יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric
3 במאי 2016
עלייה הקשורה לגיל בנוקשות עדשות העיניים קשורה לפרסביופיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית למדידת קשיחות עדשת העכבר. עדשות עכבר, כמו עדשות אנושיות, נעשות נוקשות יותר עם הגיל. שיטה זו מדויקת וניתנת להתאמה לעדשות מבעלי חיים גדולים יותר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את קשיחות הדחיסה והגיאומטריה של עדשות עכבר בגישה פשוטה וזולה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום העדשות. כגון כיצד הפרעות גנטיות וניסיוניות שונות משפיעות על התכונות הביומכניות של העדשה.
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מדויקת, ניתנת לשחזור ואינה דורשת ציוד יקר או מיוחד. שיטה זו מספקת תובנה לגבי המאפיינים של עדשות עכברים, עם יישום פוטנציאלי לאורגניזמים מודלים גדולים יותר כמו חולדות וארנבות. הדמיה של השיטה היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי חיתוך העדשות ויישום הכיסוי ללא הדגמה.
מי שתדגים את ההליך תהיה קתרין צ'נג, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחל את הדיסקציה באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי ללחוץ על הרקמה סביב העין של עכבר שעבר המתת חסד ולהוציא את העין מהשקעה. לאחר מכן, הסר את העין והניח אותה בכלי חיתוך המכיל PBS טרי תחת מיקרוסקופ ניתוח.
חתכו את עצב הראייה קרוב ככל האפשר לגלגל העין. והכניסו בעדינות ובזהירות פינצטה עדינה וישרות לגלגל העין דרך החור שבו עצב הראייה יוצא מהחלק האחורי של האיבר. בצע בזהירות חתך במספריים מהחלק האחורי לקצה הקרנית, והקפיד לא לפגוע בעדשה.
המשיכו את החתך לאורך המפגש בין הקרנית לסקלרה, לפחות באמצע גלגל העין. ולחץ בעדינות על הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ישרים עם קצה דק כדי להסיר בזהירות כל פסולת גדולה שעדיין מחוברת לעדשה.
ואשר חזותית שהעדשה נקייה מנזק. לפחות שעתיים לפני תחילת מדידות הנוקשות, השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול לפחות 10 פתקי כיסוי מאותה קופסה. קבע את המשקל הממוצע של החלקות הכיסוי.
לאחר מכן, הרטיבו מראש את החלקות הכיסוי ומראה בזווית ישרה ב-PBS בטמפרטורת החדר. בזמן שהחומרים עוברים לחות, מלאו את תא המדידה ב-65 עד 75 מיליליטר PBS. והנח את החדר תחת מיקרוסקופ מנתח המכוון להגדלה של פי 30, עם תאורה מלמטה ומקור אור סיבים אופטיים בצד שמאל וימין.
כאשר החלקות הכיסוי מוכנות, הנח את המראה בזווית הנכונה לתוך החדר במרחק קבוע מהחריץ שישמש להחזקת העדשה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מעוקלים, העבירו בזהירות את העדשות המנותחות לתא המדידה. הגדר את ספק הכוח האופטי ל-80% מעוצמת האור המקסימלית, והתאם את תפוקת אספקת החשמל בהתאם לתאורת הסביבה, העדפת המשתמש ואיכות התמונה לפי הצורך.
השג תמונות מלמעלה view של העדשות הפרוקות ישירות מעל החדר. לאחר מכן, צלם תמונה של קצה המראה בפוקוס, ואחריה תמונת מבט מהצד של העדשה הפרוקה דרך המראה מחוץ לשקע. לאחר מכן, הנח עדשה לתוך הדיווט, וודא שהעדשה יושבת בצורה מאובטחת וישרה בתוך הדיוות על הקוטב הקדמי או האחורי שלה.
צלם את העדשה במראה. לאחר מכן, הנח בעדינות את החלקת הכיסוי על העדשה. לאחר שתי דקות, צלם תמונה נוספת מהצד של העדשה הטעונה.
המשך להוסיף פתקי כיסוי, וקבל תמונות צד view שתי דקות לאחר הוספת כל פתק כיסוי, עד להחלת סך של 10 פתקי כיסוי. לאחר מכן, הסר את כל פתקי הכיסוי, המתן שתי דקות אחרונות וקבל תמונות צד של העדשה בתוך ומחוץ לדיווט. ותמונת מבט עליונה של העדשה מחוץ לשקע.
כדי לקבוע את גודל גרעין העדשה, הנח עדשה בצלחת פטרי נקייה מלאה ב-PBS והשתמש במלקחיים עדינים וישרים כדי להסיר בעדינות את העדשה. כדי לנתק את תאי הסיבים בקליפת המוח, גלגל את העדשה בין אצבעות הכפפות. לאחר מכן, שטפו בעדינות את גרעין העדשה ב-PBS והניחו את הגרעין בחזרה לתוך תא המדידה.
רכוש תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית הישרה. לבסוף, כדי לנתח את התמונות, השתמש בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה כדי למדוד את הקוטר המשווני והצירי של העדשות לפני ואחרי כל שלב טעינה. מדוד גם את הקוטר של כל גרעין עדשה.
בניסוי מייצג זה נמדדו הנוקשות והממדים של עדשות עכבר בנות חודשיים, ארבעה ושמונה חודשים וחושבו הזנים הציריים והמשווניים. המתח הצירי הוא פונקציה לוגריתמית של עומס מופעל עם ירידה מובהקת סטטיסטית, תלוית גיל בזנים הציריים והמשווניים תחת העומס המרבי המופעל, מה שמצביע על כך שעדשת העכבר מתקשה עם הגיל. נתוני התמונה שנאספו במהלך ניסוי זה שימשו גם לקביעת מספר מאפיינים מורפולוגיים אחרים של העדשה.
כצפוי, הקוטר הצירי והמשווני, ונפח העדשה, גדלו עם הגיל. יחס הגובה-רוחב מצביע על כך שלעדשה יש קוטר משווני מעט גדול יותר מקוטר צירי. ופרמטר זה לא השתנה עם הגיל.
הקוטר, הנפח והחלק של גרעין העדשה גדלים עם הגיל, מה שמרמז על כך שגרעין העדשה מתעצב מחדש כדי לגדול בגודלו היחסי ככל שהעדשה מזדקנת. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 30 עד 45 דקות לכל עדשה, אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב למקם את העדשה באופן שווה בתוך החריץ, ולאפשר לעדשה להירגע במתח למשך שתי דקות בין כל החלקת כיסוי נוספת.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את קשיחות הדחיסה והמורפומטריה של עדשות עכבר באמצעות יישום רציף של פתקי כיסוי. טכניקה מדויקת, פשוטה וזולה זו סוללת את הדרך לחוקרי עדשות לחקור את ההשפעות הביומכניות של מוטציות גנטיות בעכברים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית למדידת קשיחות עדשות עכבר, אשר, בדומה לעדשות אנושיות, מגדילות את קשיחותן עם הגיל. הטכניקה מדוייקת וניתנת להתאמה לשימוש בעדשות מבעלי חיים גדולים יותר.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- ביומכניקה
רקע
- עלייה בקשיחות העדשה הקשורה לגיל קשורה לפרסביופיה.
- הבנת התכונות הביומכניות של העדשה חיונית לטיפול בבעיות ראייה.
- עדשות עכבר משמשות מודל לחקר קשיחות העדשה וההשלכותיה.
- ניתן ליישם את השיטה על אורגניזמים מודליים גדולים יותר, מה שמגדיל את הרלוונטיות שלה.
מטרת המחקר
- להעריך את הקשיחות הדחיסתית והגיאומטריה של עדשות עכבר.
- לחקור כיצד גורמים גנטיים וניסויים משפיעים על תכונות העדשה.
- לספק שיטה ניתנת לשחזור שאינה דורשת ציוד יקר.
שיטות ששימשו
- מדידת הקשיחות הדחיסתית של עדשות עכבר.
- הערכת הגיאומטריה של העדשה.
- יישום גישה פשוטה וחסכונית.
- המחשה של טכניקות ניתוח העדשה והחלת הזזת הכיסוי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מפגינה דיוק ושחזור בלתי אמצעי בעת מדידת קשיחות העדשה.
- התובנות המתקבלות יכולות להעיד על מחקרים על תכונות העדשה במינים שונים.
- ההמחשה מסייעת בהבנת טכניקות ניתוח מורכבות.
- יישומים פוטנציאליים מתרחבים למודלי בעלי חיים גדולים יותר.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תובנות חשובות לגבי הביומכניקה של העדשה.
- זהו כלי חסכוני לחוקרים בתחום.
- מחקרים נוספים יכולים לנצל גישה זו לחקר השפעות גנטיות וניסויות על תכונות העדשה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of lens compressive stiffness using sequential glass coverslips enables precise biomechanical characterization in genetically engineered mouse models. This reproducible, scalable method supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular disease research. Its cost-effectiveness and adaptability position it as a reusable capability for preclinical R&D pipelines focused on lens pathologies and age-related biomechanical changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic and experimental perturbations on lens biomechanics.
- Supports functional target validation by quantifying age- and mutation-dependent changes in lens stiffness.
- Facilitates mechanistic de-risking for ocular disease models by providing direct biomechanical readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ex vivo lens systems for downstream compound or genetic screening.
- Delivers standardized, quantitative strain and morphometric outputs for assay reproducibility.
- Supports scalability and platform reuse across different animal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by modeling age-related biomechanical changes relevant to human lens pathologies.
- Enables continuity from genetic discovery to preclinical validation in lens research.
- Provides predictive confidence for advancing lens-targeted interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational modeling.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical effects of genetic or experimental manipulations in mouse lenses.
- Screening: Offers reproducible, quantitative strain and morphometric measurements for assay development.
- Analytics: Provides statistical outputs for comparing age groups, genotypes, or interventions.
- Translational Research: Models age-related lens stiffening, informing biomarker alignment for human disease.
- Enterprise Reuse: Adaptable for larger animal models, supporting cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lens biomechanics.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biomechanical assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ocular portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and interventions for lens pathologies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lens dissection and precise application of compressive loads.
- Needs basic imaging and analytical infrastructure for morphometric analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across studies and models.
- Adaptable to larger animal models with protocol adjustments.
- Dependent on careful handling to avoid lens damage and ensure data quality.
