Name: יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למדו כיצד להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות עכבר באמצעות שיטה פשוטה וזולה. טכניקה זו מאפשרת חקר תכונות ביומכניות של עדשות ויישום במודלים גדולים יותר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכון הלאומי לעיניים R01 EY017724 (VMF) והמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ומחלות עור K99 AR066534 (DSG).

הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם ההמלצות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות ותחת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במכון המחקר סקריפס. 1. עדשות Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על פי המלצות המכונים הלאומיים לבריאות &quot;מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה&quot; ופרוטוקולי שימוש בבעלי חיים במוסד שאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate העין מעכברים באמצעות מלקחיים מעוקלים. לדכא את הרקמה סביב העין עם מלקחיים כדי להביא את העין מתוך השקע, ואז לקטוף את העין מהשקע עם מלקחיים. עבר עיניים בופר פוספט 1x הטרי (PBS) בצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עצב הראייה קרוב גלגל העין ככל האפשר. בעדינות ובזהירות להכניס פינצטה ישר עדין אל תוך גלגל העין דרך wher חורדואר עצב הראייה יוצא האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות עושים חתך במספריים לתוך גלגל העין מן אחורי אל הקצה של הקרנית. עדשות מכרסמות לכבוש ~ 30% של העין. ודא חתכים אלה בזהירות, ואל תכניס פינצטה או מספריים עמוק מדי לתוך העין כדי למנוע נזק העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לאורך המפגש בין הקרנית בלובן העין בבית חצי הדרך לפחות סביב גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף בעדינות את הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח שנעשה צעדי 1.4 ו -1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים ישר טיפ נאים כדי להסיר כל פסולת גדולה בזהירות כי הוא עדיין מחובר העדשה. ראייה לבדוק את העדשה לכל נזק לפני שתמשיך המדידות נוקשות. </li></ol> 2. מדידות נוקשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול לפחות 10 coverslips מאותה תיבה באמצעות איזון אנליטיים. מצא את המשקל הממוצע של coverslips. לקבלת עקביות, השתמש באותה קופסת coverslips עבור כל הניסויים. טרום רטובבמראה coverslips ו-זווית ישרה ב PBS 1x בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 2 לפני תחילת הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את החדר המדיד (ראה איור 1) עם 65 - 75 מיליליטר של 1x PBS. תא המדידה נעשה מתוך פרספקס ידי חנות מכונת in-house, ואת divots בתא נעשה על ידי מקדחה מוגדרת לעומק הרצוי עם מקדח מתאים. עדשות לשמור על שקיפות ב 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך בדיקות מכניות. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig1.jpg" /> איור 1:. נוקשות מדידת לשכת תצלום מראה את הממדים של חדר המדידה נוקשת מחוייט עם מגוון רחב של divots עומקים שונים ובצורות שונות. Divots העגול 200 מיקרומטר או 300 מיקרומטר עמוק (ראשי חץ צהובים) משמש את המידות על עדשות עכבר. Divots הם 2 מ&quot;מ בקוטר ~ 13-. 14 מ&quot;מ מהקצה של החדר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים המראים בזווית ישר לתוך התא במרחק קבוע מן השקע אשר ישמש כדי להחזיק את העדשה. ודא במראה לא זז במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדשות העברת גזור לתא מדידה בקפידה עם מלקחיים לתפוס או מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה עליונה לאור העדשה פרקה ישר מלמעלה. קח תמונות העדשה העכבר 30X הגדלה עם תאורה מ מיקרוסקופ לנתח (למטה) ומקור אור סיבים אופטיים על הצדדים על ימין ועל שמאל. הגדר את אספקת החשמל סיבים אופטיים עד 80% של עוצמת האור המקסימלית. התאם את פלט אספקת החשמל מבוסס על תאורה מפוזרת, העדפות המשתמש ואת איכות התמונה לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונת נוף בצד של העדשה לא הטעונה, אשר ניתן לראות דרך רימראה ght-זווית. אם המצלמה אינה מכוילת, לצלם תמונה של הקצה המראה בפוקוס. קצה המראה באורך 5 מ&quot;מ, מדידה זו ניתן להשתמש מאוחר יותר כדי לקבוע את הפיקסלים / מ&quot;מ ולשמש סרגל קנה המידה של תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדשת מקום לתוך השקע, ולאשר כי העדשה מונחת כהלכה ו ישר את השקע. קח תמונה של העדשה לפני הטעינה. העדשה צריכה להיות נחה את השקע על הקדמי שלה או בקוטב אחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 coverslip בעדינות על העדשה. חכה 2 דקות כדי לאפשר שרץ, ולקחת עוד תמונת הצד להציג של העדשה הטעונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממשיכים להוסיף coverslips כמו בשלב 2.8 וצילמו-מבט מהצד לאחר תוספת של כל coverslip כמו בשלב 2.8 עד סך של 10 coverslips מוחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל coverslips. חכה 2 דקות, ולצלם תמונת נוף בצד של העדשה (ומחוץ לה את השקע) לאחר הסרת כל coverslips. </li></ol> 3. מדידת העדשה Nucleus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי determine בגודל גרעין העדשה, להזיז את העדשה אל צלחת נקייה פטרי מלא 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות decapsulate העדשה באמצעות מלקחיים ישר בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיל את תאי סיבי קליפת המוח על ידי גלגול העדשה בין אצבע עטוית כפפה. גרעין העדשה הנותר ירגיש כמו גולה קשה. השתמש בהליך זה כדי לבודד את הגרעין על עדשות מבוגרות מתחיל ב -1 לחודש של גיל. מאז הגרעין המבודד הוא גוף נוקשה, בדיקה מכאנית נוספת של גרעין העדשה לא יכולה להתבצע באמצעות שיטה מתוארת זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את גרעין העדשה 1x PBS בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גרעין העדשה בחזרה לתוך תא המדידה (לא את השקע), ולקחת תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית ישרה. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53986/53986fig2.jpg" /> איור 2:. עדשות עכבר דחוסים ידי Coverslips (א) סכמטי ו- (ב) תצלום של האקסהתקנת perimental מראה עדשת עכבר 2 בן חודש בתוך שקע 200 מיקרומטר עמוק בתוך תא המדידה מלא 1x PBS. מראה זווית נכונה ומצלמה דיגיטלית רכובה על מיקרוסקופ לנתיחה שמשו כדי לאסוף תמונות של העדשה במהלך דחיסה על ידי coverslips. (C) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type 2-בן חודש הדחוסה על ידי מספר הגדל והולך של coverslips ברציפות ספקו את הנתונים הגולמיים למדידת קטרים ​​ציריים משווניים וחישוב זנים ציריים משווניים במהלך בדיקת דחיסה מבוססת coverslip. השתקפות של העדשה ניתן לראות לפעמים את coverslips (רוב נראה בבירור בתמונה 1 coverslip). בעת ביצוע מדידות, להתעלם ההשתקפות ולמדוד אל הקודקוד של העדשה. (ד) תמונות של נופי sagittal של עדשת wild-type בן חודש 2-דחיסת הדואר ועל גרעין העדשה המבודד. עדשת פוסט-דחיסת הגרעין מבודד ישב מחוץ את השקע. ברי סולם, 1 מ&quot;מ. נתון זה שונה מן Gokhב, et al. PLoS ONE, 2012 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53986/53986fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ניתוח תמונה 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד בקטרים ​​משווניים ו ציריים של עדשות לפני טעינה ואחרי כל שלב טעינה באמצעות ImageJ או תוכנה דומה. מדוד את הקוטר של כל גרעין העדשה. גרעין העדשה כמעט כדורי כך מדידה בכל אורינטציה תספיק 19,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העדשה צירית בקטרים ​​ידי הוספת עומק השקע בשימוש. בתא המדידה, את השקע הסתיר 200 מיקרומטר (עדשות עכבר 2-בן חודש) או 300 מיקרומטר (4 בן חודש ו -8 חודשים ישנות עדשות עכבר) של העובי הצירי של העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את צירית זנים משווניים מן מדידות קוטר עדשה באמצעות המשוואה, ε = (d - d 0) / ד 0, שם ε הוא זן, d הוא צירי או דוארקוטר quatorial בעומס נתון, ד 0 הוא בקוטר צירי או משווני המקביל בעומס אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את צירית זנים משווניים כפונקציה של העומס המוטל (במ&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את צירי, הקו משווה ובקטרים ​​גרעיניים. לחשב ולתכנן את יחס ממדי עדשה על ידי חלוקה בקוטר הצירי ידי הקוטר המשווני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את היקף העדשה באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r E 2 × r A, כאשר r E הוא רדיוס r המשווני הוא הרדיוס הצירי נמדד על פי התמונה לקחה צעד 2.6. משוואה זו מניחה העדשה היא אליפטית oblate (אליפסואיד) 1,22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את היקף גרעיני באמצעות המשוואה, נפח = 4/3 × π × r N 3, כאשר r N הוא רדיוס של גרעין העדשה כפי שהן נמדדות תמונה לקחה צעד 3.5. משוואה זו מניחה את i גרעין העדשהsa בתחום 19,21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את השבר גרעיני כיחס בין היקף גרעיני בהיקף העדשה. </li></ol>

<ol><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+ocular+lens%22">Development of the ocular lens</a>. , Cambridge University Press. (2004).</li>
<li>Piatigorsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+differentiation+in+vertebrates.+A+review+of+cellular+and+molecular+features%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features.</a> Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).</li>
<li>Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+accommodation%3A+surgical+options+for+correction+of+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia.</a> Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).</li>
<li>Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeeney%2C+AH+%22Dictionary+of+ophthalmic+optics%22">Dictionary of ophthalmic optics</a>. , Butterworth-Heinemann. (1995).</li>
<li>Millodot, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillodot%2C+M+%22Dictionary+of+optometry+and+visual+science%22">Dictionary of optometry and visual science</a>. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).</li>
<li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age%3A+the+basis+for+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Mol Vis. 10, 956-963 (2004).</li>
<li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+heat%3A+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein%2C+alpha-crystallin%2C+in+maintaining+lens+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li>
<li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).</li>
<li>Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li>
<li>Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).</li>
<li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+the+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of the human lens.</a> Exp Eye Res. 11 (1), 143(1971).</li>
<li>Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+increase+in+accommodative+potential+after+neodymium%3A+yttrium-aluminum-garnet+laser+photodisruption+of+paired+cadaver+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses.</a> Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).</li>
<li>Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+spinning+lens+test+to+determine+the+stiffness+of+the+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens.</a> Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).</li>
<li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+the+optical+changes+in+the+human+crystalline+lens+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age.</a> Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).</li>
<li>Pau, H., Kranz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+sclerosis+of+the+human+lens+with+age+and+its+relevance+to+accommodation+and+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).</li>
<li>Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+elasticity+in+human+lenses+using+bubble-based+acoustic+radiation+force%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force.</a> Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).</li>
<li>Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lens+stiffness+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse lens stiffness measurements.</a> Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
<li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li>
<li>Fudge, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+filaments+regulate+tissue+size+and+stiffness+in+the+murine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).</li>
<li>Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+modeling+of+secondary+fiber+development+and+growth%3A+I.+Nonprimate+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses.</a> Mol Vis. 12, 251-270 (2006).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+age-related+stiffening+in+the+crystalline+lens+by+Brillouin+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy.</a> Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

ישנם מספר שיקולים מרכזיים בעת שימוש בשיטה זו כדי למדוד נוקשות עדשה. ראשית, coverslips מוחלים על העדשה בזווית אלכסונית מעט (8 - 8.5 °) ביחס לחלק התחתון של החדר (θ). זה יחול מרכיב קטן מאוד של עומס equatorially ולא axially. עם זאת, עומס משווני זה נחשב זניח בגלל חטא θ ≈ 0.1 19. אם שיטה זו מותאמת עבור עדשות גדולות, את הזווית של coverslips אל החלק התחתון של החדר היה צריכה להימדד על מנת לקבוע האם עומס משווני יש בחשבון חישובי זן. שנית, חשוב לאפשר את העדשה כדי לאזן לאחר תוספת של...

העדשה היא איבר שקוף וכלי דם בחדר הקדמי של העין האחראי על מיקוד עדין של האור על הרשתית. קרום בסיס שקוף, הנקרא קפסולת העדשה, מקיף כמות גדולה של תאי סיבים מוארכים המכוסים בשכבה חד-שכבתית קדמית של תאי אפיתל1,2. צמיחה לכל החיים של העדשה תלויה בשגשוג ובהתמיינות מתמשכת של תאי אפיתל בקו המשווה של העדשה לתאי סיבים חדשים המתווספים לדורות קודמים של תאי סיבים באופן קונצנטרי2. עם הזמן, תאי סיבי העדשה עוברים דחיסה, וכתוצאה מכך נוצר מרכז קשיח באמצע העדשה הנקרא גרעין1. התאמה, המוגדרת כשינוי דיופטרי בכוח האופטי של העין, מתרחשת בבני אדם כאשר שרירי הריסים מתכווצים כדי לעוות את העדשה ולאפשר עלייה אמיתית בכוח האופטי להתמקד בעצמים קרובים3-5. בעין הלא מותאמת, העדשה מוחזקת במצב שטוח יחסית עקב מתח מסיבים אזוריים. כאשר השרירים הריריים מתכווצים, המתח על העדשה משתחרר, מה שמוביל לירידה בקוטר קו המשווה של העדשה ולעלייה בעובי הצירי. שינויים הקשורים לגיל בעדשה גורמים לפרסביופיה, אובדן מתקדם של התאמות העדשה, מה שמוביל לצורך במשקפי קריאה. 
מספר מחקרים קשרו פרסביופיה לעלייה הקשורה לגיל בנוקשות הפנימית של העדשה6-11. קשיחות מוגדרת כהתנגדות של חפץ אלסטי להתעוות בעומס מופעל. נעשה שימוש במגוון שיטות לבחינת קשיחות של עדשות אנושיות, כולל דחיסת ספין12-14, דחיסת מפעיל15, כניסת בדיקה16, ניתוח מכני דינמי 6,10 וכוח קרינה אקוסטית מבוסס בועות17. בעוד שעדשות עכבר אינן מתאימות או מפתחות פרסביופיה, מודלים של עכברים לפתולוגיות עדשות הם כלים יקרי ערך מכיוון שעכברים זולים יותר מבעלי חיים גדולים יותר, מאופיינים היטב מבחינה גנטית ועוברים שינויים מואצים הקשורים לגיל עקב הזדקנות מהירה. קומץ מחקרים בחנו את נוקשות עדשות העכבר בשיטות דחיסה והדגימו שינויים בנוקשות העדשות עקב הזדקנות או הפרעות גנטיות ממוקדות18-21. לפיכך, עדשות עכבר הן מודלים טובים לחקר שינויים הקשורים לגיל בנוקשות העדשות. 
פרוטוקול זה מתאר שיטת דחיסה פשוטה וזולה, אך מדויקת וניתנת לשחזור, לקביעת קשיחות עדשת העכבר המבוססת על יישום כיסויי זכוכית על העדשה בשילוב עם צילום העדשה דרך מיקרוסקופ דיסקציה ומראה. שיטה זו מניבה מתח חזק ונתונים מורפומטריים עם מכשיר קל לייצור והרכבה. התוצאות המייצגות מאשרות כי עדשות עכבר עולות בנוקשות עם הגיל.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים ישרים עם קצה עדין</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-דיסקציה, קצה ישר</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>תפיסת מלקחיים</td><td>Hammacher</td><td>HSC 702-93</td><td></td></tr><tr><td>צלחת דיסקציה</td> אופציונלית <td>Fisher Scientific</td><td>12565154</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 x 18 מ"מ כיסויי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>תא מדידה עם חריצים להחזקת</td><td></td><td></td> עדשות <td>בהתאמה אישית (ראה <חזק>איור 1</חזק>)</td></tr><tr><td>מראה בזווית ישרה</td><td>אופטיקה אדמונד</td><td>45-591</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Schott/Fostec</td><td>8375</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח מואר</td><td>אולימפוס</td><td>SZX-ILLD100</td><td>עם מצלמה דיגיטלית SZ-PT Phototube</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Coolpix 990</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום סדרתית של הזכוכית coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

עדשת העין היא איבר שקוף כי ומשגרת ומתמקד אור כדי ליצור תמונה ברורה על הרשתית. אצל בני אדם, שרירים מתכווצים ריסים כדי לעוות את העדשה, מה שמוביל לעלייה בכוחה האופטי &#39;העדשה להתמקד בעצמים קרובים, תהליך המכונה אירוח. גיל הקשורים שינויים נוקשים עדשה קושרו פרסביופיה, הפחתת העדשה &#39;היכולת להכיל, ובהרחבה, את הצורך במשקפי קריאה. למרות עדשות עכבר אינה להתאים או לפתח פרסביופיה, במודלים של עכברים יכולים לספק כלי רב ערך עבור גנטי פתולוגיות עדשת הבנה, וההזדקנות המואצת נצפתה בעכברים מאפשרת הלימוד של שינויים הקשורים בגיל בעדשה. פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה, מדויקת, וחסכונית לקביעת נוקשות עדשת עכבר, באמצעות coverslips זכוכית ליישם ברצף הגדלת עומסי דחיסה על גבי העדשה. נציג נתונים לאשר עדשות העכבר להיות נוקשה עם הגיל, כמועדשות אדם. שיטה זו היא מאוד לשחזור ואף עלול להיות מדורג עד מכנית עדשות מבחן מחיות גדולות יותר.

הנוקשות והממדים של 2, 4 ו 8 חודשים ישני עדשות עכבר נמדדו. עכברים היו כל wild-type חיות על רקע המתח טהור C57BL6 המתקבל מתקן גידול בעלי חיים TSRI, ואת כל עדשה היתה עמוסה 1 עד 10 coverslips. הזנים הציריים משווניים חושבו כפונקציה של עומס המופעל על ידי מדידה הצירית ובקטרי קו משווים של העדשה לאחר התוספת של כל coverslip, ולאחר מכן נרמול כל שינוי בקוטר לקוטר פרקו המקביל. שמונה עדשות מכל גיל נבדקו, והתוצאות באות לידי ביטוי בדברים ± סטיית התקן הממוצעת. כפי ש...

עלייה הקשורה לגיל בנוקשות עדשות העיניים קשורה לפרסביופיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית למדידת קשיחות עדשת העכבר. עדשות עכבר, כמו עדשות אנושיות, נעשות נוקשות יותר עם הגיל. שיטה זו מדויקת וניתנת להתאמה לעדשות מבעלי חיים גדולים יותר.

יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את קשיחות הדחיסה והגיאומטריה של עדשות עכבר בגישה פשוטה וזולה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום העדשות. כגון כיצד הפרעות גנטיות וניסיוניות שונות משפיעות על התכונות הביומכניות של העדשה.היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מדויקת, ניתנת לשחזור ואינה דורשת ציוד יקר או מיוחד. שיטה זו מספקת תובנה לגבי המאפיינים של עדשות עכברים, עם יישום פוטנציאלי לאורגניזמים מודלים גדולים יותר כמו חולדות וארנבות. הדמיה של השיטה היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי חיתוך העדשות ויישום הכיסוי ללא הדגמה.מי שתדגים את ההליך תהיה קתרין צ'נג, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחל את הדיסקציה באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי ללחוץ על הרקמה סביב העין של עכבר שעבר המתת חסד ולהוציא את העין מהשקעה. לאחר מכן, הסר את העין והניח אותה בכלי חיתוך המכיל PBS טרי תחת מיקרוסקופ ניתוח.חתכו את עצב הראייה קרוב ככל האפשר לגלגל העין. והכניסו בעדינות ובזהירות פינצטה עדינה וישרות לגלגל העין דרך החור שבו עצב הראייה יוצא מהחלק האחורי של האיבר. בצע בזהירות חתך במספריים מהחלק האחורי לקצה הקרנית, והקפיד לא לפגוע בעדשה.המשיכו את החתך לאורך המפגש בין הקרנית לסקלרה, לפחות באמצע גלגל העין. ולחץ בעדינות על הקרנית כדי להסיר את העדשה מהעין דרך הפתח. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ישרים עם קצה דק כדי להסיר בזהירות כל פסולת גדולה שעדיין מחוברת לעדשה.ואשר חזותית שהעדשה נקייה מנזק. לפחות שעתיים לפני תחילת מדידות הנוקשות, השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול לפחות 10 פתקי כיסוי מאותה קופסה. קבע את המשקל הממוצע של החלקות הכיסוי.לאחר מכן, הרטיבו מראש את החלקות הכיסוי ומראה בזווית ישרה ב-PBS בטמפרטורת החדר. בזמן שהחומרים עוברים לחות, מלאו את תא המדידה ב-65 עד 75 מיליליטר PBS. והנח את החדר תחת מיקרוסקופ מנתח המכוון להגדלה של פי 30, עם תאורה מלמטה ומקור אור סיבים אופטיים בצד שמאל וימין.כאשר החלקות הכיסוי מוכנות, הנח את המראה בזווית הנכונה לתוך החדר במרחק קבוע מהחריץ שישמש להחזקת העדשה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מעוקלים, העבירו בזהירות את העדשות המנותחות לתא המדידה. הגדר את ספק הכוח האופטי ל-80% מעוצמת האור המקסימלית, והתאם את תפוקת אספקת החשמל בהתאם לתאורת הסביבה, העדפת המשתמש ואיכות התמונה לפי הצורך.השג תמונות מלמעלה view של העדשות הפרוקות ישירות מעל החדר. לאחר מכן, צלם תמונה של קצה המראה בפוקוס, ואחריה תמונת מבט מהצד של העדשה הפרוקה דרך המראה מחוץ לשקע. לאחר מכן, הנח עדשה לתוך הדיווט, וודא שהעדשה יושבת בצורה מאובטחת וישרה בתוך הדיוות על הקוטב הקדמי או האחורי שלה.צלם את העדשה במראה. לאחר מכן, הנח בעדינות את החלקת הכיסוי על העדשה. לאחר שתי דקות, צלם תמונה נוספת מהצד של העדשה הטעונה.המשך להוסיף פתקי כיסוי, וקבל תמונות צד view שתי דקות לאחר הוספת כל פתק כיסוי, עד להחלת סך של 10 פתקי כיסוי. לאחר מכן, הסר את כל פתקי הכיסוי, המתן שתי דקות אחרונות וקבל תמונות צד של העדשה בתוך ומחוץ לדיווט. ותמונת מבט עליונה של העדשה מחוץ לשקע.כדי לקבוע את גודל גרעין העדשה, הנח עדשה בצלחת פטרי נקייה מלאה ב-PBS והשתמש במלקחיים עדינים וישרים כדי להסיר בעדינות את העדשה. כדי לנתק את תאי הסיבים בקליפת המוח, גלגל את העדשה בין אצבעות הכפפות. לאחר מכן, שטפו בעדינות את גרעין העדשה ב-PBS והניחו את הגרעין בחזרה לתוך תא המדידה.רכוש תמונה של גרעין העדשה דרך המראה בזווית הישרה. לבסוף, כדי לנתח את התמונות, השתמש בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה כדי למדוד את הקוטר המשווני והצירי של העדשות לפני ואחרי כל שלב טעינה. מדוד גם את הקוטר של כל גרעין עדשה.בניסוי מייצג זה נמדדו הנוקשות והממדים של עדשות עכבר בנות חודשיים, ארבעה ושמונה חודשים וחושבו הזנים הציריים והמשווניים. המתח הצירי הוא פונקציה לוגריתמית של עומס מופעל עם ירידה מובהקת סטטיסטית, תלוית גיל בזנים הציריים והמשווניים תחת העומס המרבי המופעל, מה שמצביע על כך שעדשת העכבר מתקשה עם הגיל. נתוני התמונה שנאספו במהלך ניסוי זה שימשו גם לקביעת מספר מאפיינים מורפולוגיים אחרים של העדשה.כצפוי, הקוטר הצירי והמשווני, ונפח העדשה, גדלו עם הגיל. יחס הגובה-רוחב מצביע על כך שלעדשה יש קוטר משווני מעט גדול יותר מקוטר צירי. ופרמטר זה לא השתנה עם הגיל.הקוטר, הנפח והחלק של גרעין העדשה גדלים עם הגיל, מה שמרמז על כך שגרעין העדשה מתעצב מחדש כדי לגדול בגודלו היחסי ככל שהעדשה מזדקנת. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 30 עד 45 דקות לכל עדשה, אם מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב למקם את העדשה באופן שווה בתוך החריץ, ולאפשר לעדשה להירגע במתח למשך שתי דקות בין כל החלקת כיסוי נוספת.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את קשיחות הדחיסה והמורפומטריה של עדשות עכבר באמצעות יישום רציף של פתקי כיסוי. טכניקה מדויקת, פשוטה וזולה זו סוללת את הדרך לחוקרי עדשות לחקור את ההשפעות הביומכניות של מוטציות גנטיות בעכברים.

sequential-application-glass-coverslips-to-assess-compressive

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

כאן, אנו מתארים את השימוש בטומוגרפיית קוהרנטיות אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמיין מבנים ברשתית ובעין in vivo במודלים של ניוון רשתית, גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית וקוצר ראייה.

הערכות מבניות In vivo של מחלות עיניים במודלים של מכרסמים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.

מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

הפרוטוקול מתאר שיטה לחקר צמיגות מטריצה חוץ-תאית ותלותה בהרכב החלבון או בגורמים סביבתיים. מערכת המטריצה הממוקדת היא זונולה של העכבר. הביצועים של השיטה מודגמים על ידי השוואת ההתנהגות הצמיגית של סיבים זונולריים מסוג בר עם אלה חסרים מיקרופיבריל הקשורים גליקופרוטאין-1.

הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים

פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנת תאי סיבי עדשת עין היקפיים, בוגרים וגרעיניים לצביעת אימונופלואורסנציה כדי לחקור אינטרדיגיטציות מורכבות בין תאים ואת ארכיטקטורת הממברנה.

הכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של צרורות ותאי סיבים בודדים מקליפת המוח וגרעין עדשת העין

הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.

הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון

אנו מציגים שיטה אוטומטית לאפיון המודולוס האלסטי היעיל של עדשת העין באמצעות בדיקת דחיסה.

בדיקת דחיסה אוטומטית של עדשת העין

שיטה זו מדגימה ניתוח קטרקט in vivo על ידי הסרת תאי סיבי עדשה מעכברים בוגרים והשארת שקית הקופסית עם תאי אפיתל מחוברים לעדשה (LECs). תגובת הפציעה מוערכת בזמנים שונים לאחר הניתוח באמצעות קריטריונים מולקולריים ומורפולוגיים.

דוגמנות ניתוח קטרקט בעכברים

לאחרונה זיהינו התקשות נימי רשתית כפרדיגמה חדשה לתפקוד לקוי של הרשתית הקשור לסוכרת. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לבידוד נימי הרשתית של עכבר והמטריצה התת-אנדותלית מתרביות אנדותל ברשתית, ולאחר מכן תיאור של טכניקת מדידת הנוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

בידוד נימי רשתית עכבר ומטריצת תת-אנדותל למדידת נוקשות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

שיטה זו מדמיינת את המבנה הטבעי של סיבי קולגן בגוף הזגוגית באמצעות מיקרוסקופ רפלקטיבי קונפוקלי.

הכנת עיני חזיר למיקרוסקופיה רפלקטיבית קונפוקלית כדי להמחיש את רשת סיבי הקולגן הזגוגית

למדו כיצד להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות עכבר באמצעות שיטה פשוטה וזולה. טכניקה זו מאפשרת חקר תכונות ביומכניות של עדשות ויישום במודלים גדולים יותר.

יישום סדרתית של הזכוכית Coverslips להעריך את הדחיסה הנוקשת של עדשות העכבר: ניתוח זנים ואת morphometric

גלה סרטונים נוספים