ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי
4 באפריל 2016
כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע כיצד טיפול קסנוביוטי או מצב מחלה משנים את חילוף החומרים התאי. לשיטה זו יש פוטנציאל לחשוף כיצד מצב מחלה או רעלן מיושם משפיעים על חילוף החומרים התאי. וברגע שזה ידוע, לשיטה שלנו יש את היכולת לגלות אם התערבות כלשהי יכולה לתקן את הפגם.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה מסתמכת על קווי תאים שעברו טרנספורמציה, ולכן סביר יותר שהיא תספק תשובות הרלוונטיות ישירות לבריאות האדם. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסת מלאי של 10 מילי-מולרית של רוטנון בדימתיל סולפוקסיד. בצע דילול סדרתי של תמיסת מלאי רוטנון של 10 מילי-מולרית כדי להשיג תמיסות עם ריכוזי רוטנון הנעים בין ננו-מולרית אחת ל-100 מיקרו-מולר.
לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר מכל תמיסת מלאי לחמישה מיליליטר של תמיסת חיץ מועשרת של Tyrode שהוכנה בעבר להכנת תמיסות עם ריכוזי רוטנון הנעים בין 10 פיקומולר למיקרומולר אחד. הוסף 50 מיקרוליטר של DMSO לאחת מדגימות תמיסת החיץ כדי לשמש כבקרת רכב. כדי לבודד טסיות דם מלא, צנטריפוגה דגימות דם מלא ב-175 x גרם למשך 15 דקות ללא הפסקות.
בסיום, העבירו מיליליטר אחד משכבת הפלזמה העליונה העשירה בטסיות לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. בעת העברת הפלזמה העשירה בטסיות, היזהר לא להפריע למעיל הבאפי כך שכדור הטסיות לא יזדהם על ידי לימפוציטים. צנטריפוגה את שכבת הפלזמה העשירה בטסיות דם ב-400 x גרם למשך חמש דקות.
לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט. באמצעות לא פחות משלושה שכפולים ביולוגיים לכל מצב, השעו מחדש את גלולת הטסיות במיליליטר אחד מכל תמיסת רוטנון שהוכנה בעבר. לאחר מכן, דגרו את הטסיות המרחפות בחממת פחמן דו חמצני עם מעטפת מים המוגדרת ל-95% לחות ו-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
בשלב זה, גלולה את הטסיות על ידי צנטריפוגה של הדגימות ב-3000 x גרם למשך שלוש דקות. לאחר שאיבת הסופרנטנט, הוסף את התקן הפנימי היציב המתאים עם תווית איזוטופ. לאחר מכן, השעו מחדש את הטסיות ב-750 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית 10% קרה כקרח.
דופק סוניקט כל דגימה 30 פעמים עם פולסים של 0.5 שניות. לאחר צנטריפוגה, הצמד עמודות מיצוי פאזה מוצקה C18 לסעפת ואקום. התנה את העמודות במיליליטר אחד של מתנול.
לאחר מכן, יש לאזן את העמודים עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים. הפעל את ה-supernatent הנגזר מהדגימה דרך העמודות. בסיום, שטפו את העמודים במיליליטר מים.
לאחר מכן, טען צינורות צנטריפוגה מזכוכית של 10 מיליליטר לתוך סעפת הוואקום כדי לאסוף את שברי הפליטה. הסירו את העמודים עם מיליליטר אחד של אמוניום אצטט 25 מילי-מולרי ומתנול. לאחר ייבוש הפליטה תחת גז חנקן, השעו מחדש את השאריות המיובשות ב-50 מיקרוליטר של חומצה 5%5-sulfosalicyclic והעבירו את הדגימות לקבצי HPLC לניתוח.
כפי שדווח בעבר בתאי SH-SY5Y, משערים כי שינויים ברמות היחסיות של תיואסטרים של אציל CoA בתגובה לרוטנון נובעים מעיכוב של קומפלקס אחד. באופן ספציפי, יש ירידה תלוית מינון ב-succinyl CoA עם עלייה בו-זמנית בבטא-הידרוקסיבוטיריל-CoA, בעוד שרמות האצטיל CoA נותרו ללא שינוי. ניתוח טסיות דם אנושיות שטופלו ברוטנון מגלה תוצאות עקביות ביותר ומספק סט ייחודי של נתונים ניסיוניים.
חשוב לציין כי תצפית זו מדגישה את התלות המיטוכונדריאלית של התגובה לרוטנון מכיוון שטסיות הדם חסרות גרעינים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מעקב מטבולי על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון: כיצד טיפול זה או מצב מחלה זה משפיעים על ניצול הסובסטרט? אם אנו מזהים שינויים ברמות של מטבוליט כלשהו, מדוע הוא משתנה?
אילו שלבים במסלול מושפעים, ובאיזה אופן? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבודד טסיות דם מלא, לבצע את אתגר ex-vivo המבוקר ולחלץ את תיואסטרי האציל CoA לאנליזה של LCMS.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש בטסיות דם אנושיות מבודדות כמודל ex vivo לבחינת התאמות מטבוליות בתגובה לרוטנון (rotenone), מעכב של קומפלקס I. השיטה עושה שימוש במעקב איזוטופי ובכרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסות לצורך כימות יחסי, מה שהופך אותה ישימה למגוון עיצובי מחקר.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מטבוליזם תאי
- פרמקולוגיה
- רלוונטיות לבריאות האדם
רקע
- הבנת האופן שבו קסנוביוטיקה משפיעה על המטבוליזם התאי היא קריטית.
- טסיות דם אנושיות מבודדות מספקות מודל רלוונטי בהשוואה לקווי תאים שעברו טרנספורמציה.
- גישה זו יכולה לסייע בזיהוי התערבויות פוטנציאליות לפגמים מטבוליים.
- Rotenone משמש כמעכב של קומפלקס I לצורך חקר שינויים מטבוליים.
מטרת המחקר
- לקביעת ההשפעות של טיפול בחומרים זנוביוטיים על המטבוליזם התאי.
- לבחינה כיצד מצבי מחלה משנים תהליכים מטבוליים.
- להערכת הפוטנציאל של התערבויות לתיקון פגמים מטבוליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת מלאי של rotenone בריכוז 10 millimolar ב-dimethyl sulfoxide.
- דילול סדרתי של מלאי ה-rotenone להשגת ריכוזים שונים.
- סימון איזוטופי לניתוח מטבולי.
- כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסות לכימות.
תוצאות עיקריות
- טסיות מבודדות מהוות מודל יעיל לתגובות מטבוליות ל-rotenone.
- מעקב איזוטופי חושף הסתגלויות מטבוליות משמעותיות.
- כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסות מספקת כימות מדויק.
- השיטה ישימה למגוון תכנוני ניסויים.
מסקנות
- טסיות דם אנושיות מבודדות הן מודל בעל ערך למחקר של חילוף חומרים.
- גישה זו עשויה להוביל לתובנות לגבי מנגנוני מחלה וטיפולים פוטנציאליים.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב שיטה זו כדי לבחון מסלולי מטבוליים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמכים ניהוליים
טסיות דם אנושיות מספקות מודל לא-טרנספורמי בעל רלוונטיות קלינית לחקר מטבוליזם מיטוכונדרי והשפעות של קסנוביוטיקה, ובכך הן נותנות מענה למגבלות של שורות תאי סרטן במחקר מטבולי. פלטפורמה זו מאפשרת ניתוח הדיר בעל ספציפיות לתורם של שינויים במסלולים מטבוליים, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולת ההרחבה באמצעות מקורות מבנקי דם מקלה על ההמשכיות התרגומית מגילוי בסיסי למחקרים פרה-קליניים וקליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בדיקת תגובות מיטוכונדריאליות למעכבי קומפלקס I, כגון rotenone.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית לבני אדם המפחיתה משתנים מתבלבלים הנובעים משכתוב מטבולי בשורות תאים שעברו טרנספורמציה.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות זיהוי עקבי של שינויים מטבוליים מפצים, כגון הגברת חמצון חומצות שומן בעקבות עיכוב גליקוליזה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של LC-MS עבור תיואסטרים של acyl-CoA, מה שמאפשר כימות יחסי וסימון איזוטופי להערכת פעילות ספציפית למסלול חילוף חומרים.
- ערך תפעולי: מספק פרופילים של מטאבוליטים הניתנים לשחזור בין חזרות ביולוגיות, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה עבור קמפיינים של סריקת קסנוביוטיקה.
- יכולת הרחבה: בידוד טבחית מתורמים בודדים או מבנקי דם מאפשר ייצור בר-הרחבה של דגימות פעילות מטבולית עבור סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין תגובות טסיות ex vivo להתאמות מטבוליות in vivo, ובכך תומך בתיקוף פרה-קליני התואם לסמנים ביולוגיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם שינויים מטבוליים שנצפו תלויים במיטוכונדריה, כפי שניתן לראות בתגובות של טסיות ללא גרעין.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הערכה של יעילות ההתערבות בתיקון פגמים מטבוליים, ובכך מספק מידע לקבלת החלטות go/no-go באופטימיזציה של מועמדים מובילים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי תרכובות מובילות (leads) ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תרכובות המכוונות למיטוכונדריה ומודולטורים מטבוליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על השפעות של קסנוביוטיקה על המטבוליזם התאי, באמצעות בידוד תגובות של טסיות לטיפול ברוטנון התלוי במינון.
- סריקה: מאפשר הכנה של טסיות המוכנה לבדיקה עבור אנליזה ב-LC-MS, ומניב תוצאות כמותיות הדירות לסריקת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת כימות יחסי של תיואסטרים של acetyl-CoA, succinyl-CoA ו-beta-hydroxybutyryl-CoA, ובכך מאפשרת השוואה של שטף מטבולי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם רצף פרה-קליני על ידי מידול התאמות מטבוליות הרלוונטיות למצבי מחלה ולהתערבויות טיפוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה סטנדרטי לבידוד טסיות ולהפקת מטבוליטים, הישים על פני מספר פרויקטים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי שימוש במודל אנושי רלוונטי פיזיולוגית המונע ארטיפקטים של שורות תאי סרטן.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד טסיות, גירוי ex vivo ומיצוי מטבוליטים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של ליאביליות מטבולית, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב רעילות מיטוכונדריאלית בלתי צפויה.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעותיהן על נתיבים מטבוליים מרכזיים במערכת רלוונטית לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד טסיות דם, טיפול סטרילי בתאים ומטבוליזום בשיטת LC-MS/MS.
- תלוי בגישה לציוד צנטריפוגה, סעפות ואקום לסמיגה במוצב מוצק (solid-phase extraction) ומערכות HPLC-MS.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת פלזמה עשירה בטסיות ומינון rotenone בין מעבדות ותורמים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור קסנוביוטיקות שונות ותוכניות סימון איזוטופיות.
- מוגבל על ידי חיוניות הטסיות ex vivo והצורך בעיבוד מיידי לאחר הבידוד כדי לשמור על השלמות המטבולית.
