Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

המטרה הכללית של פרוטוקול זה עבור LAM היא לבודד תאי צמח ספציפיים לצורך הפקת RNA באיכות גבוהה עבור אנליזה תעתוקית. הדגש הוא על תאים שגישם מוגבל, כגון תאי ביצית, במיני boechera מיניים ואפומיקטיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הגנטיקה ההתפתחותית של צמחים, כגון הבסיס התעתוקי העומד בבסיס רביית צמחים מינית ואסימפטומטית באמצעות זרעים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע סגנונות ספציפיים מסוימים. היא מאפשרת להתגבר על אפקט המיסוך של שעתוקים של סוגי תאים נדירים בניתוח של רקמות אתרוגנזה. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בתחנת החסימה למילוי מגש איזון פלסטי טרי שחומם מראש בשעווה פראפינית מותכת בטמפרטורה של 56 °C.

הרימו את מכסה אמבט הפרפין והוציאו קסאט אחד בכל פעם. העבירו דגימה לשעוות פרפין נוזלית בטמפרטורה של 56 °C במגש איזון. פעלו במהירות כדי למנוע התקשות של השעווה מסביב לדגימה בזמן טיפול בקסאט.

לאחר מכן, מקמו את הדגימה בהתאם לתכנון הניסויי באמצעות מחט הכנה. חזרו על הפעולה עד להעברת כל הדגימות. להכנת חתכים דקים עבור LAM, הסירו את שעוות הפרפין מהדגימה שבתבנית הפלסטיק באמצעות שולחן תאורה.

חטבו מחויץ שעווה המכיל את הדגימה, כגון ניצן או פרח, באמצעות להב תער נקי מ-RNase. לאחר מכן, המיכו טיפה קטנה של שעוות פרפין על קצה שפכטל. השתמשו בשעווה החמה כדי לקבע את החויץ עם הדגימה המוטמעת על התמיכה.

הסר את השעווה העודפת המקיפה את הדגימה באמצעות להב תער, וודא כי לבלוק יש פני שטח מרובעים עם קצוות מקבילים. לאחר מכן, הגדר את פלטת החימום ל-42 °C. חבר את הדגימה למיקרוטום באופן בטוח.

הכינו חתכים בעובי שבעה מיקרומטר עבור התאים של הגמטופיט הבוגר של boechera. לאחר מכן, העבירו את סרטי הפרפין, שאורכם 10 עד 15 סנטימטר, לקופסת פלסטיק עם קרטון שחור בתחתית לפני הצבתם על נגבי ה-LAM. כדי להכין את הנגבים עבור LAM, הניחו חמישה עד עשרה נגבים בעלי מסגרת מתכת על לוח החימום כאשר המשטחים השטוחים פונים כלפי מעלה.

טפטפו מיליליטר אחד עד שניים של מים נקיים מ-RNase על החלק הפלסטי של השקופיות. בעזרת להב תער, חתכו את סרטי הפראפין לחתיכות קצרות של כארבעה עד חמישה סנטימטרים, באורך המספיק כדי לכסות את החלונות הפלסטיים של השקופיות.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה ובמחט הכנה כדי להניח את רצועות הפרפין במקביל זו לזו על החלון הפלסטי של השקופיות. הרימו בזהירות את השקופיות מקצה אחד כדי להסיר את המים והניחו אותן בחזרה. כסו את לוח החימום במכסה פלסטיק מבלי לגעת בשקופיות, וודאו שהמכסה הפלסטיק מאפשר חילופי אוויר.

ייבשו את השקופיות בטמפרטורה של 42 °C למשך הלילה. תחת מנדף כימי, בצעו הסרת שעווה (de-wax) מהשקופיות ב-xylol פעמיים, למשך 10 דקות בכל פעם. ודאו שאתם מטביעים רק את החלק הפלסטי של השקופיות ושומרים על הקצה הרחב של מסגרת המתכת של כל שקופית יבש כדי לאפשר את הוצאתן.

השאירו את השקופיות להתייבש במשך 10 דקות במנדף הכימיים לפני ביצוע ה-LAM. בהליך זה, הדליקו את המחשב ואת המיקרוסקופ לצורך ה-LAM. לאחר מכן, הפעילו את התוכנה השולטת במיקרוסקופ ובלייזר.

הפעילו את קופסת הבקרה של הלייזר והדליקו את הלייזר על ידי לחיצה על הכפתור המתאים בקופסת הבקרה. לאחר מכן, הניחו מכסה בתוך מחזיק המכסים. הניחו את שקופית ה-LAM על גבי שקופית זכוכית למיקרוסקופיה, וודאו שהצד השטוח של השקופית שבו מודבקות הרקמות פונה כלפי שקופית הזכוכית.

לאחר מכן, הניחו את העגלה במכשיר כאשר העגלה הזכוכיתית נמצאת מתחתיה. לבסוף, מקמו את מחזיק הפקק עם הפקק בתוך המכשיר. בחרו בעדשה אובייקטיבית של 4x.

בתוכנה, העבירו את המכסה למצב למעלה. לאחר מכן, בצעו סריקה של הפיתוח. חפשו בתוך הפיתוח וזהו את המבנים המבוקשים.

אתרו ושמרו את מיקומם של התאים על גבי הפסית כדי לאפשר חזרה למיקום המדויק בשלב החיתוך. לאחר מכן, בחרו עדשה מתאימה. ודאו את מיקום הלייזר על ידי לחיצה אחת על כפתור יריית הלייזר.

באופן אידיאלי, בחלק של הממברנה ללא רקמה. כאשר הפקק נמצא במצב תחתוני, השתמש בכלי עט היד כדי לסמן את הגבולות של סוג התא או הרקמה הרלוונטיים. לדוגמה, תא הביצית.

בצעו דיסקציה באמצעות הלייזר על ידי לחיצה על Cut. על מנת לבודד תאים בודדים, קריטי לזהות אותם בבירור בחתכים הנכונים. כמו כן, על התאים להיות בעלי קוטר של לפחות 8 µm כדי שניתן יהיה לבצע ניתוח שעתוק ספציפי לסוג התא.

שימו לב כי יש לחזור על פעולת החיתוך אם השוליים סביב התא לא נחתכו במלואם, דבר שניתן בדרך כלל לראות על המסך. במקרה זה, מומלץ להגדיר בתוכנה הרצה אוטומטית של שתי חזרות על החיתוך כסטנדרט. לאחר מכן, הסירו את המכסה ועברו לעמדת השמירה הבאה המכילה מבנה רלוונטי, וחיתכו את מקטע התא הבא עד שכל התאים הרלוונטיים משקופית אחת ייאספו.

ודאו כי הפקק ממוקם כך שהחלק החדש יידבק למיקום ריק על הפקק. לאחר בידוד סוגי התאים הרלוונטיים מכל השקופיות, הוציאו את השקופית מהמכשיר. הניחו את מחזיק הפקק במצב נמוך ובצעו בדיקה ויזואלית של פני הפקק.

השתמש בעדשה עם הגדלה של 4x כדי לשלול זיהומים לא ספציפיים של הדגימה. לאחר מכן סגור את המכסה. הקפא את החתכים היבשים בטמפרטורה של 80°C- עד לשימוש הבא.

להלן שרטוט סכמטי של הגמטופיט הנקבי הבוגר. אלו הם חתכים דקים של לוליינות המכילות גמטופיטים נקביים ב-boechera divaricarpa, שבהם תאי ביצית ניתנים לזיהוי ברור הודות למורפולוגיה האופיינית של הגמטופיט הנקבי. איכות RNA דומה התקבלה בניתוח של חתכי תאי הביצית בהשוואה לאזורי רקמה גדולים יותר שנלקחו מאותן שקופיות כביקורות.

איכות ה-RNA שהושגה הייתה מתאימה לריצוף RNA ספציפי לסוג התא, דבר שהוביל לזיהוי של 236 גנים המבטאים בתא הביצה האפומיקטי אך לא בתא המרכזי האפומיקטי, בתא הסינרגנט או בתא הראשוני האפומיקטי. הם לא בוצעו גם בתאים של הגמטופיט המיני הבשל של *Arabidopsis thaliana*. ניתן לבצע פרופיל לתאי ורקמות אחרים ממינים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות של גנטיקה התפתחותית.

כגון הבסיס המולקולרי של הטבעה (imprinting) באנדוספרמה ובעוברים של זרעי צמחים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחומי הגנטיקה ההתפתחותית והרבייה של צמחים לבחון את הבסיס התעתוקי של רבייה אפומיקטית בסוג Boechera. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג RNA באיכות גבוהה לצורך ניתוחי תעתוק ספציפיים לסוגי תאים באמצעות מיקרו-דיסקציה בעזרת לייזר.