Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים ויזואלית את הפירוק של אוכלוסיית מצב היציב של חלבון ספציפי ב-Saccharomyces cerevisiae. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את הדרישות הגנטיות ואת ההשפעות הסביבתיות על פירוקו של חלבון מסוים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאין בה צורך באיזוטופים רדיואקטיביים או בשלבי אימונו-פרסיפיטציה ממושכים, בניגוד לטכניקות pulse-chase, המשמשות גם הן להדגמה ויזואלית של פירוק חלבונים.

ניתן להשתמש בנוהל זה כדי לנתח חלבון שמרים אנדוגני או חלבון המבוטא מפלסמיד. במקרה האחרון, מאמיר השמרים עובר טרנספורמציה באמצעות פלסמיד המקודד עבור החלבון הנחקר, וזאת בהתאם לפרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי לשמרים. יש להחדיר את השמרים לחמישה מיליליטר של מצע מתאים.

דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius תוך סיבוב. למחרת בבוקר, מדדו את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 nanometers, או OD600, של כל תרבית לילה. דללו את התרביות ל-OD600 של 0.2 ב-15 milliliters של מצע טרי.

דגרו בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור עד שהתאים יגיעו לשלב גדילה לוגריתמי בינוני. בזמן ששמרי השמרים גדלים, הכינו את הפרוצדורה למעקב עם ציקלוהקסימיד (cycloheximide chase). הגדירו בלוק חימום המתאים למבחנות קוניות של 15 ml לטמפרטורה של 30 °C לצורך דגירת התאים בנוכחות ציקלוהקסימיד.

כדי להבטיח פיזור חום יעיל לתרביות, הוסיפו מים לכל באר בבלוק החימום כך ששפופרת קונית של 15 milliliter תגרום למפלס המים לעלות עד לשפת הבאר, אך לא לגלוש ממנה. הגדירו בלוק חימום שני, המתאים לשפופרות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 milliliter, ל-95 degrees Celsius לצורך דנטורציה של חלבונים לאחר ליזיס של התאים. חממו מראש מצע גידול טרי ל-30 degrees Celsius.

נדרשים 1.1 milliliters של מדיום לכל נקודת זמן עבור כל תרבית שתיבחן. הוסף 50 microliters של 20x Stop Mix למבחנות מיקרוצנטריפוגה מסומנות מראש. הכן מבחנה אחת לכל נקודת זמן עבור כל תרבית שתיבחן.

הנח את המבחנות על קרח. כאשר תאי השמרים הגיעו לשלב גידול לוגריתמי בינוני (mid-logarithmic growth), אסוף 2.5 יחידות OD600 מכל תרבית עבור כל נקודת זמן שתיבדק. יחידה אחת של OD600 שווה לכמות השמרים הנמצאת במיליליטר אחד של תרבית ב-OD600 של 1.0.

סבב במרכזפוגה את התאים שנאספו במבחנות קוניות של 15 milliliters ב-3,000 ×g בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הסר את הנוזל העליון (supernatant). השהה מחדש כל משק осаח של תאים ב-1 milliliter של מצע גידול טרי בטמפרטורה של 30 °C עבור כל 2.5 יחידות של OD600 של תאים.

לפני תחילת ה-cycloheximide chase, יש להביא את תרחיפי תאי השמרים לשיווי משקל על ידי דגירה בבלוק חימום של 30 degree Celsius למשך חמש דקות. ההיבט המאתגר ביותר בהליך זה הוא תזמון הוספת ה-cycloheximide ואיסוף התאים עבור כל דגימה. אנו מבטיחים את הצלחת הפעולה על ידי קביעה והיצמדות ללוח זמנים להוספת ה-cycloheximide ולאיסוף התאים.

כדי להתחיל את מרדף הציקלוהקסימיד (cycloheximide chase), לחצו על "Start" בטיימר. הוסיפו במהירות אך בזהירות ציקלוהקסימיד לריכוז סופי של 250 µg/mL לתשסוף תאי השמרים הראשון וערבבו קצרות באמצעות וורטקס. העבירו מיד 950 µL, או כ-2.4 יחידות OD600, של תשסוף תאי השמרים עם הציקלוהקסימיד למבחנה של מיקרוצנטריפוגה המסומנת מראש ומכילה 50 µL של Stop Mix בריכוז 20x מקורר בקרח.

ערבבו את מבחנת המיקרוצנטריפוגה ב-Vortex והניחו על קרח עד שכל הדגימות ייאספו. התחילו את שלב המרדף (chase) עם cycloheximide עבור כל אחת מתשלויות תאי השמרים הנותרות במרווחי זמן קבועים, כפי שהודגם. בכל נקודת זמן עוקבת, ערבבו את תשלויות תאי השמרים ב-Vortex והעבירו 950 µL למבחנות מיקרוצנטריפוגה מסומנות המכילות 50 µL של 20x Stop Mix שקולל מראש.

ערבבו במכשיר וורטקס והניחו את התאים שנאספו על קרח. כדי למנוע שקיעה של תאי השמרים, ערבבו במכשיר וורטקס את תהלילי התאים באנבונות הקוניות בנפח 15 מיליליטר בערך כל חמש דקות לאורך כל מהלך המרדף (chase). לאחר איסוף כל הדגימות, השקיעו את התאים שנאספו על ידי סנטריפוגציה במהירות של 6,500 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 30 שניות.

הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפט או שאיבה. התאים מוכנים כעת לליזה בסיסית. הכן את התאים לליזה בסיסית על ידי הוספת 100 microliters של מים מזוקקים לכל משקע תאים, וערבב מחדש על ידי פיפטור מעלה ומטה.

הוסיפו 100 µL של sodium hydroxide בריכוז 0.2 molar לכל דגימה. ערבבו באמצעות vortex. הדגירו את התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

בשלב זה, תאי השמרים טרם עברו ליזיס, וחלבונים טרם שוחררו. בשלב הבא, יש לשקע את התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-18,000 ×g בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. יש להסיר את העלייה (supernatant) באמצעות פיפט או שאיבה.

כדי ללייס את התאים, יש להוסיף 100 µL של Laemmli Sample Buffer לכל משקע תאים. יש להחזיר לתליה על ידי פיפוט מעלה ומטה. יש לדגור בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות כדי לדנטורציה מלאה של החלבונים.

סבב את הליזטים בצנטריפוגה ב-18,000 ×g ובטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי לשקיע את החומר הבלתי מסיס. הנוזל העליון (supernatant), המכיל חלבון מומס שחולץ, מוכן להפרדה באמצעות SDS PAGE וניתוח Western blot עוקב. לחלופין, ניתן לאחסן את הליזטים בטמפרטורה של 20- °C.

את היציבות של Deg1-Sec62, סובסטרט מודל לפירוק הקשור לרשתית התוך-פלזמית (ERAD) בשמרים, ניתחו באמצעות שיטת cycloheximide chase. חלבון Deg1-Sec62 נודד ב-SDS PAGE כמינים מרובים ומעבר לפירוק מהיר בתאים מסוג בר (wild-type). Pgk1 משמש כבקרת טעינה ששכיחותו אינה משתנה בתנאי הבדיקה.

אובדן של הליגאז של יוביקוויטין השוכן ב-ER, hrd1, או של האנזים המצמד יוביקוויטין, ubc7, ייצב באופן משמעותי את החלבון Deg1-Sec62, מה שמאשש את תפקידם שנצפה בעבר של חלבונים אלו בפירוק Deg1-Sec62. Cue1 הוא חלבון טרנס-ממברנלי המעגן את ubc7 לממברנת ה-ER ומפעיל את האנזים, אך הצורך ב-cue1 עבור פירוק Deg1-Sec62 לא נחקר באופן ישיר. התצפית ממחקר זה, לפיה Deg1-Sec62 התייצב בהיעדרו של cue1, איששה תפקיד ל-cue1 בפירוק של Deg1-Sec62 הקשור ל-ER.

את התוצאה מה-Western blot כימתו באמצעות תוכנה לעיבוד תמונות. כדי להשוות את שפע חלבון Deg1-Sec62 בין הדגימות, נקבע עבור כל דגימה יחס בין עוצמות האות המתואמות של Deg1-Sec62 לבין Pgk1. חשוב לזכור שפרוצדורה זו משקפת באופן הישיר ביותר את קינטיקת הפירוק של אוכלוסיית מצב יציב (steady state) של חלבון העניין.

כדי להדמין את הפירוק של אוכלוסייה ראשונית של חלבון עניין, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון ניסויי pulse-chase. זכרו כי cycloheximide ו-sodium azide הם רעילים ביותר ויש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר עם כימיקלים אלה בעת ביצוע פרוצדורה זו.