Name: Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: למד מיקרוכירורגיה לייזרית לבידוד תאי צמחים ספציפיים כגון תאי ביצה ב-Boechera. שיטה זו מייצרת RNA באיכות גבוהה לניתוח תעתיקי ומסייעת בחקר הבסיס הגנטי של רבייה מינית ואל-מינית בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לטימותי פ. שרבל (IPK Gatersleben) על אספקת זרעי Boechera divaricarpa ולשרון קסלר (אוניברסיטת אוקלהומה) על קריאה ביקורתית והגהה. העבודה על ניתוחי טרנסקריפטום ספציפיים לסוג התא לחקר התפתחות גמטופיטים ואפומיקס במעבדה של UG נתמכת על ידי אוניברסיטת ציריך, על ידי מלגה של "Deutsche Forschungsgemeinschaft" ופרויקט מארי קירי IDEAGENA ל-AS, על ידי מענקים מ-"Staatssekretariat für Bildung und Forschung" במסגרת COST action FA0903 (ל-UG ו-AS) והקרן הלאומית השוויצרית (ל-UG).

<ol><li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaheshwari%2C+P+%22An+Introduction+to+the+Embryology+of+Angiosperms%22">An Introduction to the Embryology of Angiosperms</a>. , McGraw-Hill. New York. (1950).</li>
<li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillemse%2C+MTM+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).</li>
<li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis%3A+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li>
<li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomixis+-+the+asexual+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li>
<li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+future+for+apomixis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle%2C+transcriptional%2C+hormonal+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+GENET%22%5BJournal%5D)">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476(2014).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li>
<li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li>
<li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li>
<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
<li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685(2012).</li>
<li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li>
<li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li>
<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול הוא מתאים תאים שונים וסוגי רקמות LAM בשילוב עם transcriptome מנתח ידי microarrays או RNA-seq היא כלי רב ערך כדי לקבל תובנות לתוך דפוסים מסוימים של פעילות גנים ויסות תהליכים התפתחותיים או פיזיולוגיים 7-11,13,14. עם זאת, את התאמתו של שיטה זו עבור כל סוג תא נתון תלויה באופן מכריע בעיות מבניות. התא צריך להיות ברור לעין וקלה לזיהוי חד משמעי בסעיפים היבשים המשמשים LAM. בשנת Boe...

במחקרי תעתיק נעשו ברמת הרקמה, transcriptomes של סוגי תאים מיוחדים אבל נדירים מאוד לעתים קרובות הם רעול פנים על ידי התאים שמסביב שופעים יותר. דוגמא עבור תאים מסוגים אלה מאוד מיוחדים הם התאים של שושלת הרבייה הנשית (germline) בצמחים. Germline הנקבה המצוין בתוך ביציות מתפתחות, המבשרים של זרעים בתוך gynoecium של 1,2 הפרח. תא אמא megaspore (MMC) הוא התא הראשון של germline הנשי. זה עובר המיוזה לגבש הטטרדה של megaspores מופחת. בדרך כלל, רק אחד megaspores אלה שורד ומחלק mitotically ללא cytokinesis, כלומר, בתוך syncytium. mitoses אלה ואחריו cellularization כדי ליצור את גמטופיט הבוגרת, אשר בדרך כלל מורכב מארבעה סוגי תאים: שלושה antipodals, שני תאים synergid, ביצה, והתא המרכזי. תאי הביצה ומרכזיים הם הגמטות נקבה כי לקבל מופרת על ידי שני תאי זרע במהלך douהפריה ble כדי להצמיח את העובר ואת האנדוספרם של 1,2 הזרע המתפתח. ב thaliana ארבידופסיס מערכת מודל המיני, רק ~ 50 זרעים לפתח לכל פרח בעוד כ -50 - 80 זרעים לפתח לכל פרח הסוג הקשור קשר ההדוק Boechera. לפיכך, germline הנשי מורכב רק כמה מאוד סוגי תאים מיוחדים, מה שהופך אותו מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים, כגון תא מפרט והבחנה. יתר על כן, תובנה התהליכים רגולטוריים גן מסדירי רביית צמח יכולות להיות בעל ערך שימושי. בצמחים, הוא רבייה מינית מינית באמצעות זרעים (apomixis) יכולה להתרחש. בעוד רבייה מינית מייצר מגוון גנטי באוכלוסייה, apomixis מוביל להיווצרות של צאצא משובט זהה גנטי לצמח האם. לכן, apomixis יש פוטנציאל גדול עבור יישומי חקלאות וייצור זרע, כמו גנוטיפים אימהי מורכב אפילו יכוללהישמר ללא שינוי במשך כמה דורות 3,4,5. בגלל apomixis אינו מתרחש באופן טבעי בכל מיני יבול עיקריים, ההנדסה של apomixis בגידולים הוא של 3,4,5 עניין רב. עם זאת, המטרה ארוך הטווח הזה קשה להשיג כי הבסיס הגנטי ואת המולקולריים שבבסיס של apomixis אינו מובן בפירוט מספיק 6. כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס תעתיק המסדירים רבייה apomictic, פרופיל תעתיק סוג תא ספציפי באמצעות microdissection לייזר בסיוע (LAM) וסדר הדור הבא (NGS) מייצג גישה מאוד חזק 7,8. LAM הוקם הראשון עבור בעלי חיים המחקר הביו-רפואי. בשנים האחרונות LAM גם יושם לביולוגיה צמח 6,9,10. בניגוד לשיטות אחרות המאפשרות אפיון של סוגי תאים ורקמות פרט, LAM אינו מחייב את הדור של קווי סמן 6,9,10. לכן, זה יכול להיות אפליקציהשייקר סוג תא או רקמה שהיא ללא ידע מולקולרי מוקדם. יתרון נוסף של LAM הוא שזה יכול להיות מיושם על כל סוג תא כל עוד התא ניתן להכיר בסעיפים יבשים על בסיס מיקום ו / או תכונות מבניות. יש LAM יתרון הנוסף רקמות קבועות משמשות, אשר מונע שינויים של פרופיל התעתיק במהלך עיבוד. הרקמה של עניין, למשל, רקמת פרחים, הוא קבוע מקבע הלא crosslinking לפני הטבעה ב פרפין. שיבוץ שעוות פרפין ניתן לעשות זאת באופן ידני, לאחר פרוטוקולים הוקמו 9,11. עם זאת, השימוש של מעבד רקמות אוטומטי התייבשות וחדירה עם השעווה בדרך כלל תוצאות שחזור גבוה במונחים של שימור איכות RNA ומורפולוגיה רקמות. האסטרטגיה החלופית הטבעת רקמות שרף גם שמשה בהצלחה עבור ניתוחי סוג תא ספציפי על ידי LAM 8. עם זאת, השימוש של automמעבד רקמות ated מוטבע שעווה מאוד זמן יעיל, כפי שניתן לעבד דגימות רבות בבת אחת המחייב מינימום של הידיים על הזמן. בעוד בדרך כלל ללא אובדן משמעותי של איכות RNA מתרחש במהלך קיבעון והטבעה, הכנת חלקים דקים עם microtome ו, בפרט, גוברת על frameslides המשמש LAM נשארה צעד קריטי לשמירה על איכות RNA. זה כבר ציין בעבר ושימוש מערכת העברת קלטת תואר לגרום איכות RNA טובה יותר בשלב זה 12. עם זאת, זה מוסיף נדבך נוסף גוזל זמן במהלך תקופת ההכנה של השקופיות וגם דורש ציוד מיוחד. פרוטוקול אופטימיזציה המתואר להלן reproducibly מייצרת RNA כי הוא באיכות מספקת עבור פרופיל תעתיק עם GeneCHIPs ואת הדור הבא הרצף (NGS) מתקרב 7,11,13,14. בנוסף, עם מיקרוסקופ microdissection הליזר המשמש, טוהר גבוה של סוגי התאים המבודדים היא תבוסהinely מיוצר 7,11,13,14. סוג Boechera היא מערכת מודל מצוינת לחקר השלבים העיקריים של רביית apomictic. בשנת Boechera, מגוון של הצטרפויות מיניות apomictic שונים זוהה וניתן להשתמש בו עבור השוואתי מנתח 15,16,17. בהשוואת transcriptomes סוג תא ספציפי של תאים מן germline נקבה מן ארבידופסיס מינית apomictic Boechera, זיהינו גנים ושבילים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, ובכך לזהות היבטים חדשים של תהליכים רגולטוריים המסדירים apomixis 7. בנוסף, מחקר זה אימת את התאמתו של LAM עבור תעתיק סוג תא ספציפי מנתח של סוגי תאים קטנים ונדירים. אנחנו כבר השתמשנו בפרוטוקול זה לניתוח של תאים מסוגים שונים במגוון של מיני צמחים, אבל מינים ושינויים ספציפי רקמות לפרוטוקול עשויים להידרש במקרים מסוימים.

<table><tbody><tr><td>אתנול</td><td>VWR</td><td>1,009,861,000</td><td>מוחלט EMPROVE Ph Eur, BP, USP</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה בז</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>אמביון טכנולוגיות חיים ללא נוקלאז</td><td></td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr>מעבד רקמות <td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>ניתן לרכוש <td>קרטון</td><td></td><td></td> שחור <td>בחנויות נייר מיוחדות</td></tr><tr><td>שקופיות מסגרת ללא DNA ו-RNAse</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 ומיקרו; m קרום PET; ניתן לרכוש גם מ- Leica</td></tr><tr><td>Dumond Occips</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr> Exsiccator <tr><td>מנורת</td><td></td><td></td><td></td>אתנול</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator או ציוד דומה</td></tr><tr><td>טיפים לסינון 10&nbsp; ומיקרו; l</td><td>ניתן להחליף את Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>בטיפים דומים</td></tr><tr><td>טיפים מסננים 1,000&nbsp; ומיקרו; l</td> ניתן להחליף את <td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>בטיפים דומים</td></tr><tr><td>טיפים מסננים 20&nbsp; ומיקרו; l</td> ניתן להחליף את <td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>בטיפים דומים</td></tr><tr><td>טיפים מסננים 200&nbsp; ומיקרו; l</td> ניתן להחליף את <td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>בקצוות דומים</td></tr><tr><td>מלקחיים דיוק</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק שקופיות זכוכית</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml; rbek&auml; sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>שוקת צביעת זכוכית</td><td>Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml; rbekasten</td></tr><tr><td>מודול הטמעת פרפין מחומם Leica</td><td></td><td>Leica Leica EG 1150</td><td>H תחנת חסימה, מכשירים דומים מתאימים</td></tr><tr><td>שולחן חימום וייבוש</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>דגמים ו/או ספקים אחרים מתאימים</td></tr><tr><td>דלי קרח</td><td>VWR דלי קרח עם מכסה&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>דליים דומים מתאימים באותה מידה</td></tr><tr><td>שולחן אור</td><td>UVP חברת ג'נה אנליטית</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>טרנס-אור לבן</td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>קצוות חתוכים</td></tr><tr><td>להב מיקרוטום</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 להב מיקרוטום חד פעמי</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus מכשיר</td><td>MMI (מכונות ותעשיות מולקולריות)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>נון-סטיק, צינורות מיקרופוגה ללא RNAse, 2 מ"ל</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>להיסטולוגיה</td></tr><tr><td>PicoPure RNA בידוד ערכת</td><td>חיים טכנולוגיות חיים</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA בידוד ערכת</td></tr> פלסטיק <tr><td>איזון מגשי Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק קופסא</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>פלסטיק מכסה לחימום צלחת</td><td></td><td></td><td>תוצרת בית</td></tr><tr><td>מחט הכנה</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה ללא RNAse</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP פתרון טיהור</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום סיבובי חצי אוטומטי&nbsp;</td>מכשירים דומים של <td>Leica</td><td>RM2245</td><td>מתאימים באותה מידה</td></tr><tr><td>קלטות מסך Tissue Loc Histo</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>קלטות דומות של ספקים אחרים מתאימות</td></tr><tr><td>צינורות עם מכסה דבק, ללא מפזר 500 ומיקרו; l&nbsp;</td><td>MMI (מכונות ותעשיות מולקולריות)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>קסילול (איזומר) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>דקות 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>תהליך הטמעת קלטות</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I ללא מכסה</td></tr><tr><td>תנור אוניברסלי</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>דגמים ו/או ספקים אחרים מתאימים</td></tr></tbody></table>

microdissection לייזר בסיוע (lam) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

הבנת תהליכי התפתחות ברמה המולקולרית דורשת תובנות לגבי ויסות השעתוק, ובכך הטרנסקריפטום, ברמה של סוגי תאים בודדים. בעוד שהשיטות המתוארות כאן ישימות בדרך כלל למגוון רחב של מינים וסוגי תאים, המחקר שלנו מתמקד ברבייה של צמחים. לגידול צמחים וייצור זרעים יש חשיבות מכרעת לתזונת בני אדם ובעלי חיים. הבנה מפורטת של רשתות הרגולציה השולטות בהיווצרות שושלת הרבייה (קו הנבט) ובסופו של דבר של זרעים היא תנאי מוקדם למניפולציה ממוקדת של רביית צמחים. בפרט, הנדסת אפומיקסיס (רבייה א-מינית באמצעות זרעים) לצמחי יבול מבטיחה שיפורים גדולים, מכיוון שהיא מובילה להיווצרות זרעים משובטים זהים גנטית לצמח האם. כתוצאה מכך, לסוגי התאים של קו הנבט הנקבי יש חשיבות רבה להבנה והנדסה של אפומיקסיס. עם זאת, מכיוון שהתאים המתאימים מוטמעים עמוק בתוך רקמות הפרחים, קשה מאוד לגשת אליהם לניתוחים ניסיוניים, כולל טרנסקריפטומיקה ספציפית לסוג התא. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן לבודד חלקים של תאים בודדים על ידי מיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר (LAM). בעוד ש-LAM בשילוב עם פרופיל שעתוק מאפשר זיהוי של גנים ומסלולים הפעילים בכל סוג תא עם ספציפיות גבוהה, קביעת פרוטוקול מתאים יכולה להיות מאתגרת. באופן ספציפי, איכות ה-RNA המתקבלת לאחר LAM עלולה להיפגע, במיוחד כאשר תאים קטנים ובודדים ממוקדים. כדי לעקוף בעיה זו, הקמנו זרימת עבודה עבור LAM שמביאה באופן שחזורי לאיכות RNA גבוהה המתאימה היטב לטרנסקריפטומיקה, כפי שמודגם כאן על ידי בידוד תאים של קו הנבט הנקבי בבוצ'רה אפומיקטית. בפרוטוקול זה מתוארים נהלים להכנת רקמות ו-LAM, גם ביחס למיצוי RNA ובקרת איכות.

הכנת המדגם LAM נעשים צעדים עוקבים מספר צעדים רצופים נדרשים להכין RNA לניתוח תעתיק סוגי תאים שנבחרו על ידי LAM (איור 1). זה מתחיל עם הקציר של פרחי קיבעון מיידי על מנת להבטיח כי אוכלוסיית RNA נותרת ללא שינוי לאחר קציר. הרקמה מוטבעת, מחולק, רכובה על שקופיות. זה מאפשר הבידוד של התאים על ידי LAM ואת איגום סעיפי סוג תא ס...

כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר של סוגי תאי צמחים ספציפיים לפרופיל שעתוק. בעוד שהפרוטוקול מתאים למינים וסוגי תאים שונים, ההתמקדות היא בתאים בלתי נגישים מאוד של קו הנבט הנקבי החשובים לרבייה מינית ואפומית בסוג המצליבים Boechera.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה עבור LAM היא לבודד תאי צמח ספציפיים לצורך הפקת RNA באיכות גבוהה עבור אנליזה תעתוקית. הדגש הוא על תאים שגישם מוגבל, כגון תאי ביצית, במיני boechera מיניים ואפומיקטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הגנטיקה ההתפתחותית של צמחים, כגון הבסיס התעתוקי העומד בבסיס רביית צמחים מינית ואסימפטומטית באמצעות זרעים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע סגנונות ספציפיים מסוימים. היא מאפשרת להתגבר על אפקט המיסוך של שעתוקים של סוגי תאים נדירים בניתוח של רקמות אתרוגנזה. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בתחנת החסימה למילוי מגש איזון פלסטי טרי שחומם מראש בשעווה פראפינית מותכת בטמפרטורה של 56 °C.הרימו את מכסה אמבט הפרפין והוציאו קסאט אחד בכל פעם. העבירו דגימה לשעוות פרפין נוזלית בטמפרטורה של 56 °C במגש איזון. פעלו במהירות כדי למנוע התקשות של השעווה מסביב לדגימה בזמן טיפול בקסאט.לאחר מכן, מקמו את הדגימה בהתאם לתכנון הניסויי באמצעות מחט הכנה. חזרו על הפעולה עד להעברת כל הדגימות. להכנת חתכים דקים עבור LAM, הסירו את שעוות הפרפין מהדגימה שבתבנית הפלסטיק באמצעות שולחן תאורה.חטבו מחויץ שעווה המכיל את הדגימה, כגון ניצן או פרח, באמצעות להב תער נקי מ-RNase. לאחר מכן, המיכו טיפה קטנה של שעוות פרפין על קצה שפכטל. השתמשו בשעווה החמה כדי לקבע את החויץ עם הדגימה המוטמעת על התמיכה.הסר את השעווה העודפת המקיפה את הדגימה באמצעות להב תער, וודא כי לבלוק יש פני שטח מרובעים עם קצוות מקבילים. לאחר מכן, הגדר את פלטת החימום ל-42 °C. חבר את הדגימה למיקרוטום באופן בטוח.הכינו חתכים בעובי שבעה מיקרומטר עבור התאים של הגמטופיט הבוגר של boechera. לאחר מכן, העבירו את סרטי הפרפין, שאורכם 10 עד 15 סנטימטר, לקופסת פלסטיק עם קרטון שחור בתחתית לפני הצבתם על נגבי ה-LAM. כדי להכין את הנגבים עבור LAM, הניחו חמישה עד עשרה נגבים בעלי מסגרת מתכת על לוח החימום כאשר המשטחים השטוחים פונים כלפי מעלה.טפטפו מיליליטר אחד עד שניים של מים נקיים מ-RNase על החלק הפלסטי של השקופיות. בעזרת להב תער, חתכו את סרטי הפראפין לחתיכות קצרות של כארבעה עד חמישה סנטימטרים, באורך המספיק כדי לכסות את החלונות הפלסטיים של השקופיות.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה ובמחט הכנה כדי להניח את רצועות הפרפין במקביל זו לזו על החלון הפלסטי של השקופיות. הרימו בזהירות את השקופיות מקצה אחד כדי להסיר את המים והניחו אותן בחזרה. כסו את לוח החימום במכסה פלסטיק מבלי לגעת בשקופיות, וודאו שהמכסה הפלסטיק מאפשר חילופי אוויר.ייבשו את השקופיות בטמפרטורה של 42 °C למשך הלילה. תחת מנדף כימי, בצעו הסרת שעווה (de-wax) מהשקופיות ב-xylol פעמיים, למשך 10 דקות בכל פעם. ודאו שאתם מטביעים רק את החלק הפלסטי של השקופיות ושומרים על הקצה הרחב של מסגרת המתכת של כל שקופית יבש כדי לאפשר את הוצאתן.השאירו את השקופיות להתייבש במשך 10 דקות במנדף הכימיים לפני ביצוע ה-LAM. בהליך זה, הדליקו את המחשב ואת המיקרוסקופ לצורך ה-LAM. לאחר מכן, הפעילו את התוכנה השולטת במיקרוסקופ ובלייזר.הפעילו את קופסת הבקרה של הלייזר והדליקו את הלייזר על ידי לחיצה על הכפתור המתאים בקופסת הבקרה. לאחר מכן, הניחו מכסה בתוך מחזיק המכסים. הניחו את שקופית ה-LAM על גבי שקופית זכוכית למיקרוסקופיה, וודאו שהצד השטוח של השקופית שבו מודבקות הרקמות פונה כלפי שקופית הזכוכית.לאחר מכן, הניחו את העגלה במכשיר כאשר העגלה הזכוכיתית נמצאת מתחתיה. לבסוף, מקמו את מחזיק הפקק עם הפקק בתוך המכשיר. בחרו בעדשה אובייקטיבית של 4x.בתוכנה, העבירו את המכסה למצב למעלה. לאחר מכן, בצעו סריקה של הפיתוח. חפשו בתוך הפיתוח וזהו את המבנים המבוקשים.אתרו ושמרו את מיקומם של התאים על גבי הפסית כדי לאפשר חזרה למיקום המדויק בשלב החיתוך. לאחר מכן, בחרו עדשה מתאימה. ודאו את מיקום הלייזר על ידי לחיצה אחת על כפתור יריית הלייזר.באופן אידיאלי, בחלק של הממברנה ללא רקמה. כאשר הפקק נמצא במצב תחתוני, השתמש בכלי עט היד כדי לסמן את הגבולות של סוג התא או הרקמה הרלוונטיים. לדוגמה, תא הביצית.בצעו דיסקציה באמצעות הלייזר על ידי לחיצה על Cut. על מנת לבודד תאים בודדים, קריטי לזהות אותם בבירור בחתכים הנכונים. כמו כן, על התאים להיות בעלי קוטר של לפחות 8 µm כדי שניתן יהיה לבצע ניתוח שעתוק ספציפי לסוג התא.שימו לב כי יש לחזור על פעולת החיתוך אם השוליים סביב התא לא נחתכו במלואם, דבר שניתן בדרך כלל לראות על המסך. במקרה זה, מומלץ להגדיר בתוכנה הרצה אוטומטית של שתי חזרות על החיתוך כסטנדרט. לאחר מכן, הסירו את המכסה ועברו לעמדת השמירה הבאה המכילה מבנה רלוונטי, וחיתכו את מקטע התא הבא עד שכל התאים הרלוונטיים משקופית אחת ייאספו.ודאו כי הפקק ממוקם כך שהחלק החדש יידבק למיקום ריק על הפקק. לאחר בידוד סוגי התאים הרלוונטיים מכל השקופיות, הוציאו את השקופית מהמכשיר. הניחו את מחזיק הפקק במצב נמוך ובצעו בדיקה ויזואלית של פני הפקק.השתמש בעדשה עם הגדלה של 4x כדי לשלול זיהומים לא ספציפיים של הדגימה. לאחר מכן סגור את המכסה. הקפא את החתכים היבשים בטמפרטורה של 80°C- עד לשימוש הבא.להלן שרטוט סכמטי של הגמטופיט הנקבי הבוגר. אלו הם חתכים דקים של לוליינות המכילות גמטופיטים נקביים ב-boechera divaricarpa, שבהם תאי ביצית ניתנים לזיהוי ברור הודות למורפולוגיה האופיינית של הגמטופיט הנקבי. איכות RNA דומה התקבלה בניתוח של חתכי תאי הביצית בהשוואה לאזורי רקמה גדולים יותר שנלקחו מאותן שקופיות כביקורות.איכות ה-RNA שהושגה הייתה מתאימה לריצוף RNA ספציפי לסוג התא, דבר שהוביל לזיהוי של 236 גנים המבטאים בתא הביצה האפומיקטי אך לא בתא המרכזי האפומיקטי, בתא הסינרגנט או בתא הראשוני האפומיקטי. הם לא בוצעו גם בתאים של הגמטופיט המיני הבשל של *Arabidopsis thaliana*. ניתן לבצע פרופיל לתאי ורקמות אחרים ממינים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות של גנטיקה התפתחותית.כגון הבסיס המולקולרי של הטבעה (imprinting) באנדוספרמה ובעוברים של זרעי צמחים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומי הגנטיקה ההתפתחותית והרבייה של צמחים לבחון את הבסיס התעתוקי של רבייה אפומיקטית בסוג Boechera. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג RNA באיכות גבוהה לצורך ניתוחי תעתוק ספציפיים לסוגי תאים באמצעות מיקרו-דיסקציה בעזרת לייזר.

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Microdissection לייזר יושמה כדי לנתח את הביטוי פרופיל גנטי בתאים מסוימים של הדיסק כנף תסיסנית נתון RNAi...

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר כשיטה יעילה לבידוד אוכלוסיות טהורות של סוגי תאים מרקמות ערמונית הטרוגניות לצורך ניתוח RNA במורד הזרם.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.

בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

למד מיקרוכירורגיה לייזרית לבידוד תאי צמחים ספציפיים כגון תאי ביצה ב-Boechera. שיטה זו מייצרת RNA באיכות גבוהה לניתוח תעתיקי ומסייעת בחקר הבסיס הגנטי של רבייה מינית ואל-מינית בצמחים.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

גלה סרטונים נוספים