באופן רופף את הבקבוקון החרוטי ואז מחממים אותו במיקרוגל למשך 10 עד 30 שניות עד שהאגרוז מתחיל להימס. אין להתחמם יתר על המידה.

שופכים את האגרוז המותך לצינורות של 1.5 מיליליטר. שמרו על האגרוז במצב מותך באמצעות תרמו-מיקסר המוגדר ל-42 מעלות צלזיוס עם ניעור נמרץ. וודא בזהירות שהאגרוז המותך לא יתמצק בטרם עת.

קררו מראש את בלוק הקירור של האביזרים עבור הפורס על קרח בשלב זה. בהליך זה, בצע חתך בעור הראש כדי לחשוף את הכיפה. לאחר מכן, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את העור מעל הכיפה.

ולבצע חתכים קטנים לרוחב משני צידי בסיס הגחון הזנבי של הגולגולת. בצע חתכים רדודים נוספים החל מההיבט הגבי הזנבי של הגולגולת הנע בכיוון הרוסטרלי במעלה קו האמצע הגבי. הקפדה לא לפגוע במוח הבסיסי.

לאחר מכן, בצע חתך T סופי בניצב לקו האמצע בגובה נורות הריח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים בקצה העגול כדי לתפוס את הגולגולת החל מההיבט המדיאלי הרוסטרלי ולקלף לכיוון הכיוון הרוחבי הזנבי בצד אחד. חזור על הליך זה כדי שהצד השני ייסדק.

והסר את חצאי הגב של כובע הגולגולת כדי לחשוף את המוח. הוציאו בעדינות את המוח השלם לתוך הכוס של NMDG HEPES aCSF מקורר מראש. ומאפשרים למוח להתקרר באופן אחיד למשך כדקה.

כעת, השתמשו במרית גדולה כדי להעביר את המוח מהכוס אל צלחת הפטרי המכוסה בנייר פילטר. חתוך והרכיב את המוח לפי זווית החיתוך המועדפת ואזור העניין הרצוי במוח. עבוד במהירות כדי למנוע מחסור ממושך בחמצן במהלך הטיפול.

לאחר מכן, הדביקו את בלוק המוח למחזיק הדגימה באמצעות דבק דבק. החזר את החלק הפנימי של מחזיק הדגימה כדי למשוך את גוש המוח במלואו פנימה. לאחר מכן שפכו את האגרוז המותך ישירות לתוך המחזיק עד שגוש המוח מכוסה במלואו באגרוז.

לאחר מכן, מהדקים את בלוק הקירור של האביזר שהתקרר מראש סביב מחזיק הדגימה למשך עשר שניות עד שהאגרוז יתמצק. הכנס את מחזיק הדגימה לתוך השקע במכונת החיתוך וודא יישור תקין. לאחר מכן, מלאו את המאגר בשארית ה-NMDG HEPES aCSF המחומצן שנותר מקורר מראש מכוס ה-250 מיליליטר והנח את אבן הבועות במאגר למשך החיתוך, כדי להבטיח חמצון נאות.

לאחר מכן, כוונן את המיקרומטר כדי להתחיל לקדם את דגימת המוח המוטמעת באגרוז. הפעל את הפורס והתאם באופן אמפירי את מהירות ההתקדמות ותדירות התנודה לרמה הרצויה. המשיכו להתקדם ולחתוך את הרקמה במרווחים של 300 מיקרומטר עד שהאזור המעניין במוח נחתך במלואו.

הזמן הכולל להליך החיתוך צריך להיות פחות מ -15 דקות. להתאוששות ראשונית של NMDG. עם השלמת הליך החיתוך, אספו את כל הפרוסות באמצעות פיפטת מרעה מפלסטיק חתוכה והעבירו אותן לתא התאוששות של 34 מעלות צלזיוס מלא ב-150 מיליליטר של NMDG HEPES aCSF.

העיתוי של שלב ההתאוששות החריף של פרוסת המוח חשוב מאוד כדי להיות מסוגל למצוא איזון בין שימור מורפולוגי לבין התאוששות תפקודית של התכונות האלקטרופיזיולוגיות של כל נוירון. לאחר קביעת לוח הזמנים האופטימלי של ספייק אין נתרן, בהתאם לגיל העכבר, בצע את הליך ספייק אין נתרן שלב Y על ידי הוספת הנפחים המצוינים של תמיסת ספייק אין נתרן בזמנים שצוינו. הוסף את תמיסת הנתרן ישירות לארובת המבעבע של תא ההתאוששות הראשוני כדי להקל על ערבוב מהיר.

לוח הזמנים של עליית הנתרן שסופק עם מגוון טווחי גילאים שונים הוא נקודת התחלה ממש טובה. אבל יש לבצע אופטימיזציה ולנצל אותו לתכנון ניסיוני ספציפי משלך. לאחר מכן, העבירו את כל הפרוסות לתא האחיזה לטווח ארוך HEPES aCSF הנשמר בטמפרטורת החדר.

אפשר לפרוסות להתאושש למשך שעה נוספת בתא ההחזקה של HEPES לפני ניסויי הקלטת מהדק תיקון. מוצגות כאן תמונות IR DIC מייצגות שנרכשו מאזורי מוח מגוונים ופרוסות חדות מעכבר בן שלושה חודשים להערכת השימור המורפולוגי של נוירונים. התוצאות המוצגות כאן הן משימוש בשיטת חיתוך המגן NMDG הבקרה ללא שלב התאוששות מגן.

בעוד שהתוצאות הללו הן משיטת ההתאוששות המגן האופטימלית של NMDG. בסך הכל, שימור עצבי משופר נצפה עם שיטת ההתאוששות המגנה האופטימלית NMDG. שיטת ההתאוששות המגן האופטימלית של NMDG עם הליך עלייה הדרגתית בנתרן הושוותה לשיטת ההתאוששות המגן המקורית NMDG.

הזמן הממוצע להיווצרות אטם GigaOhm ורישום מהדק תיקון הצטמצם באופן דרמטי ומשמעותי כאשר יושם הליך עליית הנתרן ההדרגתית יחד עם שלב התאוששות המגן NMDG. שימור הנוירונים המשופר שהושג בשיטת פרוסת מוח זו מאפשר יישומים ניסיוניים מאתגרים, כולל אך לא רק אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי מרובה אלקטרודות כדי לחקור קישוריות סינפטית מקומית. כפי שמודגם כאן, שימוש בפרוסות מוח ניאו-קורטיקליות אנושיות בוגרות שמקורן בניתוחים נוירולוגיים.

מדענים צריכים להבין היטב מצפייה בסרטון זה כיצד ליישם את שיטת ההתאוששות המגן האופטימלית שלנו NMDG, כולל הליך הנתרן החדש שתיארנו, להכנת פרוסות מוח המתאימות להקלטות מהדק טלאי. לכן, לאחר שליטה בפרוטוקול זה, אמור להיות אפשרי להשלים את הליך פרוסת המוח בפחות משעה בכל יום. ואמור להניב פרוסות מוח איכותיות הניתנות לשחזור ויעבוד עבור בעלי חיים כמעט בכל גיל.

אז ההליך הזה, השיטה הזו יכולה לעזור להכין פרוסות מוח שמתאימות להתייחסות לשאלות על תפקוד המוח באמצעות טכניקות כמו אלקטרופיזיולוגיה, הדמיה אופטית חיה ואופטוגנטיקה, מבחני סחר בקולטנים וסוגים אחרים של מבחנים פונקציונליים לחקר התפקוד של סוגי תאי מוח. לכן הטכניקה הזו שימושית גם מכיוון שהיא תעזור לחוקרים להיות מסוגלים לחקור באופן תפקודי אזורי מוח שונים, כולל אזורי מוח שאינם ניתנים באופן מסורתי לרישום מהדק טלאי מבעלי חיים בוגרים בפרוסות מוח.