Name: Cycloheximide ניתוח צייס של פירוק חלבונים ב שמר האפייה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למדו לחקור פירוק חלבונים בשמר האפייה Saccharomyces cerevisiae באמצעות שיטת צ'ייס ציקלוהקסימיד ו-Western blotting. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל של יציבות חלבונים ללא שימוש באיזוטופים רדיואקטיביים או שלבי אימונו-פרסיפיטציה ממושכים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחברים בהווה ובעבר במעבדת רובינשטיין על שסיפקו סביבת מחקר תומכת ונלהבת. המחברים מודים למארק הוכסטרסר (אוניברסיטת ייל) על שיתוף ריאגנטים ומומחיות. E.M.R. מודה לסטפן קרפט (אוניברסיטת קונסטנץ) ולג'ניפר ברונס (אוניברסיטת פיטסבורג) על שיתוף מומחיות שלא תסולא בפז בניתוח קינטי של חלבונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכונים הלאומיים לבריאות (R15 GM111713) ל-E.M.R., פרס מחקר ASPiRE של אוניברסיטת בול סטייט ל-E.M.R, פרס מחקר מסניף אוניברסיטת בול סטייט של סיגמא שי ל-S.M.E., וכספים ממשרד ראש אוניברסיטת בול סטייט והמחלקה לביולוגיה.

צמיחה 1. קציר של תאים שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא בניתוח קינטיקה השפלה של חלבון שמרים אנדוגני, להפוך זן שמרים הרצוי (ים) עם פלסמיד המקודד את החלבון של עניין. שיטות אמינות לטרנספורמציה שמרים תוארו בעבר 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן שמרים ב 5 מ&quot;ל של המדיום המתאים (למשל, מוגדר סינתטי סלקטיבית (SD) בינוני עבור תחזוקה פלסמיד של התאים שהשתנו או שמרים הלא סלקטיבי לחלץ דקסטרוז-peptone (YPD) בינוני עבור תאים שאינם טרנספורמציה). דגירה לילה בשעה 30 ° C, מסתובבת. הערה: 30 ° C היא הטמפרטורה לצמיחה אופטימלית עבור זני שמרים מעבדה wild-type טיפוסי 38. עם זאת, בגלל זני שמרי מוטציה כמה לא גדלים בצורה אופטימלית על 30 מעלות צלזיוס וכמה חלבונים עוברים שפלת טמפרטורה תלויה, הטמפרטורות המשמשות צמיחת שמרי תא ולרדוף cycloheximide צריכות להיקבע באופן אמפירי 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד הצפיפות הדואר אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כל תרבות לילה. הערה: תאים עשויים להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי או נייח אבל צריך מינימלית הגיעו צפיפות שיאפשר דילול ל OD 600 = 0.2 ב 15 מ&quot;ל של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את התרבויות לילה ערך OD 600 של 0.2 ב 15 מ&quot;ל של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שמרים ב 30 מעלות צלזיוס, רועד עד התאים מגיעים לשלב צמיחת אמצע לוגריתמים (כלומר, OD 600 בין 0.8 ו -1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך גדילת תאים שמרים, לבצע את הפעולות הבאות כהכנת הליך מרדף cycloheximide: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר גוש חום שיכול להכיל 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי 30 מעלות צלזיוס במשך הדגירה של תאים בנוכחות cycloheximide. מוסיפים מים עד הבארות של גוש חום לאפשר פיזור חום יעיל לתרבויות. מוסיפים מים היטב כל כך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל תגרום מפלס המים לעלות, אבל לא עולה על גדותיו, שפת הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר גוש חום שני שיכול להכיל 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge עד 95 מעלות צלזיוס במשך denaturation חלבונים לאחר תמוגה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום גידול טרי טרום חם (1.1 מיליליטר לכל נקודת זמן לכל תרבות להיות assayed) עד 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl 20x עצור מיקס מראש שכותרתו צינורות microcentrifuge (פעם אחת צינור לכל נקודה לכל תרבות להיות assayed). מניחים צינורות על הקרח. זהירות: אזיד הנתרן, מרכיב 20x עצור מיקס, הוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה או מגע עורי. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון והטיפול יזיד הנתרן. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים הגיעו צמיחת אמצע לוגריתמים, לאסוף 2.5 OD 600 יחידות של כל תרבות לכל נקודת זמן להיות assayed (למשל, 7.5 OD 600 יחידות לנתח שפע חלבון בשלוש נקודות זמן). צנטריפוגה שנאספו התאים צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ב 3,000 XG בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. הערה: קישור אחד OD 600 היחידה היא שווה לסכום של שמרים נוכח 1 תרבות מ&quot;ל ב OD של 600 1.0. היקף התרבות (ב מיליליטר) נדרשה למסוק יחידות X OD 600 (V) יכול להיקבע באמצעות המשוואה הבאה: V = X OD 600 יחידות / נמדדת OD 600. לדוגמה, כדי לקצור 7.5 OD 600 יחידות של תרבית תאים שמרים OD של 600 1.0, לאסוף 7.5 OD 600 יחידות / 1.0 = 7.5 מ&quot;ל תרבית שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה תא 1 מ&quot;ל של 30 ° C (מחומם מראש) מדיום הגידול טריים לכל 2.5 OD 600 יחידות של תאים (למשל, 3 מ&quot;ל תמורת 7.5 OD 600 יחידות). </li></ol> 2. cycloheximide צ&#39;ייס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן השעיות תא שמרים ידי דגירה במשך 5 דקות בתוך הגוש החום 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן טיימר לספור למעלה מ 00:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את מרדף cycloheximide, לחץ על &quot;התחל&quot; על טיימר. מַהֵר,אבל בזהירות, בצע את הפעולות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף cycloheximide לריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ&quot;ל ההשעיה תא שמרים הראשונה (למשל, להוסיף 37.5 μl של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל המניות cycloheximide עד 3 מ&quot;ל של תרחיף תאים), מערבולת בקצרה לערבב. זהירות: cycloheximide הוא מגרה עורי והוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון וטיפול cycloheximide. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הוספת cycloheximide ו vortexing, להעביר 950 μl (~ 2.4 OD 600 יחידות) של ההשעיה תא שמרים עם הוסיף cycloheximide לצינור microcentrifuge מראש שכותרתו המכיל 50 תמהיל μl קר כקרח 20x להפסיק. וורטקס צינור microcentrifuge, ומניח על קרח עד שכל הדגימות נאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את ההשעיה תא שמרים עד 30 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.3.1 דרך 2.3.3 עבור כל אחד השעיות תא שמרים הנותרים במרווחי זמן קבועים (למשל, כל 30 שניות, כך cycloheximide מתווסף לדוגמא # 1 0:00, לדוגמא # 2 ב- 00:30, לדוגמא # 3 בשעה 1:00 , וכו &#39;.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל נקודת זמן לאחר מכן, השעיות תא מערבולת שמרים העברת 950 μl לצינורות microcentrifuge שכותרתו המכיל 50 μl מראש צונן 20x עצור מיקס. וורטקס ותאי שנאספו ומניחים על קרח. חזור 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי 30 ° C בבלוק חום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, עבור אוסף של תאים 30 דקות לאחר תוספת cycloheximide (בהנחה של 30 שניות במרווחים בין בנוסף cycloheximide כדי השעיות תא שמרים בתחילת הקורס הזמן), מערבולת ולהסיר 950 μl של ההשעיה תא ממדגם # 1 ב- 30:00 . חזור על הפעולה עבור לדוגמא # 2 ב- 30:30, וכן הלאה. הערה: כדי למנוע התיישבות של שמרים, השעיות תא מערבולת ב 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי בערך כל 5 דקות במהלך הקורס של המרדף. לחלופין, השעית תא שמריםהים עשוי להישמר באמבט מי התססה ברציפות למשך ניסוי מרדף cycloheximide. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הדגימות נאספו, גלולה שנאספו התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,500 XG בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. הסר את supernatant ידי pipetting או שאיפה. תאים מוכנים כעת תמוגה אלקליין. לחלופין, הצמד להקפיא תאים pelleted בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. הפקת חלבון פוסט אלקליין (השתנה מ 16,40) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של מים מזוקקים לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl של 0.2 M NaOH מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים מושעה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בשלב זה, תאי שמרים שלא היה lysed, וחלבונים לא שוחררו 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 18,000 XG ב מזג בחדרature למשך 30 שניות. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי lyse תאים, להוסיף 100 μl של חיץ מדגם Laemmli לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing. הערה: הדגירה סדרתית של תאים עם חלבונים משחרר חיץ מדגם NaOH ו Laemmli בצורה תואמת ג&#39;ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE) באמצעות מערכת חיץ ריצה טריס-גליצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים באופן מלא. הערה: דגירה על 95 מעלות צלזיוס לא יכולה להיות מתאימה ניתוח של חלבונים כי הם מועדים צבירה (למשל, חלבונים עם כמה קטעים הטרנסממברני). חלבונים אלה עשויים להיות מסיסים כאשר מודגרות בטמפרטורות גבוהות 41. לכן, לצורך ניתוח של חלבונים כאלה, lysates צריך להיות מודגרות בטמפרטורות נמוכות (למשל, 37 ° C - 70 ° C) במשך 10 - 30 דקות, כפי שנקבע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysates צנטריפוגה ב 18,000 XG ב roטמפרטורת om דקות 1 עד גלולת חומר מסיס. Supernatant (חלבון חילוץ solubilized) מוכן להפרדה על ידי SDS-PAGE וניתוח כתם המערבי לאחר מכן. לחלופין, lysates ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. נציג SDS-PAGE ונוהל המערבי סופג (מעובד מתוך 16) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון טען סטנדרטים משקל מולקולרי ונפח לקבוע באופן אמפירי של lysates על ג&#39;ל SDS-PAGE. הערה: בחר את אחוז acrylamide ו bis-acrylamide ב ג&#39;ל SDS-PAGE לפי המשקל המולקולרי של החלבון של עניין. באופן כללי, ג&#39;לים שיעור נמוך מתאימים יותר לפתרון חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל לרוץ 200 V עד בחזית לצבוע הגיע לקצה התחתון של ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר חלבונים מן ג&#39;ל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום בהעברה רטובה ב 20 V 60 - 90 דק &#39;ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום הממברנה על ידי דוגרי טריס-בופר (TBS) המכיל 5% חלב רזה, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: כדי למנוע התפתחותם של חיידקים בנוכחות קרום מודגרות לילה, מומלץ לכלול אזיד הנתרן הפתרון חוסם בריכוז סופי של 0.02%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין TBS עם 0.1% Tween-20 (TBS / T) וחלב 1% דל שומן, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה. הערה: fluorophores הוא רגיש לאור. לכן, דילולים של נוגדנים מצומדות כדי fluorophores צריך להיות מוכן בחושך, ו הדגירה של ממברנות בנוכחות נוגדנים מצומדות כדי fluorophores וצעדים לשטוף לאחר מכן אמור להתרחש ב lightproof (למשל, עטופה בנייר כסף) במשותףntainers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום תמונה באמצעות LI-COR אודיסיאה CLX ותוכנה סטודיו תמונה (או ציוד הדמיה להשוות ותוכנה), בעקבות המלצות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת התמונה קרום, דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי עבור חלבון טעינה מלאה ב TBS / T עם 1% חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום תמונה כמו בשלב 4.9. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במאמר זה, שיטה לניתוח קינטיקה פירוק חלבונים מוצגת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת מגוון של חלבונים מושפלים על ידי מגוון של מנגנונים. חשוב לציין כי ניסויי cycloheximide מרדף לדווח על קינטיקה השפלה של ברכת המצב היציבה של חלבון נתון. טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את קינטיקה השפלה של אוכלוסיות ספציפיות של חלבונים. לדוגמא, גורל degradative של פוליפפטידים המתהווה יכול להיות מועבר על ידי ניתוח מרדף דופק 55. בניסויים כאלה, חלבונים המתהווה הם הדופק שכותרתו בקצרה (למ...

חלבונים לבצע פעולות מכריעות כמעט בכל תהליך הסלולר. תהליכים פיזיולוגיים רבים דורשים נוכחות של חלבון מסוים (או חלבונים) לתקופה מוגדרת של זמן או בנסיבות מיוחדות. אורגניזמים ולכן לפקח ולהסדיר שפע חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר 1. לדוגמא, cyclins (חלבונים השולטים חלוקת תא) נוכח בשלבים מסוימים של מחזור התא, ואת אובדן רמות cyclin המוסדרים נקשר עם היווצרות גידולים ממאירים 2. בנוסף ויסות רמות חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר, תאים במנגנוני בקרת איכות degradative לחסל misfolded, מוכנות להרכבה, או סוטות אחרת מולקולות חלבון 3. פיקוח על שפע חלבון כרוך הסדרה הן סינתזת macromolecular (שעתוק ותרגום) ושפלה (ריקבון רנ&quot;א proteolysis). פירוק חלבונים פגומים או מוגזם תורם פתולוגיות מרובים, כולל סרטן, סיסטיק פיברוזיס, תנאים ניווניות, והפרעות קרדיו 4-8. מנגנוני פרוטאוליטים ולכן הם בגדר מטרות טיפוליות מבטיחים עבור מגוון של מחל 9-12. ניתוח של חלבונים בנקודת זמן אחת (למשל, על ידי כתם המערבי 13, cytometry זרימה 14, או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 15) מספק תמונת מצב של שפע חלבון מצב יציב מבלי לחשוף את התרומה היחסית של סינתזה או השפלה. בדומה לכך, מבחני כתב מבוסס צמיחה לשקף את רמות חלבון מצב יציבות על פני תקופת זמן ממושכת בלי להיפלות בין ההשפעות של סינתזת שפלה 15-20. אפשר להסיק את התרומה של תהליכי degradative לרמות חלבון מצב יציב על ידי השוואת שפע לפני ואחרי עיכוב רכיבים ספציפיים של מנגנון degradative (למשל, על ידי פרמקולוגית inactivating והגנה של המחזורasome 21 או לדפוק את גן שיערו להידרש השפלה 13). לשינוי ברמת חלבון מצב יציב לאחר עיכוב מסלולים degradative מספק ראיות חזקות תרומת proteolysis לשליטת שפע חלבון 13. עם זאת, כגון ניתוח עדיין אינו מספק מידע לגבי קינטיקה של מחזור חלבון. מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג מתגבר חולשות אלה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לחזות פירוק חלבונים לאורך זמן 22-24. יתר על כן, כי גילוי חלבונים לאחר מרדף cycloheximide מבוצע בדרך כלל על ידי מערבי סופג, איזוטופים רדיואקטיביים וצעדי immunoprecipitation ממושכים אינם נדרש עבור מרדף cycloheximide, בניגוד טכניקות מרדף דופק רבות נפוצות, אשר מבוצעות גם לדמיין חלבון שפל 25. Cycloheximide זוהה לראשונה כמתחם עם אנטי פטרייתי נאהקשרים המיוצר על ידי Streptomyces חיידק חיובי גרם griseus 26,27. זוהי מולקולה התא חדיר המעכבת cytosolic איקריוטיים במיוחד (אבל לא organellar) תרגום על ידי פגיעה ריבוזומלי טרנסלוקציה 28-31. בניסוי מרדף cycloheximide, cycloheximide מתווסף תאים, aliquots של התאים נאספים מיד ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של תרכובת 22. תאים lysed, ושפע חלבון בכל נקודת זמן מנותח, בדרך כלל על ידי כתם המערבי. ירידות שפע חלבונים לאחר תוספת של cycloheximide ניתן לייחס בבטחה פירוק חלבונים. חלבון יציב יקטן בשפע לאורך זמן, בעוד חלבון יציב יחסית יפגין שינוי קטן בשפע. מנגנוני פירוק חלבונים סלקטיבית כבר שמורים ביותר ברחבי Eukarya. הרבה ממה שידוע על פירוק חלבונים נודע ראשוןeukaryote unicellular המודל, cerevisiae Saccharomyces (שמרים ניצנים) 25,32-36. מחקרים עם שמרים צפויים להמשיך ולספק תובנה רומן וחשובות לתוך פירוק חלבונים. שיטת מרדף cycloheximide בתאי שמרים ואחריו ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון מוצגת כאן.

<table><tbody><tr><td>זני שמרים רצויים, פלסמידים, מדיום סטנדרטי ורכיבי</td><td></td><td></td><td></td>חיץ</tr><tr><td>צינורות זכוכית בורוסיליקט חד פעמיים</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>חממה מווסתת טמפרטורה (למשל חממת Heratherm דגם IMH180)</td> <td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>תוף להחלפה של ניו ברונסוויק לצינורות 18 מ"מ (רולר צינור)</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>M1053-0450</td><td>רולר צינור מומלץ לשמירה על תרביות התחלה של תאי שמרים בתרחיף. לחלופין, אם רולר צינור אינו זמין, ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה בחממה מבוקרת טמפרטורה לתרביות התחלה ללילה. ניתן להשתמש בשייקר פלטפורמה או רולר צינור כדי לשמור על תרביות גדולות יותר בהשעיה.</td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק TC-7 רולר תוף 120 V 50/60 H</td><td>ניו ברונסוויק</td><td>M1053-4004</td><td>לשימוש עם רולר צינור</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus ספקטרופוטומטר</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>רוטור שנמכר עם יחידה מכיל צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 ו -2.0 מ"ל. ניתן להחליף את הרוטור לאחד המכיל צינורות חרוטיים של 15 ו-50 מ"ל</td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה F-35-6-30 עם מכסה ומתאמים לצנטריפוגה דגם 5430/R, צינורות חרוטיים 15/50 מ"ל, 6 מקומות</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור מכסה בורג מודפס מסך 17 x 20 מ"מ חרוטי, פוליפרופילן</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>צינור גמיש 1.5 מ"ל, צינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים וטבעיים PCR</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>זמין ממגוון יצרנים</td></tr><tr><td>תנורי חימום אנלוגיים לאמבטיה</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>מומלץ שיהיו שני תנורי חימום זמינים (אחד לדגירת תאים במהלך טיפול בציקלוקסימיד ואחד להרתחת ליזטים לדנטורציה של חלבונים). לחלופין, 30 מעלות; אמבט מים C עשוי לשמש לדגירה של תאים בנוכחות ציקלוהקסימיד. אמבט מים רותחים עם פלטה חשמלית עשוי לשמש לסירוגין כדי לנטרל חלבונים.</td></tr><tr><td>בלוק חימום לצינורות חרוטיים בגודל 12 x 15 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-473-70</td><td>לשימוש עם תנור חימום במהלך דגירה של תאים בנוכחות ציקלוהקסימיד.</td></tr><tr><td>בלוק חימום לצינורות חרוטיים בגודל 20 x 1.5 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>לשימוש עם מחמם Dri-Bath להרתחת ליזטים לדנטורציה של חלבון.</td></tr><tr><td>מכשירי הפעלה והעברה של SDS-PAGE, ספקי כוח וציוד הדמיה או חדרי חושך עבור SDS-PAGE והעברה לממברנה</td><td></td><td></td><td>ישתנו בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה של Western Blot (למשל סורק Li-Cor Odyssey CLx ותוכנת Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>נוגדנים ראשוניים (למשל פוספוגליצרט קינאז (Pgk1), נוגדן חד-שבטי, עכבר (שיבוט 22C5D8)))</td> <td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים (למשל Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life</td> <td>Technologies</td><td>A-21065</td><td>ישתנה בהתאם למעבדה וליישום</td></tr></tbody></table>

cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

הסדרת שפע חלבון חיונית כמעט בכל תהליך הסלולר. שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון פירוק חלבונים. מבחני רבים מדווחים על שפע חלבון (למשל, סופג מערבי נקודה חד פעמי, cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או מבחני כתב מבוסס צמיחה) אינו מאפשרים אפליה של ההשפעות היחסיות של תרגום proteolysis על רמות חלבון. מאמר זה מתאר את השימוש של מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג כדי לנתח את החלבון שפל במפורש eukaryote unicellular המודל, שמר אפייה (שמרים ניצנים). בהליך זה, תאי שמרים מודגרת בנוכחות cycloheximide מעכב translational. Aliquots של התאים נאספים מיד לאחר ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של cycloheximide. תאים lysed, ואת lysates מופרדים על ידי אלקטרופורזה polyacrylamide ג&#39;ל FOr ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון בכל נקודת זמן. הליך מרדף cycloheximide היתרים להדמיה של קינטיקה השפלה של אוכלוסיית המצב היציבה של מגוון של חלבונים תאיים. ההליך ניתן להשתמש כדי לחקור את הדרישות גנטיות והשפעות סביבתיות על פירוק חלבונים.

כדי להמחיש מתודולוגיה מרדף cycloheximide, יציבות Deg1 -Sec62 (איור 1), reticulum endoplasmic שמרים מודל (ER) השפלה -associated (ERAD) המצע, נותח 42-44. בשנת ERAD, אנזימי אנזים היוביקוויטין בקרה איכות לצרף קוולנטית שרשרות של היוביקוויטין החלבון הקטן לחלבונים סוטים המקומיים על קרום ER. חלבונים polyubiquitylated כזה ובהמשך יוסרו מן ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, פרוטאז גדול, cytosolic 45. חלבון Deg1</e...

שפע החלבונים משקף את שיעורי סינתזת החלבון ופירוק החלבון. מאמר זה מתאר את השימוש במרדף ציקלוהקסימיד ואחריו הכתמה מערבית כדי לנתח פירוק חלבון במודל האיקריוט החד-תאי, Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים ויזואלית את הפירוק של אוכלוסיית מצב היציב של חלבון ספציפי ב-Saccharomyces cerevisiae. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את הדרישות הגנטיות ואת ההשפעות הסביבתיות על פירוקו של חלבון מסוים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאין בה צורך באיזוטופים רדיואקטיביים או בשלבי אימונו-פרסיפיטציה ממושכים, בניגוד לטכניקות pulse-chase, המשמשות גם הן להדגמה ויזואלית של פירוק חלבונים.ניתן להשתמש בנוהל זה כדי לנתח חלבון שמרים אנדוגני או חלבון המבוטא מפלסמיד. במקרה האחרון, מאמיר השמרים עובר טרנספורמציה באמצעות פלסמיד המקודד עבור החלבון הנחקר, וזאת בהתאם לפרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי לשמרים. יש להחדיר את השמרים לחמישה מיליליטר של מצע מתאים.דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius תוך סיבוב. למחרת בבוקר, מדדו את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 nanometers, או OD600, של כל תרבית לילה. דללו את התרביות ל-OD600 של 0.2 ב-15 milliliters של מצע טרי.דגרו בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור עד שהתאים יגיעו לשלב גדילה לוגריתמי בינוני. בזמן ששמרי השמרים גדלים, הכינו את הפרוצדורה למעקב עם ציקלוהקסימיד (cycloheximide chase). הגדירו בלוק חימום המתאים למבחנות קוניות של 15 ml לטמפרטורה של 30 °C לצורך דגירת התאים בנוכחות ציקלוהקסימיד.כדי להבטיח פיזור חום יעיל לתרביות, הוסיפו מים לכל באר בבלוק החימום כך ששפופרת קונית של 15 milliliter תגרום למפלס המים לעלות עד לשפת הבאר, אך לא לגלוש ממנה. הגדירו בלוק חימום שני, המתאים לשפופרות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter, ל-95 degrees Celsius לצורך דנטורציה של חלבונים לאחר ליזיס של התאים. חממו מראש מצע גידול טרי ל-30 degrees Celsius.נדרשים 1.1 milliliters של מדיום לכל נקודת זמן עבור כל תרבית שתיבחן. הוסף 50 microliters של 20x Stop Mix למבחנות מיקרוצנטריפוגה מסומנות מראש. הכן מבחנה אחת לכל נקודת זמן עבור כל תרבית שתיבחן.הנח את המבחנות על קרח. כאשר תאי השמרים הגיעו לשלב גידול לוגריתמי בינוני (mid-logarithmic growth), אסוף 2.5 יחידות OD600 מכל תרבית עבור כל נקודת זמן שתיבדק. יחידה אחת של OD600 שווה לכמות השמרים הנמצאת במיליליטר אחד של תרבית ב-OD600 של 1.0.סבב במרכזפוגה את התאים שנאספו במבחנות קוניות של 15 milliliters ב-3,000 ×g בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הסר את הנוזל העליון (supernatant). השהה מחדש כל משק осаח של תאים ב-1 milliliter של מצע גידול טרי בטמפרטורה של 30 °C עבור כל 2.5 יחידות של OD600 של תאים.לפני תחילת ה-cycloheximide chase, יש להביא את תרחיפי תאי השמרים לשיווי משקל על ידי דגירה בבלוק חימום של 30 degree Celsius למשך חמש דקות. ההיבט המאתגר ביותר בהליך זה הוא תזמון הוספת ה-cycloheximide ואיסוף התאים עבור כל דגימה. אנו מבטיחים את הצלחת הפעולה על ידי קביעה והיצמדות ללוח זמנים להוספת ה-cycloheximide ולאיסוף התאים.כדי להתחיל את מרדף הציקלוהקסימיד (cycloheximide chase), לחצו על "Start" בטיימר. הוסיפו במהירות אך בזהירות ציקלוהקסימיד לריכוז סופי של 250 µg/mL לתשסוף תאי השמרים הראשון וערבבו קצרות באמצעות וורטקס. העבירו מיד 950 µL, או כ-2.4 יחידות OD600, של תשסוף תאי השמרים עם הציקלוהקסימיד למבחנה של מיקרוצנטריפוגה המסומנת מראש ומכילה 50 µL של Stop Mix בריכוז 20x מקורר בקרח.ערבבו את מבחנת המיקרוצנטריפוגה ב-Vortex והניחו על קרח עד שכל הדגימות ייאספו. התחילו את שלב המרדף (chase) עם cycloheximide עבור כל אחת מתשלויות תאי השמרים הנותרות במרווחי זמן קבועים, כפי שהודגם. בכל נקודת זמן עוקבת, ערבבו את תשלויות תאי השמרים ב-Vortex והעבירו 950 µL למבחנות מיקרוצנטריפוגה מסומנות המכילות 50 µL של 20x Stop Mix שקולל מראש.ערבבו במכשיר וורטקס והניחו את התאים שנאספו על קרח. כדי למנוע שקיעה של תאי השמרים, ערבבו במכשיר וורטקס את תהלילי התאים באנבונות הקוניות בנפח 15 מיליליטר בערך כל חמש דקות לאורך כל מהלך המרדף (chase). לאחר איסוף כל הדגימות, השקיעו את התאים שנאספו על ידי סנטריפוגציה במהירות של 6,500 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 30 שניות.הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפט או שאיבה. התאים מוכנים כעת לליזה בסיסית. הכן את התאים לליזה בסיסית על ידי הוספת 100 microliters של מים מזוקקים לכל משקע תאים, וערבב מחדש על ידי פיפטור מעלה ומטה.הוסיפו 100 µL של sodium hydroxide בריכוז 0.2 molar לכל דגימה. ערבבו באמצעות vortex. הדגירו את התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.בשלב זה, תאי השמרים טרם עברו ליזיס, וחלבונים טרם שוחררו. בשלב הבא, יש לשקע את התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-18,000 ×g בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. יש להסיר את העלייה (supernatant) באמצעות פיפט או שאיבה.כדי ללייס את התאים, יש להוסיף 100 µL של Laemmli Sample Buffer לכל משקע תאים. יש להחזיר לתליה על ידי פיפוט מעלה ומטה. יש לדגור בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות כדי לדנטורציה מלאה של החלבונים.סבב את הליזטים בצנטריפוגה ב-18,000 ×g ובטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לשקיע את החומר הבלתי מסיס. הנוזל העליון (supernatant), המכיל חלבון מומס שחולץ, מוכן להפרדה באמצעות SDS PAGE וניתוח Western blot עוקב. לחלופין, ניתן לאחסן את הליזטים בטמפרטורה של 20- °C.את היציבות של Deg1-Sec62, סובסטרט מודל לפירוק הקשור לרשתית התוך-פלזמית (ERAD) בשמרים, ניתחו באמצעות שיטת cycloheximide chase. חלבון Deg1-Sec62 נודד ב-SDS PAGE כמינים מרובים ומעבר לפירוק מהיר בתאים מסוג בר (wild-type). Pgk1 משמש כבקרת טעינה ששכיחותו אינה משתנה בתנאי הבדיקה.אובדן של הליגאז של יוביקוויטין השוכן ב-ER, hrd1, או של האנזים המצמד יוביקוויטין, ubc7, ייצב באופן משמעותי את החלבון Deg1-Sec62, מה שמאשש את תפקידם שנצפה בעבר של חלבונים אלו בפירוק Deg1-Sec62. Cue1 הוא חלבון טרנס-ממברנלי המעגן את ubc7 לממברנת ה-ER ומפעיל את האנזים, אך הצורך ב-cue1 עבור פירוק Deg1-Sec62 לא נחקר באופן ישיר. התצפית ממחקר זה, לפיה Deg1-Sec62 התייצב בהיעדרו של cue1, איששה תפקיד ל-cue1 בפירוק של Deg1-Sec62 הקשור ל-ER.את התוצאה מה-Western blot כימתו באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות. כדי להשוות את שפע חלבון Deg1-Sec62 בין הדגימות, נקבע עבור כל דגימה יחס בין עוצמות האות המתואמות של Deg1-Sec62 לבין Pgk1. חשוב לזכור שפרוצדורה זו משקפת באופן הישיר ביותר את קינטיקת הפירוק של אוכלוסיית מצב יציב (steady state) של חלבון העניין.כדי להדמין את הפירוק של אוכלוסייה ראשונית של חלבון עניין, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון ניסויי pulse-chase. זכרו כי cycloheximide ו-sodium azide הם רעילים ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר עם כימיקלים אלה בעת ביצוע פרוצדורה זו.

cycloheximide-chase-analysis-protein-degradation-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר בדיקת פירוק עבור חלבונים שאינם מקופלים כהלכה באמצעות טיפול cycloheximide יחד עם שבר דטרגנט. שיטה זו מסייעת בחקר הדינמיקה של חלבונים שאינם מקופלים כהלכה ובחשיפת המנגנונים המעמיקים של תחלופת החלבונים.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

סרטון זה מתאר בדיקת מיקרו-צלחות מבוססת פלואורסצנטיות במבחנה כדי לחקור את קינטיקה הפירוק של חלבון מוטנטי לוציפראז מקופל בצורה פלואורסצנטית המבוטא בגרעינים של תאי יונקים נגועים. הבדיקה כוללת טיפול בתאים המבטאים את החלבון המוטנטי הפלואורסצנטי עם מעכב תרגום ומעכב פרוטאזום כדי להעריך את הפירוק בתיווך פרוטאזום של החלבון המקופל בצורה שגויה.

Fluorescence Microplate-Based Cycloheximide Chase Assay: טכניקה לניטור קינטיקה של פירוק חלבונים גרעיניים פלואורסצנטיים שאינם מקופלים כהלכה

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ביעילות ובמיוחד לרוקן חלבון של עניין השמרים סכביסיטאה cerevisiae ס באמצעות מערכת העזרה β-est.

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למדו לחקור פירוק חלבונים בשמר האפייה Saccharomyces cerevisiae באמצעות שיטת צ'ייס ציקלוהקסימיד ו-Western blotting. שיטה זו מאפשרת ניתוח יעיל של יציבות חלבונים ללא שימוש באיזוטופים רדיואקטיביים או שלבי אימונו-פרסיפיטציה ממושכים.

Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב

גלה סרטונים נוספים