Name: הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו את שיטת השחזור המגן NMDG לאופטימיזציה של הכנת פרוסות מוח לניסויים באלקטרופיזיולוגיה. שיטה זו משפרת את שימור הנוירונים ומאפשרת מחקר בתאי עצב מבוגרים ממינים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מכון אלן למדעי המוח. המחברים רוצים להודות מכון אלן המייסדים, פול ג' אלן, אלן ג'ודי, של החזון שלהם, עידוד ותמיכה. אנו מודים גם צוות התמיכה הטכנית אלן מכון לביצוע טיפול בבעלי חיים, גידול ו genotyping.

המחברים אין לחשוף.

נה + ספייק-in משפר את היווצרות חותם ג'יגה אוהם, מלחציים תיקון הקלטה הצלחה הגירסה הראשונית של שיטת שחזור מגן NMDG תוכנן במיוחד עבור בוגרים ובעלי הזדקנות2,5. שכמה מהמקדימים ביקשו גם ליישם מתודולוגיה זו כדי לחתוך קטין החייתי במוח (כלומר, עכברים < בת 30 ימים). עם זאת, זה נרשמה כי בניגוד מצטיינים ואושרו מבחינה ויזואלית עצביים שימור באמצעות שיטת שחזור מגן NMDG בטווח הגיל הזה, היווצרות חותם ג'יגה אוהם יכול לעתים קרובות לעכב, שמוביל מלחציים תיקון כושל להקליט ניסיונות. אחת ההשערות היא כי קטיונים NMDG יותר בקלות לכוד בתוך פרוסות המוח ילדותי ביחס פרוסות המוח למבוגרים יכולים לעכב היווצרות ים; אולם, חותמות ג'יגה אוהם יכול ליצור בקלות בזמן פרוסות המוח לנוער הם שקועים לחלוטין NMDG כלנית חדד (נתונים לא מוצג), ובכך כמסמן את NMDG חנה המבר כשלעצמו הוא לא הפגיעה ג'יגה אוהם חותם היווצרות.
המעבר נמוך-גבוהה פתרון Na+ בסיום השלב הראשוני במוח פרוסה שחזור מהיר גורם נזק לממברנות עצביים, perturbs את תהליך היווצרות של החותם. זה אינטואיטיבי נתון כי המעבר נמוך-גבוהה Na+, הטמפרטורה הקרה-אל-חמה, העלאה דרמטית של Ca2 + מ ג2 + יחס להוביל באופן קולקטיבי תחייתו מסיבית של פעילות סינפטית ספונטנית. שלב זה ריבאונד מעכבות במוח עם פרוסות הליך סביר להניח מראה פגיעה פגיעה reperfusion לאחר עלבון איסכמי. לכן, בכדי להמתיק נזק הממברנה עצביים בשלב ההחלמה הראשונית ש-na+ הדרגתית ספייק-אין נוהל נכלל בהן העלאת ריכוז Na+ בחדר דגירה שחזור מגן NMDG הוא לאט לאט reproducibly מוגבה עם תזמון מדויק. ההליך לשחזור מגן המקורי, דיסוציאציה הטמפורלי של Na+ העלאה של טמפרטורה, Ca2 +/Mg2 + יחס גובה הוא מועיל. אבל בנוסף, ההליך ספייק ב- Na+ מוביל לעלייה מצטבר קטן ריכוז Na+ חוץ-תאית על נקודות זמן מוקדם ועל עליות גדולות לקראת נקודות זמן מאוחר, כך יכלו על רקמת המוח הזדמנות כדי להתאים טוב יותר את רמות Na+ העולה. ההליך זה שאלטרנטיבה לפתרון הדרגתי exchange נשלט על ידי משאבת זלוף או כוח המשיכה של קווי טפטוף אשר ולהוביל לעלייה מתמדת Na+ רמות ודורשים תשומת לב תזרים והן יצוא כדי למנוע הצפת החדר פרוסה. ראוי לציין, זה נה+ הליך ספייק-in osmolality הפתרון בבית הבליעה פרוסה בהדרגה עולה על פני תקופה של מספר דקות לפני הפרוסות מוחזרות לפתרון osmolality נורמלי, אך לא השפיעה לרעה על בריאות פרוסה או תיקון קלאמפ הקלטה הצלחה. פתרון חיתוך osmolality גבוהה כבר בעבר בשימוש על ההכנות פרוסה המוח האמצעי על מנת לשמר טוב יותר נוירונים דופאמין עבור תיקון קלאמפ הקלטות57,58, לפיכך הוכחת כי זה זמני hyperosmolality עשוי להיות מועיל בהקשרים מסוימים.
על-ידי הטמעת הליך בלתי אופטימליים המשלב את שיטת שחזור מגן NMDG ו- Na הדרגתי+ הוארך בספייק שלב השירות של מתודולוגיה זו פרוסה המוח לכסות לנוער במשך הדורות בוגרים בעלי חיים למבוגרים. פרוטוקול מעודכן זה מתאים עכשיו מגוון הגילאים בעלי חיים באמצעות יחיד אופטימלי NMDG חנה המבר גיבוש נוהל. במידת הצורך, ניתן להחיל על ההליך ספייק ב- Na+ עם עיכוב למחמיר יותר ו/או קורס איטי יותר זמן כדי לשפר את הכדאיות של המוח פרוסות מחיות בוגרים, אנו מגישים מדריך בסיסי של מומלצים ספייק-אין לוחות זמנים לפי לחיה גיל (ראה טבלה 2). בזמן שאנו מספקים מסגרת בסיסית מתאים עבור מגוון רחב של יישומים, ניתן לסייר שלבים מתקדמים נוספים לשיפור נוסף הכדאיות ואריכות ימיהם של המוח פרוסות מחיות למבוגרים ובטיפולים. לדוגמה, אסטרטגיות שחזור גלוטתיון יעילים במיוחד בהקשר זה, ניתן ליישם כמתואר2,6.
שיפור תפוקה מאתגרת ניסויים הניתוח של קישוריות סינפטית על ידי הקלטה מלחציים תיקון הוא יישום תובעני שדורש מעולה לשימור המבנה העצבית ותפקוד על מנת להשיג אמינות גבוהה של הצלחה. ככל שמספר נוירונים שיירשמו בו זמנית עולה באופן ליניארי, רמת הקושי הטכני עולה העל-לינארית. ישנם מצבי כשל רבים, אחד הגורמים בתדירות הגבוהה ביותר של כשלים הוא חוסר היכולת טופס חותמות ג'יגה אוהם נאותה על אחד או יותר של תאים יישוב. הדבר באופן דרמטי יכול להאט את התקדמות, במיוחד כאשר שלושה או יותר נוירונים חייב להיות מוקלט בו זמנית. תואם את הממצא יותר מהר ג'יגה אוהם חותם היווצרות הזמן עם שיטת אופטימיזציה של שחזור מגן NMDG, היה שיפור שיעור ההצלחה ואת התפוקה של נוירון רב תיקון קלאמפ הקלטה ניסויים עם שני מבוגרים מהונדס העכבר מוח ופרוסות למבוגרים מוח הנוירוכירורגית. יעילות משופרת היא קרוב לוודאי המיוחס היווצרות חותם ג'יגה אוהם יותר מהיר ואמין והן לשימור עצביים משופר הפרוסות עם פרוטוקול זה. למרות פרוטוקול זה מתמקד ביתרונות במפורש עבור תיקון קלאמפ הקלטה יישומים, הישגים דומים הם הצפוי ליישומים אחרים ניסיוני ומאתגר שבו המוח פרוסה הכדאיות הוא בעל חשיבות עליונה.

המוח חריפה פרוסה ההכנה היא מערכת חיוניים דגם ניסיוני במדעי המוח. בערך חצי מאה, פלטפורמה זו אפשרה דינמי מחקרים תפקודית של המוח החי על פני מגוון רחב של אזורים במוח האנטומי של מיני בעלי חיים. אם היישום המיועד הוא ביוכימיה, הדמיה תפקודית, מורפולוגיה או אלקטרופיזיולוגיה, זה חשיבות עליונה כדי להבטיח תקינות האופטימלי ואת הכדאיות של הרקמה הפרוס. זה מסיבה זו כי ההכנה פרוסה מדרגית המוח מכרסמים לנוער (קרי, צעיר יותר כמחנכת ליום 30 עכברים) כבר המועדף ביותר עד כה. הקושי בהשגת המוח מספיק בריא פרוסות של מבוגר בוגר, הזדקנות חיות הוכיחה להיות אתגר עצום עבור רוב מטילה מגבלות חמורות ללמוד אדריכלות תפקודית של המוח בוגרת. זה נכון במיוחד עבור תיקון קלאמפ הקלטה, טכניקה דורשת שימור פונקציונלי מורפולוגיים מעולה, היא הכרחית עבור אפיון מפורט ומאפייני מהותי סינפטית של נוירונים יחיד שזוהה. מספר עשורים, הרוב המכריע של תיקון קלאמפ electrophysiologists צריכים לסמוך על שיטת 'מגן חיתוך' באמצעות שהוחלפו סוכרוז נמוך Na+ חנה המבר1 להכנת פרוסות המוח בריא של ילדותי, רחוק במידות שונות במידה אפרוחי למבוגרים. שיטה זו מבוססת על ההנחה כי זרם Na+ פסיבי, הזנת מים הבאים ותא נפיחות במהלך השלב חיתוך פרוסה היא העלבון השולט שמוביל הישרדות המסכן של נוירונים, במיוחד עבור אלה נוירונים הממוקמת שכבות שטחיות שסביר לקיים טראומה ישירה מהתנועה להב. עם זאת, שיטת חיתוך מגן עדיין משאיר רחוק ממשביע להכנה פרוסה מוח מחיות למבוגרים בוגר ללא קשר ניסוח מסוים חנה המבר מיושמת.
פתרון פשוט אך יעיל לבעיה זו היה תיאר2,3,4,5,6 , כינה את השיטה פרוסה של המוח 'שחזור מגן'. הגירסה המקורית של שיטה זו משתמש של NMDG שהוחלפו כלנית חדד, כפי NMDG היה מזוהה ביותר תכליתי ויעיל בקרב שונים אחרים המועמד נתרן יון תחליפים (כולל סוכרוז, גליצרול, כולין, טריס). ניסוח מדיה היה משופרת נוספת על ידי תוספת של HEPES להתנגד המוח פרוסה בצקת ולספק pH חזק יותר באגירת7, וכן התוספת של תוספים כדי לנטרל את השפעות מזיקות של סטרס חמצוני (טבלה 1). מדעית נקבע כי דגירה ההחלמה הראשונית נה נמוך+, נמוך Ca2 +, ולקבל גבוהה מ ג2 + NMDG חנה המבר מיד לאחר בציעת רקמת המוח למבוגרים היה נחוץ וגם מספיק עבור שיפור עצביים שימור על טווח רחב של אזורים במוח, סוגי תאים בעלי חיים גילאי3,5,6.
ראוי לציין, גלגולים קודמות של מה עכשיו שכונתה שיטת שחזור מגן ניתן למצוא את הספרות1,8,9,10,11,12, 13, למרות הפוטנציאל המלא מבוגרים למבוגרים, הזדקנות החייתי במוח פרוסה, תיקון קלאמפ ההקלטה לא הייתה מוכרת או הפגינו בעבודות קודמות אלה. בנוסף, הניואנסים וריאציות פרוצדורלי ממשיכים להגיח לתמיכה יישומים ספציפיים ניסיוני4,14,15,16. הגוף הקולקטיבי של העבודה של קבוצות מחקר רבות אלה מקנה ביטחון מלא ב החוסן של פעולת שחזור מגן לשימור רקמות משופרת. שיטת שחזור מגן NMDG יש עכשיו כבר נרחב אימץ ויושמו תוך ניצול למבוגרים החייתי במוח פרוסה ההכנות מחקרים רבים של מחקר שפורסם. מחקרים אלה חריפה פרוסה span17,neocortical3,18, בהיפוקמפוס15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, המוח האמצעי25,26,27,28,29ו hindbrain30,31,32, 33 , 34 אזורים, ועוד מגוון של סוגי נוירוטרנסמיטר, המודל העצבי כולל4,glutamatergic30, GABAergic18,20,31,35 ,36, דופאמין24,29,37,38,37,שימוש14,38, 39, noradrenergic40, תכולה27,28 עצבית. השיטה מתאימה מאוד גם על השליטה optogenetic פעילות. עצבית פרוסות נגזר מ-3,חיות הטרנסגניים39 או בעקבות ויוו ויראלי זריקות17,27, 28,40,41,42,43, כמו גם פונקציונלית Ca2 + הדמיה של פעילות. עצבית2,44 45, ,46. ניתוחים של טווח קצר פלסטיות4,47,48 וגם צורות מגוונות של לטווח ארוך פלסטיות16,35,48 כבר דיווח. מחקר שנערך לאחרונה החלת שיטת שחזור מגן NMDG כדי להקל על נרחבת ושיטתית חיטוט של קישוריות סינפטית בקליפת הראיה פרוסות המוח בוגרת בעכבר למבוגרים באמצעות octopatch את ההקלטה תצורה49 – רב עוצמה הפגנה של השירות ואת החוסן של שיטה זו. שיטת שחזור מגן אפילו הוחל בהצלחה בהקשרים ניסיוני בעבר בלתי צפויות, כגון, שיפור שימור להערכת pericytes פרוסות המוח קורטיקלית למבוגרים50, מלחציים תיקון הקלטה מ מושתלים interneuron אוכלוסיות בעוד בן 1-1.5 שנה מחלת אלצהיימר העכבר דגמי20, של המוח למבוגרים פרוסה קולטן סחר assay51.
הפרוטוקול הבא מתאר הליכים מפורטים ליישום שיטת שחזור מגן NMDG אופטימיזציה של המוח פרוסה הכנה לשיפור הכדאיות של פרוסות המוח חריפה. העקרונות לשימור עצביים משופרת הנזכרים, כמו גם הדגמה של היתרונות ברורים של מתודולוגיה זו עבור תיקון נוירון רב מורכבים קלאמפ הקלטה ניסויים פרוסות המוח הצעיר העכבר הטרנסגניים למבוגרים והן למבוגר בוגר פרוסות המוח האנושי הנוירוכירורגית. פרוטוקול הבאים אומתה עבור עכברים מן בן 21 ימים בת אחד או יותר, כמו גם לגבי האדם דגימות נוירוכירורגיים נגזר חולים מבוגרים.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>פורס רקמות רוטט (מומלץ)</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF מרכיב</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF מרכיב</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF מרכיב</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בייסי דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71505</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5761</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H4034</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>נתרן אסקורבט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A4034</td><td>מרכיב</td></tr> <tr><td>aCSFThiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5280</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7902</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטאהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M1880</td><td>מרכיב aCSF</td></tr><tr><td>2,2,2-טריברומו-אתנול&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>רכיב הרדמה 1</td></tr><tr><td>2-מתיל-2-בוטנול&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>רכיב הרדמה 2</td></tr><tr><td>מלקחיים קהים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11065-07</td><td>כלי חיתוך מוח</td></tr><tr><td>מספריים לניתוח עדין (סופר-חתך)</td> <td>כלי מדע עדין</td><td>14058-09</td><td>כלי חיתוך מוח</td></tr><tr><td>מספריים גדולים וכבדים 7 אינץ'</td> <td>כלי מדע עדינים</td><td>14000-18</td><td>כלי חיתוך מוח</td></tr><tr><td>מרית מתכת</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>כלי נתיחת מוח</td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>כלי נתיחת מוח</td></tr><tr><td>שומר פרוסות מוח-4</td><td>אוטומציה מדעית</td><td>S-BSK4</td><td>פרוסת מוח תא החזקת</td></tr><tr><td>רשת ניילון&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>64-0198</td><td>לבניית תאי התאוששות פרוסות קטנים</td></tr><tr><td>כוסות זכוכית פיירקס (250 מ"ל)</td> <td>VWR</td><td>89090-434</td><td>לבניית תאי התאוששות פרוסות קטנים</td></tr><tr><td>צלחת פלסטיק 35 מ"מ, עגולה</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>לבניית תאי התאוששות פרוסות קטנים</td></tr><tr><td>אבני מפזר גז (10 ומיקרו; מ)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>59277</td><td>לקרבוגנציה מתמדת (בועות עדינות)</td></tr> <tr><td>אגרוז סוג I-B</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A0576</td><td>להטמעת דגימות מוח</td></tr><tr><td>טיפים למעמיס מיקרו</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>למילוי אלקטרודות מהדק תיקון</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>להכנת פלטפורמת ניתוח מותאמת אישית</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H1758-100ML</td><td>להתאמת pH של מדיה</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>להתאמת pH של מדיה</td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>להתאמת pH של מדיה</td></tr><tr><td>צינורות העברת פלסטיק 3 מ"ל בוגר</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>להעברת פרוסות</td></tr><tr><td>להבי מזרק קרמיקה זירקוניום</td><td>להבים מיוחדים</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 זכוכית בורוסיליקט נימי עם נימה</td><td>King Glass Company</td><td>הצעת מחיר מותאמת אישית</td><td>: 0.87 מ"מ, OD 1.50 מ"מ</td></tr><tr><td>ביוציטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B4261</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>פוספוקריאטין דיסודיום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P7936</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>אשלגן גלוקונאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G4500-100G</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E3889</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9187</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>51120</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389</td><td>תמיסת פיפטה מתמחה</td></tr><tr><td>אמבט מים מחומם (2.5 ליטר)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון אחר סיבובים</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td> שונות <td>אמזון</td><td>B000BQRBO6</td><td></td></tr><tr><td>שונות צלחת פטרי זכוכית</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>שונות</td></tr><tr><td>10X פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5493</td><td>שונות</td></tr><tr><td>30 מ"ל מזרקים</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>שונות</td></tr><tr><td>1 מ"ל</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>שונות</td></tr><tr><td>25 5/8 מחטים מד</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td></td></tr><tr><td>תרמו-מיקסר שונות (עם בלוק צינור 1.5 מ"ל)</td> <td>VWR</td><td>89232-908</td><td>כדי לשמור על אגרוז מותך&nbsp;</td></tr></tbody></table>

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה n-מתיל-d-שיטת שחזור מגן glucamine

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

פרוטוקול זה הוא מדריך מעשי N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. מחקרים אחרונים רבים יש לאמת את התועלת של שיטה זו לשיפור שימור עצביים, הכוללת הכדאיות פרוסה של המוח. היישום של טכניקה זו על ידי המוקדמים הנחתה מפורט חקירות תפקוד המוח באמצעות מגוון יישומים ניסיוני, על פני מגוון רחב של בעלי חיים הגילאים, אזורים במוח, ואת סוגי תאים. השלבים הבאים מתוארים שבצעתי שחזור מגן המוח פרוסה הטכניקה באמצעות אופטימיזציה NMDG נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) מדיה ניסוח וההליך משופרת כדי להשיג בצורה אמינה פרוסות המוח בריא עבור תיקון קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה. עם גישה מעודכנת זו, שיפור ניכר הוא ציין את המהירות, אמינות של ג'יגה אוהם לאטום היווצרות במהלך תיקון ממוקד קלאמפ הקלטה ניסויים תוך שמירה על שימור עצביים מעולה, ובכך להקל מאתגר יישומים ניסיוני. התוצאות נציג ניתנים מן המלחציים נוירון רב תיקון רישום ניסויים כדי assay קישוריות סינפטית פרוסות המוח neocortical שהוכנו העכברים הטרנסגניים למבוגרים צעירים, בוגרים מבוגרים דגימות נוירוכירורגיים אנושי. יתר על כן, שיטת שחזור מגן NMDG אופטימיזציה ששיספתי המוח הוא תואם עם חיות הן לנוער והן למבוגרים, ובכך לפתרון מגבלה של המתודולוגיה המקורי. לסיכום, ניתן ליישם על ניסוח מדיה בודד והמוח חותך הליך על פני מינים והגילאים השונים כדי להשיג מעולה לשימור הכדאיות ורקמות.

פרוטוקול זה מדגים יישום אופטימיזציה N-מתיל-D-glucamine (NMDG) שיטת שחזור מגן המוח פרוסה ההכנה. ניסוח מדיה בודד משמש להשיג באופן אמין פרוסות המוח בריא של בעלי חיים בכל גיל, וגם עבור יישומים שונים ומגוונים ניסיוני.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות מוח בריאות מחיות בוגרות המתאימות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים של מהדק טלאי. לכן שיטת התאוששות מגן NMDG אופטימלית זו להכנת פרוסות מוח מאפשרת לחוקרים לחקור את התכונות הפנימיות והסינפטיות של סוגי תאי מוח על פני אזורי מוח רבים ושונים ועבור בעלי חיים כמעט בכל גיל. אז היתרון העיקרי של הטכניקה הספציפית הזו הוא שהיא מאפשרת להכין פרוסות מוח בעלות רמה גבוהה יותר של שימור עצבי בהשוואה למתודולוגיות קודמות.וגם שפרוסות המוח הללו מתאימות יותר להקלטת מהדק תיקון. שיטה זו עברה אופטימיזציה עבור רקמת מוח של עכברים בוגרים. ניתן להשתמש בו למגוון מינים אחרים, כולל רקמת מוח אנושית שנכרתה באופן נוירוכירורגיכדי להתחיל בהליך זה, הגדר את תחנת החיתוך עם מכונת פורס הרקמות ומכשירים כירורגיים. חבר להב מזרק קרמי זירקוניום לזרוע הלהב באמצעות דבק דבק מהיר. לאחר מכן הכנס את מחזיק הדגימה ויישר את הקצה המוביל של הלהב לשפת מחזיק הדגימה.השארת רווח זעיר כדי להבטיח שהלהב לא יגרד את המתכת. מלאו של 250 מיליליטר ב-200 מיליליטר של NMDG HEPES aCSF. ומצננים אותו מראש על קרח עם קרבוגנציה קבועה למשך יותר מ-10 דקות.לאחר מכן הגדר את תא התאוששות פרוסות המוח הראשוני על ידי מילויו ב-150 מיליליטר של NMDG HEPES aCSF. והניחו את החדר באמבט מים בטמפרטורה של 32 עד 34 מעלות צלזיוס. כדי להגדיר תא החזקה של פרוסות מוח, מלאו את המיכל ב-450 מיליליטר של HEPES aCSF ותנו לו להתחמם לטמפרטורת החדר תחת קרבוגנציה מתמדת עד לשימוש.לאחר מכן, הכינו אגרוז מותך להטמעת רקמות על ידי חיתוך גוש של 2% אגרוז ממנה שהוכנה בעבר באמצעות הקצה הפתוח של בקבוקון חרוטי של 50 מיליליטר. מכסים באופן רופף את הבקבוקון החרוטי ואז מחממים אותו במיקרוגל למשך 10 עד 30 שניות עד שהאגרוז מתחיל להימס. אין להתחמם יתר על המידה.שופכים את האגרוז המותך לצינורות של 1.5 מיליליטר. שמרו על האגרוז במצב מותך באמצעות תרמו-מיקסר המוגדר ל-42 מעלות צלזיוס עם ניעור נמרץ. וודא בזהירות שהאגרוז המותך לא יתמצק בטרם עת.קררו מראש את בלוק הקירור של האביזרים עבור הפורס על קרח בשלב זה. בהליך זה, בצע חתך בעור הראש כדי לחשוף את הכיפה. לאחר מכן, השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את העור מעל הכיפה.ולבצע חתכים קטנים לרוחב משני צידי בסיס הגחון הזנבי של הגולגולת. בצע חתכים רדודים נוספים החל מההיבט הגבי הזנבי של הגולגולת הנע בכיוון הרוסטרלי במעלה קו האמצע הגבי. הקפדה לא לפגוע במוח הבסיסי.לאחר מכן, בצע חתך T סופי בניצב לקו האמצע בגובה נורות הריח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים בקצה העגול כדי לתפוס את הגולגולת החל מההיבט המדיאלי הרוסטרלי ולקלף לכיוון הכיוון הרוחבי הזנבי בצד אחד. חזור על הליך זה כדי שהצד השני ייסדק.והסר את חצאי הגב של כובע הגולגולת כדי לחשוף את המוח. הוציאו בעדינות את המוח השלם לתוך הכוס של NMDG HEPES aCSF מקורר מראש. ומאפשרים למוח להתקרר באופן אחיד למשך כדקה.כעת, השתמשו במרית גדולה כדי להעביר את המוח מהכוס אל צלחת הפטרי המכוסה בנייר פילטר. חתוך והרכיב את המוח לפי זווית החיתוך המועדפת ואזור העניין הרצוי במוח. עבוד במהירות כדי למנוע מחסור ממושך בחמצן במהלך הטיפול.לאחר מכן, הדביקו את בלוק המוח למחזיק הדגימה באמצעות דבק דבק. החזר את החלק הפנימי של מחזיק הדגימה כדי למשוך את גוש המוח במלואו פנימה. לאחר מכן שפכו את האגרוז המותך ישירות לתוך המחזיק עד שגוש המוח מכוסה במלואו באגרוז.לאחר מכן, מהדקים את בלוק הקירור של האביזר שהתקרר מראש סביב מחזיק הדגימה למשך עשר שניות עד שהאגרוז יתמצק. הכנס את מחזיק הדגימה לתוך השקע במכונת החיתוך וודא יישור תקין. לאחר מכן, מלאו את המאגר בשארית ה-NMDG HEPES aCSF המחומצן שנותר מקורר מראש מכוס ה-250 מיליליטר והנח את אבן הבועות במאגר למשך החיתוך, כדי להבטיח חמצון נאות.לאחר מכן, כוונן את המיקרומטר כדי להתחיל לקדם את דגימת המוח המוטמעת באגרוז. הפעל את הפורס והתאם באופן אמפירי את מהירות ההתקדמות ותדירות התנודה לרמה הרצויה. המשיכו להתקדם ולחתוך את הרקמה במרווחים של 300 מיקרומטר עד שהאזור המעניין במוח נחתך במלואו.הזמן הכולל להליך החיתוך צריך להיות פחות מ -15 דקות. להתאוששות ראשונית של NMDG. עם השלמת הליך החיתוך, אספו את כל הפרוסות באמצעות פיפטת מרעה מפלסטיק חתוכה והעבירו אותן לתא התאוששות של 34 מעלות צלזיוס מלא ב-150 מיליליטר של NMDG HEPES aCSF.העיתוי של שלב ההתאוששות החריף של פרוסת המוח חשוב מאוד כדי להיות מסוגל למצוא איזון בין שימור מורפולוגי לבין התאוששות תפקודית של התכונות האלקטרופיזיולוגיות של כל נוירון. לאחר קביעת לוח הזמנים האופטימלי של ספייק אין נתרן, בהתאם לגיל העכבר, בצע את הליך ספייק אין נתרן שלב Y על ידי הוספת הנפחים המצוינים של תמיסת ספייק אין נתרן בזמנים שצוינו. הוסף את תמיסת הנתרן ישירות לארובת המבעבע של תא ההתאוששות הראשוני כדי להקל על ערבוב מהיר.לוח הזמנים של עליית הנתרן שסופק עם מגוון טווחי גילאים שונים הוא נקודת התחלה ממש טובה. אבל יש לבצע אופטימיזציה ולנצל אותו לתכנון ניסיוני ספציפי משלך. לאחר מכן, העבירו את כל הפרוסות לתא האחיזה לטווח ארוך HEPES aCSF הנשמר בטמפרטורת החדר.אפשר לפרוסות להתאושש למשך שעה נוספת בתא ההחזקה של HEPES לפני ניסויי הקלטת מהדק תיקון. מוצגות כאן תמונות IR DIC מייצגות שנרכשו מאזורי מוח מגוונים ופרוסות חדות מעכבר בן שלושה חודשים להערכת השימור המורפולוגי של נוירונים. התוצאות המוצגות כאן הן משימוש בשיטת חיתוך המגן NMDG הבקרה ללא שלב התאוששות מגן.בעוד שהתוצאות הללו הן משיטת ההתאוששות המגן האופטימלית של NMDG. בסך הכל, שימור עצבי משופר נצפה עם שיטת ההתאוששות המגנה האופטימלית NMDG. שיטת ההתאוששות המגן האופטימלית של NMDG עם הליך עלייה הדרגתית בנתרן הושוותה לשיטת ההתאוששות המגן המקורית NMDG.הזמן הממוצע להיווצרות אטם GigaOhm ורישום מהדק תיקון הצטמצם באופן דרמטי ומשמעותי כאשר יושם הליך עליית הנתרן ההדרגתית יחד עם שלב התאוששות המגן NMDG. שימור הנוירונים המשופר שהושג בשיטת פרוסת מוח זו מאפשר יישומים ניסיוניים מאתגרים, כולל אך לא רק אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי מרובה אלקטרודות כדי לחקור קישוריות סינפטית מקומית. כפי שמודגם כאן, שימוש בפרוסות מוח ניאו-קורטיקליות אנושיות בוגרות שמקורן בניתוחים נוירולוגיים.מדענים צריכים להבין היטב מצפייה בסרטון זה כיצד ליישם את שיטת ההתאוששות המגן האופטימלית שלנו NMDG, כולל הליך הנתרן החדש שתיארנו, להכנת פרוסות מוח המתאימות להקלטות מהדק טלאי. לכן, לאחר שליטה בפרוטוקול זה, אמור להיות אפשרי להשלים את הליך פרוסת המוח בפחות משעה בכל יום. ואמור להניב פרוסות מוח איכותיות הניתנות לשחזור ויעבוד עבור בעלי חיים כמעט בכל גיל.אז ההליך הזה, השיטה הזו יכולה לעזור להכין פרוסות מוח שמתאימות להתייחסות לשאלות על תפקוד המוח באמצעות טכניקות כמו אלקטרופיזיולוגיה, הדמיה אופטית חיה ואופטוגנטיקה, מבחני סחר בקולטנים וסוגים אחרים של מבחנים פונקציונליים לחקר התפקוד של סוגי תאי מוח. לכן הטכניקה הזו שימושית גם מכיוון שהיא תעזור לחוקרים להיות מסוגלים לחקור באופן תפקודי אזורי מוח שונים, כולל אזורי מוח שאינם ניתנים באופן מסורתי לרישום מהדק טלאי מבעלי חיים בוגרים בפרוסות מוח.

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון וידאו זה מתאר פרוטוקול להשגת פרוסות מוח באמצעות שיטת התאוששות הגנה מבוססת N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG). מוח מנותח מודגר ב-aCSF עם NMDG ו-HEPES כדי למזער מוות ונזק של תאים עצביים במהלך החיתוך. הקטע רשאי להתאושש ב- aCSF כדי לשחזר את הפעילות...

הכנת מקטעי מוח בשיטת התאוששות הגנה מבוססת NMDG

אנו מתארים שתי שיטות להדמיה וכימות של ארבוריזציה דנדריטית בהיפוקמפוס של מודלים של עכברים: הדמיה בזמן אמת ועומק שדה מורחב. בעוד שהשיטה הראשונה מאפשרת מעקב טופוגרפי מתוחכם וכימות של היקף ההסתעפות, השנייה מאפשרת הדמיה מהירה של העץ הדנדריטי.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את הייצוב של רמת החמצן נפח קטן של מאגר ממוחזר, היבטים מתודולוגיים של הקלטה פלסטיות סינפטית תלויי-פעילות המשוקע פרוסות בהיפוקמפוס חריפה.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח, להגיב במהירות עם שינויים מורפולוגיים שינויים של סביבתם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש מיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לחקור את המשיכה של תהליכים microglial לכיוון סרוטונין או ATP פרוסות המוח חריפה של עכברים.

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקת פרצוף בלוק סדרתית (SBEM) מוחלת על תמונה ולנתח קוצים דנדריטיים בהיפוקמפוס המורין.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

מחקר זה מציג פרוטוקול לביסוס מודל בעלי חיים בעל יכולת שחזור גבוהה של טרנספורמציה דימומית (HT) באמצעות חסימה/רפרפוזיה של עורק המוח האמצעי (MCAO/R) בעכברי C57BL/6 עם היפרגליקמיה חריפה.

מודל עכבר של טרנספורמציה דימומית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה חריפה בשילוב עם איסכמיה מוקדית חולפת

למדו את שיטת השחזור המגן NMDG לאופטימיזציה של הכנת פרוסות מוח לניסויים באלקטרופיזיולוגיה. שיטה זו משפרת את שימור הנוירונים ומאפשרת מחקר בתאי עצב מבוגרים ממינים שונים.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

גלה סרטונים נוספים